王會(huì)敏　羅成　齊江姣　王元元　李村院　高劍峰

摘要：為了研究中國(guó)美利奴羊TOLL樣受體（TLR4）基因第3外顯子上的單核苷酸多態(tài)性（SNPS）和單氨基酸多態(tài)性（SAPS）。利用生物信息學(xué)方法對(duì)NCBI上公布的有關(guān)綿羊的TLR4序列進(jìn)行下載并用SeqMan對(duì)下載的綿羊TLR4基因外顯子進(jìn)行多態(tài)性比對(duì)分析，然后采用PCR-SSCP并結(jié)合測(cè)序的方法對(duì)119只中國(guó)美利奴羊TLR4基因的外顯子3的擴(kuò)增片段進(jìn)行分析。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)美利奴羊第3外顯子1 180 bp處有1個(gè)突變位點(diǎn)，由G突變成T，氨基酸由天冬氨酸（D）變成酪氨酸（Y），即該位點(diǎn)為有義突變。在1 537 bp處也有1個(gè)突變位點(diǎn)，即由G突變成了A，氨基酸由丙氨酸（A）變成蘇氨酸（T），在TLR4第3外顯子的其他位點(diǎn)并沒(méi)有SNPS位點(diǎn)，說(shuō)明中國(guó)美利奴羊TLR4基因上的第3外顯子區(qū)域有2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：中國(guó)美利奴羊；TLR4基因；多態(tài)性；生物信息學(xué)方法；PCR-SSCP；外顯子；突變位點(diǎn)

中圖分類號(hào)： S8268+62文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）21-0027-05

收稿日期：2016-06-30

基金項(xiàng)目：國(guó)家“973”計(jì)劃（編號(hào)：2010CB530200）。

作者簡(jiǎn)介：王會(huì)敏（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物基因工程。

通信作者：高劍峰，博士，教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物功能基因組學(xué)與分子免疫學(xué)。E-mail：jianfengg@shuzueducn。

Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）最早是從果蠅體內(nèi)分離得到的，它對(duì)果蠅腹背側(cè)體軸的發(fā)展方向和非特異性免疫反應(yīng)起重要的作用[1]。Medzhitov等首次在人體分離出果蠅TLR的同系物，從而發(fā)現(xiàn)人類及哺乳動(dòng)物存在一個(gè)TLR家族，它是一種重要的模式識(shí)別受體，能識(shí)別微生物的多種成分如DNA、RNA、脂多糖、脂蛋白等，從而激活非特異性和特異性免疫反應(yīng)，抵抗細(xì)菌、病毒的侵入[2]。TLR家族至少有10個(gè)TLR成員，它們分別在不同的免疫應(yīng)答機(jī)制中扮演各自的重要角色。TLR基因的多態(tài)性可以使機(jī)體對(duì)疾病的遺傳具有易感性和抗性，基因TLR位點(diǎn)多態(tài)性與炎性應(yīng)答損傷和感染性疾病的遺傳易感性相關(guān)[3-5]。TOLL樣受體4是一種Ⅰ型跨膜蛋白，包括富含半胱氨酸的胞內(nèi)區(qū)、富含亮氨酸的胞外區(qū)和跨膜區(qū)[6]。TLR4廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面，在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。目前，關(guān)于TLR4的多態(tài)主要集中在人和小鼠的研究上。例如，劉繼峰等對(duì)TLR2、TLR4基因多態(tài)性[CM（25]與尖銳濕疣患者易感性及復(fù)發(fā)性的相關(guān)性進(jìn)行研究[7]。韓璐等TLR4基因的多態(tài)性與胃癌的關(guān)系[8]。趙剛等利用 PCR-SSCP方法研究牛血液組胺濃度、TLR4基因多態(tài)性與抗蜱能力的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，B等位基因可作為婆羅門雜交牛抗蜱選育的分子標(biāo)記[9]。呂偉麗等用 PCR-SSCP 方法檢測(cè)這4 種綿羊第3外顯子的多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，白薩?？搜?、小尾寒羊和特克塞爾羊處于高度多態(tài)，而永昌羊處于中度多態(tài)[10]。鮮有關(guān)于綿羊TLR4基因的多態(tài)性與疾病關(guān)聯(lián)的報(bào)道。中國(guó)美利奴綿羊是新疆綿羊毛肉兼用細(xì)毛羊品種的一種，具有優(yōu)良的遺傳穩(wěn)定性，包括軍墾型、科爾泌型、吉林型3種類型[11]。本試驗(yàn)以中國(guó)美利奴羊?yàn)椴牧?，利用生物信息學(xué)方法對(duì)NCBI上公布的有關(guān)綿羊的TLR4序列進(jìn)行下載并用SeqMan對(duì)下載的綿羊TLR4基因外顯子進(jìn)行多態(tài)性比對(duì)分析，然后采用 PCR-SSCP技術(shù)并結(jié)合克隆測(cè)序的方法來(lái)檢測(cè)中國(guó)美利奴羊TLR4基因的多態(tài)位點(diǎn)，從而為進(jìn)一步研究標(biāo)記輔助育種、培育中國(guó)美利奴綿羊抗性新品系奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

