于沛沛，屠玥之，許艷順，姜啟興，王斌，楊方，夏文水

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

渥堆發(fā)酵牛蒡茶工藝條件的研究

于沛沛，屠玥之，許艷順，姜啟興，王斌，楊方，夏文水*

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

對發(fā)酵牛蒡茶渥堆發(fā)酵工藝條件進(jìn)行探究，以可溶性糖和總黃酮為特色指標(biāo)，研究發(fā)酵量、水分含量、溫度、時間、接種量對發(fā)酵工藝的影響，通過單因素和正交優(yōu)化試驗確定了最優(yōu)發(fā)酵工藝。結(jié)果表明：最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵量為1 000 g，含水量為40%，溫度60℃，接種量3.5%，渥堆發(fā)酵時間21 d，正交試驗中4個因素對綜合評分的影響依次為含水量＞溫度＞接種量＞時間。

渥堆發(fā)酵；牛蒡茶；發(fā)酵工藝

牛蒡是一種富含多種營養(yǎng)成分與生物活性成分的藥食兩用的高檔蔬菜，目前已有多種牛蒡相關(guān)產(chǎn)品被開發(fā)，尤以牛蒡茶品居多，但是現(xiàn)有牛蒡茶品一般由牛蒡茶片簡易風(fēng)干或者烘烤制成，存在質(zhì)量隱患，并且由于烘烤溫度較高，其營養(yǎng)物質(zhì)容易流失，不利于牛蒡在日常飲食中發(fā)揮其營養(yǎng)功能作用，同時牛蒡茶口感發(fā)澀，淡而無味，無法完全消費者的口感需求。本論文利用接入黑曲霉定向人工發(fā)酵處理渥堆發(fā)酵，控制其發(fā)酵進(jìn)程，縮短發(fā)酵周期，豐富了營養(yǎng)功效成分，并且使沖泡出來的溶液更為透明澄清，顏色更加誘人并具有牛蒡發(fā)酵茶獨特的風(fēng)味，在口感上滿足消費者的需求。為牛蒡資源的深度開發(fā)提供了一種新思路與理論依據(jù)[1]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮牛蒡（食品級）：市售；烘烤牛蒡茶（食品級）：天益食品（徐州）有限公司；黑曲霉CICC2169菌株：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、水合茚三酮、鄰苯二酚、聚乙烯吡咯烷酮（分析純）：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

UV-1000紫外可見分光光度計：上海天美科學(xué)儀器有限公司；FW80高速全能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；LPH-50生化培養(yǎng)箱、PHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海-恒科技儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉菌液的制備

以牛蒡粉為碳源，添加量為35 g/L，氮源選擇蛋白胨20 g/L，添加NaCl 5 g/L，ZnSO40.5 g/L時用醋酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值為6.0，接種量為18 g/L在35℃下以200 r/min的搖瓶轉(zhuǎn)速培養(yǎng)4 d后制成黑曲霉種子液，用作后續(xù)發(fā)酵牛蒡茶的人工接種的試驗菌株。

1.2.2 發(fā)酵牛蒡茶的工藝流程

1.2.3 單因素試驗

控制牛蒡樣品品質(zhì)和環(huán)境濕度為不變因素，對發(fā)酵條件中的水分含量、黑曲霉接種量、發(fā)酵量、溫度及時間分別進(jìn)行單因素試驗，單因素每個變量設(shè)置4到5個水平，分析發(fā)酵牛蒡茶的功能性成分指標(biāo)（包括總黃酮和可溶性糖）含量，具體如下。

1.2.3.1 發(fā)酵量對牛蒡茶渥堆發(fā)酵的影響

分別控制 250、500、1 000、1 500、2 000，為不同裝樣量，整個發(fā)酵堆控制含水量在40%，初始溫度為50℃，渥堆發(fā)酵時間選擇在20 d，接種量為2%。

1.2.3.2 含水量對牛蒡茶渥堆發(fā)酵的影響

分別控制15%、25%、30%、40%、50%為不同接種量，控制整個發(fā)酵堆的裝罐量在1 000 g，初始溫度為50℃，渥堆發(fā)酵時間選擇在20 d，接種量為2%。