11材料

111試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)中的119只中國(guó)美利奴羊來(lái)自新疆建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)九師第170團(tuán)，取每只試驗(yàn)羊的頸靜脈血于5 mL肝素鈉抗凝管中，放入車載冰箱里帶回實(shí)驗(yàn)室，然后放入 -40 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

112主要試劑血液基因組試劑盒、EB（核酸染料）、2×Taq PCR MasterMix、DL 2000 DNA Marker等，均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；過(guò)硫酸銨和去離子甲酰胺，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺和 TEMED，均購(gòu)自美國(guó) Am-resco公司；親和硅烷、剝離硅烷，均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。其他試劑均由實(shí)驗(yàn)室配制。

12方法

121生物信息學(xué)分析從NCBI上通過(guò)綿羊基因mRNA序列（登錄號(hào)：XM_012111214 ）下載綿羊的編碼區(qū)，并利用NCBI上的http：wwwncbinlmnihgovgene？term=CAQ378251&report=gene_table將TLR4基因的編碼區(qū)進(jìn)行外顯子的劃分。

122利用生物信息學(xué)方法對(duì)NCBI上公布的有關(guān)綿羊TLR4所有的mRNA序列進(jìn)行下載并用SeqMan軟件對(duì)下載的綿羊TLR4基因外顯子的序列進(jìn)行多態(tài)性比對(duì)分析找出位于其品種羊的多態(tài)位點(diǎn)并分析。

123基因組DNA的提取[JP3]采用血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取DNA，用紫外分光光度計(jì)估計(jì)濃度并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA濃度，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

124PCR擴(kuò)增反應(yīng)根據(jù)NCBI上公布的綿羊TLR4基因的序列（登錄號(hào)：XM_012111214 ）利用Primer Premier 50設(shè)計(jì)擴(kuò)增TLR4第3外顯子的特異性引物，引物信息見(jiàn)表1。引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

TLR4基因的第3外顯子（即表1中）的所有片段的反應(yīng)總體系都為20 μL：ddH2O 8 μL，Tap PCR MasterMix 8 μL，DNA模板20 μL，上、下引物（10 μmolL）各10 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5min；95 ℃變性1 min，72 ℃延伸 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 s；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠系統(tǒng)照相檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。endprint

125PCR-SSCP檢測(cè)和測(cè)序分析

分別取45 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與90 μL的變性上樣緩沖液（025%二甲苯菁、005%溴酚藍(lán)、95%去離子甲酰胺、pH值為80 的EDTA）離心混勻，于PCR儀上98 ℃變性10 min，然后取出立即冰浴 5 min?？焖僭陬A(yù)先制備好的10%非變性聚丙烯酰氨凝膠（90 mL 10×TTE，225 mL 40%丙烯酰胺，580 mL ddH2O，最后同時(shí)加入4500、700 μL TEMED）上點(diǎn)樣并連接至冷凝循環(huán)系統(tǒng)，9 ℃、300 V預(yù)電泳15 min，45 mA電泳5 h，結(jié)束后采用銀染色法顯色并在X光上分析帶型且拍照保存。

選擇有不同帶型樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)符合測(cè)序要求后，送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)通測(cè)序，然后用SeqMan和GenDoc等軟件對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2結(jié)果與分析

21用生物信息學(xué)對(duì)綿羊TLR4基因編碼區(qū)外顯子的劃分[HT]

TLR4基因的編碼區(qū)分為3個(gè)外顯子：外顯子1是從TLR4編碼區(qū)序列的1～90長(zhǎng)93 bp、外顯子2是從TLR4編碼區(qū)序列的91～257長(zhǎng)167 bp、外顯子3為TLR4編碼區(qū)序列的258～2 523長(zhǎng)2 266 bp（圖1）。

22不同品種綿羊TLR4基因外顯子3的生物信息學(xué)分析[HT]