1.2.3.3 溫度對牛蒡茶渥堆發(fā)酵的影響

分別控制 30、40、50、60、70 ℃為不同溫度，控制整個發(fā)酵堆的裝罐量在1 000 g，整個發(fā)酵堆控制含水量在40%，渥堆發(fā)酵時間選擇在20 d，接種量為2%。

1.2.3.4 接種量對牛蒡茶渥堆發(fā)酵的影響

分別控制 0%、1%、2%、3%、4%、5%為不同接種量，控制整個發(fā)酵堆的裝罐量在1 000 g，初始溫度為50℃，渥堆發(fā)酵時間選擇在20 d。

1.2.3.5 發(fā)酵時間

控制 14、16、18、20、22、24 d 為不同發(fā)酵時間，控制整個發(fā)酵堆的裝罐量在1 000 g，含水量為40%，初始溫度為50℃，接種量為2%。

1.2.4 正交優(yōu)化試驗

按照單因素試驗結(jié)果，以不同含水量（A）、溫度（B）、時間（C）、接種量（D）條件做L9（34）試驗，以牛蒡中含有的可溶性糖含量和總黃酮含量為指標(biāo)進(jìn)行綜合評價，確定最佳渥堆發(fā)酵牛蒡茶正交水平因素表，見表1。

綜合分=牛蒡中可溶性糖隸屬度×0.5+總黃酮隸屬度×0.5

表1 發(fā)酵牛蒡茶渥堆發(fā)酵正交水平因素表Table 1 The orthogonal horizontal factor table of fermentation burdock tea

可溶性糖含量的測定：蒽酮比色法，參照NY/T 1278-2007《蔬菜及其制品中可溶性糖的測定銅還原碘量法》。

總黃酮含量的測定：牛蒡中總黃酮含量的測定根據(jù)NY/T 2010-2011《柑橘類水果及制品中總黃酮含量的測定》的方法做進(jìn)一步改進(jìn)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，精確吸取1.0 mL溶液放于10 mL的容量瓶中，同時根據(jù)標(biāo)曲的繪制，對樣品的吸光度進(jìn)行測定并帶入方程后，計算得出牛蒡中的黃酮類物質(zhì)含量[2]。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵牛蒡茶發(fā)酵工藝參數(shù)的確定

2.1.1 渥堆發(fā)酵工藝條件的單因素試驗

2.1.1.1 不同發(fā)酵量對渥堆發(fā)酵牛蒡茶活性成分的影響

不同發(fā)酵量對牛蒡茶中可溶性糖和總黃酮含量的影響見圖1。

圖1 不同發(fā)酵量對牛蒡茶中可溶性糖和總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of sample loading capacity on the soluble sugar and total flavonoids in burdock tea

當(dāng)發(fā)酵量較高時，可溶性糖和總黃酮的含量前期隨著裝樣量的上升而升高，由于發(fā)酵量的上升，微生物繁殖旺盛，在生化反應(yīng)過程中可以將大分子化合物分解成可溶性糖，同時在纖維素酶等一系列酶的生化作用下加快了牛蒡中黃酮類物質(zhì)的析出[3]，在1 000 g下各種成分的組分達(dá)到一個最適宜的狀態(tài)，所以后續(xù)渥堆發(fā)酵過程中選擇1 000 g發(fā)酵量進(jìn)行發(fā)酵。

2.1.1.2 不同水分含量對渥堆發(fā)酵牛蒡茶活性成分的影響

不同水分含量對牛蒡茶中可溶性糖和總黃酮含量的影響見圖2。

圖2 不同水分含量對牛蒡茶中可溶性糖和總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of on the moisture on the soluble sugar and total flavonoids in burdock tea

初始潮水量的增加可以加快微生物的繁殖和一系列生化反應(yīng)的進(jìn)行，后期由于水分含量的過度上升時會導(dǎo)致厭氧細(xì)菌的大量滋生，同時茶片也會變軟，外形的感官質(zhì)量也會隨之下降，所以應(yīng)選擇適宜的水分含量進(jìn)行渥堆發(fā)酵。含水量增加使黑曲霉產(chǎn)菊粉酶活性增加，可以分解菊粉產(chǎn)生一些小分子果糖導(dǎo)致可溶性糖含量增加，合適的水分含量不僅有利于黑曲霉的穩(wěn)定生長，同時也有利于酵母菌的生長，酵母菌可以在厭氧環(huán)境下將大分子糖分解成可溶性糖，同時總黃酮含量也呈現(xiàn)出上升趨勢。綜上，相對過高和過低的水分含量對于渥堆發(fā)酵過程中微生物的生長繁殖都有消極影響，因此選擇30%～40%作為水分含量的單因素考察指標(biāo)[4]。