用SeqMan軟件對(duì)從NCBI上下載的所有有關(guān)綿羊TLR4的mRNA序列進(jìn)行多態(tài)性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，其多態(tài)位點(diǎn)主要集中位于TLR4基因第3外顯子的316～532、530～753、821～1 066、1 093～1 370、1 382～1 634、1 867～2 098 bp之間。其中，316～532 bp 之間共有9個(gè)SNP位點(diǎn)，含有A→C、T→C的突變各2個(gè)，A→G突變4個(gè)，G→C突變1個(gè)；530～753 bp之間共有8個(gè)SNP位點(diǎn)，含有C→T、A→G、A→C的突變各2個(gè)，G→C、T→C的突變各1個(gè)；821～1 066 bp之間共有23個(gè)SNP位點(diǎn)，含有A→G突變6個(gè)，G→A突變4個(gè)、G→T突變3個(gè)，T→C、C→T突變各2個(gè)，C→A、G→C、T→A、C→G、A→T、T→CG 各1個(gè)； 1 093～1 370 bp之間共有20個(gè)SNP位點(diǎn)，

含有C→T突變6個(gè)、G→A突變5個(gè)、 A→G突變5個(gè)、G→C、G→T、A→T、C→G的突變各1個(gè)；1 382～1 634 bp之間共有11個(gè)SNP位點(diǎn)，含有T→C突變2個(gè)、G→A突變5個(gè)、A→C突變1個(gè)、C→T突變2個(gè)、A→G突變1個(gè)；1 867～2 098 bp之間共有9個(gè)SNP位點(diǎn)，其中C→A突變1個(gè)、C→T突變2個(gè)、G→A突變3個(gè)、A→G突變3個(gè)。G→C、G→T各占所有突變位點(diǎn)的5%、A→T、C→G、C→A各占所有突變位點(diǎn)的250%、T→A、T→CG各占所有突變位點(diǎn)的125%、T→C占所有突變位點(diǎn)的875%、C→T占所有突變位點(diǎn)的1750%、A→G占所有突變位點(diǎn)的2625%、A→C占所有突變點(diǎn)的625%、G→A占所有突變位點(diǎn)的2125%。從上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)看，G與A（即為轉(zhuǎn)換位點(diǎn)）之間的突變?cè)诰d羊的TLR4的第3外顯子中比較常見(jiàn)，C→T突變次之，且有1個(gè)T→CG即簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。綿羊TLR4基因第3外顯子的所有突變位點(diǎn)中既有轉(zhuǎn)換位點(diǎn)又有顛換位點(diǎn)，且轉(zhuǎn)換位點(diǎn)多于顛換位點(diǎn)?？赡苁怯捎贒NA雙螺旋結(jié)構(gòu)的差異，越是結(jié)構(gòu)相似的堿基越易相互替換。

23基因組DNA電泳圖檢測(cè)結(jié)果

提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，由圖2可見(jiàn)，電泳條帶清晰單一，可以進(jìn)行下步試驗(yàn)。

24綿羊TLR4基因第3外顯子片段的PCR擴(kuò)增[HT]

由圖3可知，綿羊TLR4基因第3外顯子TLR4（316～532）、TLR4（530～753）、TLR4（821～1 066）、TLR4（1 093～1 370）、TLR4（1 382～1 634）、TLR4（1 867～2 098）的PCR擴(kuò)增，上述序列的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)與目的片段大小一致且?guī)颓逦o(wú)雜帶符合SSCP試驗(yàn)要求。

25PCR-SSCP檢測(cè)

對(duì)綿羊TLR4基因第3外顯子的TLR4（316～532）、TLR4（530～753）、TLR4（821～1 066）、TLR4（1 093～1 370）、TLR4（1 382～1 634）、TLR4（1 867～2 098）擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP試驗(yàn)檢測(cè)，在擴(kuò)增片段中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性都為AA[CM（245]基因型（圖4-A至圖4-D）；TLR4（1 093～1 370）與

[FK（W13][TPWHM222tif]

TLR4（1 382～1 634）PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行SSCP試驗(yàn)，在擴(kuò)增產(chǎn)物片段中發(fā)現(xiàn)不同的帶型，即TLR4（1 093～1 370）有AA、AB、BB等3 種基因型TLR4（1 382～1 634）有2種基因型AA、AB（圖4-E至圖4-F）。

26綿羊TLR4第3外顯子的TLR4（1 093～1 370）與TLR4（1 382～1 634）序列的測(cè)序結(jié)果[HT]

通過(guò)測(cè)序和SeqMan軟件的比對(duì)分析（圖5至圖6）可知，在TLR4基因第3外顯子的1 180 bp處有1個(gè)突變位點(diǎn)，由G突變成T，氨基酸由天冬氨酸（D）變成酪氨酸（Y），即該位點(diǎn)為有義突變。在TLR4基因第3外顯子的1 537 bp處也有1個(gè)突變位點(diǎn)，即由G突變成了A，氨基酸由丙氨酸（A）變成蘇氨酸（T）該位點(diǎn)為有義突變。