2.1.1.3 不同溫度對渥堆發(fā)酵牛蒡茶活性成分的影響

不同溫度對牛蒡茶中可溶性糖和總黃酮含量的影響見圖3。

從圖3中可以看出，隨著溫度逐漸升高，微生物在相對適宜的條件下繁殖迅速，酶活力也達(dá)到最大，所以在相對高溫高濕的環(huán)境下，微生物的生長旺盛，對于將大分子碳水化合物分解成可溶性糖和黃酮類活性物質(zhì)的增加是有利的，另一方面如果發(fā)酵牛蒡茶的中心溫度不夠高，會導(dǎo)致微生物活動不劇烈，會使得發(fā)酵程度不十分明顯，另一方面，溫度太高會導(dǎo)致渥堆發(fā)酵中水分蒸發(fā)含量嚴(yán)重下降，同樣不利于發(fā)酵的進(jìn)行，所以，單因素條件下選擇50℃～60℃作為適合溫度的考量[5-7]。

圖3 不同溫度對牛蒡茶中可溶性糖和總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of temperature on the soluble sugar and total flavonoids in burdock tea

2.1.1.4 不同接種量對渥堆發(fā)酵牛蒡茶中活性成分的影響

不同接種量對牛蒡茶中可溶性糖和總黃酮含量的影響見圖4。

圖4 不同接種量對牛蒡茶中可溶性糖和總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of inoculum on the soluble sugar and total flavonoids in burdock tea

從圖4中可以看出，隨著接種量的增多，微生物發(fā)生了一系列的生化反應(yīng)以及酶促反應(yīng)激烈，可溶性糖含量隨著接種量的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，可以認(rèn)為是由于接種量的增多帶來了生化反應(yīng)的劇烈，酶活力也隨之增加，可以將大分子糖分解成可溶性糖，后期進(jìn)入一個平緩期，是由于微生物自身也需要一些消耗成糖類物質(zhì)[8-9]。同時黃酮類物質(zhì)在后期由于發(fā)生氧化、聚合、偶聯(lián)等反應(yīng)生成其他的有色類物質(zhì)，構(gòu)成了牛蒡茶湯色紅亮的原因，黃酮類物質(zhì)的氧化也是有利于后期發(fā)酵牛蒡茶滋味的形成。綜合考量，微生物的接種量不宜過高，接種量太高會導(dǎo)致外觀上的不美觀，掛滿白霜不有利于產(chǎn)品的擴(kuò)大化生產(chǎn)，并且接種量過高時功能性成分并沒有顯著增加，而微生物含量過低時渥堆發(fā)酵程不明顯，發(fā)酵效果不好，所以選擇2.5%～3.5%作為單因素區(qū)間進(jìn)行考量[10-11]。

2.1.1.5 不同發(fā)酵時間對渥堆發(fā)酵中牛蒡活性成分的影響

不同發(fā)酵時間對牛蒡茶中可溶性糖和總黃酮含量的影響見圖5。

圖5 不同發(fā)酵時間對牛蒡茶中可溶性糖和總黃酮含量的影響Fig.5 Effect of time on the soluble sugar and total flavonoids in burdock tea

在發(fā)酵的前期過程中，微生物產(chǎn)生的酶類物質(zhì)將大分子糖水解成可溶性糖，可溶性糖含量呈現(xiàn)出明顯上升的趨勢，隨著時間的繼續(xù)增加，游離氨基酸的分解速率會大于前期蛋白質(zhì)合成氨基酸的速率，所以游離氨基酸的變化趨勢呈現(xiàn)出一個相對平緩的趨勢[12-13]。隨著時間的延長，微生物的生長繁殖需要消耗掉一部分營養(yǎng)物質(zhì)且生長速率也在放緩，活性物質(zhì)的含量變化均進(jìn)入一個相對平緩的時期，后期如果產(chǎn)品發(fā)酵時間過久，產(chǎn)品容易變軟影響質(zhì)構(gòu)和口感，所以應(yīng)選擇20 d～22 d作為單因素最優(yōu)時間考慮。