3討論與結(jié)論

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在人TOLL樣受體的多態(tài)性方面研究得比較廣泛。Mu等發(fā)現(xiàn)，人的TLR9-1486TC和2848GA 的基因型能增加患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)[12]。吳春香等采用PCR-FLRP技術(shù)對(duì)110例AAV患者及101例健康的成人進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)TLR4-1837AG基因型影響AAV患者的血紅蛋白、endprint

[血尿發(fā)生率、血沉水平、C反應(yīng)蛋白[13]。林茂虎等用iMLDR 技術(shù)對(duì) 423 例鮑曼不動(dòng)桿菌感染病人和 385 例非感染病人的血標(biāo)本進(jìn)行 TLR4基因的多態(tài)性檢測(cè)，證明位于啟動(dòng)子區(qū)域的TLR4單倍型 GCG與鮑曼不動(dòng)桿菌感染的相關(guān)性[14]。王永堂等用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)正常漢族人群樣本TLR4啟動(dòng)子區(qū) -2 242、-1 892 和 -1 837 這 3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，證明中國(guó)漢族人群中位于TLR4基因啟動(dòng)子區(qū)的 -2 242 位點(diǎn)可能是膿毒癥關(guān)聯(lián)分析重要的遺傳標(biāo)記[15]。從以上可知，TLR4基因的多態(tài)性在人方面研究得比較成熟，但其在家畜方面研究得比較少，有待進(jìn)一步研究，TLR4基因具有SNPs的免疫基因，而基因多態(tài)性能夠與生產(chǎn)性能上的一些經(jīng)濟(jì)性狀聯(lián)系起來(lái)，為動(dòng)物遺傳育種提供一定的依據(jù)。同時(shí)，TLR基因多態(tài)性與動(dòng)物的免疫力及疾病的易感性和抗病性也有很大關(guān)聯(lián)性。綿羊是這個(gè)星球上最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的家養(yǎng)動(dòng)物之一，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)著重要的地位。羊肉蛋白質(zhì)含量高、膽固醇含量低、營(yíng)養(yǎng)豐富，是世界上很多人喜愛(ài)的食物[16]，2012年中國(guó)的出口羊肉產(chǎn)量為401萬(wàn)t，占世界的32%。優(yōu)質(zhì)羊毛是毛紡工業(yè)的重要原材料，此外綿羊也是重要的科學(xué)研究模式動(dòng)物。因此，對(duì)于選育具有優(yōu)良品種和抗性新品系的綿羊尤為重要，必須從多個(gè)方面考慮、創(chuàng)新、發(fā)現(xiàn)新的有關(guān)提高綿羊經(jīng)濟(jì)價(jià)值領(lǐng)域。在本試驗(yàn)中，將中國(guó)美利奴羊的TLR4編碼基因的第3外顯子分成7個(gè)在300 bp以下的片段，分別為TLR4（316～532）、TLR4（530～753）、TLR4（821～1 066）、TLR4（1 093～1 370）、TLR4（1 382～1 634）、TLR4（1 867～2 098）來(lái)檢測(cè)TLR4編碼基因第3外顯子在中國(guó)美利奴羊上的多態(tài)性，因?yàn)門LR4編碼基因的第3外顯子總長(zhǎng)為2 266 bp，而做SSCP試驗(yàn)DND片段總長(zhǎng)最好在 300 bp 以下，這樣檢測(cè)到目的DNA片段多態(tài)性的靈敏度才高[17]。對(duì)以上TLR4編碼基因的7個(gè)片段進(jìn)行多態(tài)檢測(cè)，除TLR4（1 093～1 370）與TLR4（1 382～1 634）片段中各有1個(gè)有義突變外，其他片段都沒(méi)有多態(tài)，這種現(xiàn)象可能是因?yàn)橹袊?guó)美利奴羊TLR4基因在所檢測(cè)的區(qū)域是比較保守的，由此也可得出中國(guó)美利奴羊具有多態(tài)位點(diǎn)的改變。有關(guān)更多的突變基因可能位于中國(guó)美利奴羊TLR4基因的其他外顯子或啟動(dòng)子區(qū)、調(diào)控區(qū)域，還有可能是檢測(cè)樣本量和羊所選地區(qū)偏少導(dǎo)致的。因此，須要擴(kuò)大樣本的數(shù)量和對(duì)多個(gè)地區(qū)的中國(guó)美利奴羊進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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