2.1.2 正交優(yōu)化試驗結(jié)果

通過單因素試驗，選擇含水量、溫度、接種量、時間4個單因素試驗設(shè)計正交試驗L9（34）正交表，結(jié)果見表2和表3。

由表2和表3能夠看出，綜合可溶性糖含量和總黃酮含量比較其功能性成分，其最適渥堆反應(yīng)條件：裝樣量為1 000 g時在含水量為40%，溫度60℃條件下，接種量為3.5%時渥堆發(fā)酵21 d，可以達(dá)到最佳發(fā)酵條件。4個影響因素中可以看出含水量的影響程度最大，同時溫度和接種量也對渥堆發(fā)酵的有一定程度的影響，時間的影響是最為不顯著的。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The result of orthogonal test and range analysis

表3 結(jié)果方差分析Table 3 The result of analysis of Variance

對上述結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析，在顯著水平α=0.05下，可知F0.05（2，2）=19.00，顯然在顯著水平0.05上，可知含水量，溫度對結(jié)果有顯著影響，而在F0.01（2，2）=99，對于渥堆發(fā)酵而言含水量有非常顯著的影響。

2.2 正交試驗驗證分析

驗證正交中方案最優(yōu)結(jié)果有效性，見表4。

表4 正交驗證試驗表Table 4 The table of orthogonal test

4種不同條件下的中總黃酮和可溶性糖含量見圖6。

圖6 4種不同條件下的中總黃酮和可溶性糖含量Fig.6 The contents of total flavonoids and soluble sugar in 4 different conditions

對正交得到最佳方案與正交表中的最優(yōu)6號方案同時結(jié)合自然渥堆發(fā)酵和未發(fā)酵的牛蒡茶方案進(jìn)行橫向比較分析，正交得到的最佳方案比較正交表中6號試驗結(jié)果高，最優(yōu)方案中牛蒡中可溶性糖和總黃酮含量較自然渥堆發(fā)酵的含量均有一定程度的提高，因此最佳方案能夠明顯提高牛蒡根部中的生物活性成分含量，并能夠在牛蒡根部的一些普通營養(yǎng)成分消耗比較低的前提條件下顯著提高了牛蒡根部的食用價值。

3 結(jié)論

本文對發(fā)酵牛蒡茶渥堆發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了探究，以可溶性糖和總黃酮為特色指標(biāo)，研究了發(fā)酵量，水分含量、溫度、時間、接種量對發(fā)酵工藝的影響，通過單因素和正交優(yōu)化試驗確定了發(fā)酵工藝，結(jié)果表明：在裝樣量為1 000 g時在含水量為40%，溫度60℃條件，接種量為3.5%，渥堆發(fā)酵21 d時，正交試驗中4個因素對綜合評分的影響依次為含水量＞溫度＞接種量＞時間。對于渥堆發(fā)酵而言，在顯著水平0.05上，F(xiàn)0.05（2，2）=19.00，可知含水量，溫度，接種量對結(jié)果有顯著影響，而在F0.01（2，2）=99，對于渥堆發(fā)酵而言含水量有非常顯著的影響。

[1]Kim KY,Ralph Schumaeher H,Hunsche E,et al.A literature review of the epidemiology and treatment of acute gout[J].Food cheinstry,2003,25(2):1593-1617

[2]任常勝,朱慶玲.牛蒡子的研究概況[J].中國民族醫(yī)藥雜志,2003(12):36-29

[3]Arromdee E,Michet CJ,Crowson CS,et al.Epidemiology of gout:Is the incidence rising[J].Rheumatol,2002,29(3):2403-2406

[4]Schlesinger N.Dietary factors and hyperuricaemia[J].CurrPharm Des,2005,11(32):4133-4138

[5]張美莉.萌發(fā)蕎麥種子內(nèi)黃酮與蛋白質(zhì)的動態(tài)變化及抗氧化性研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2004

[6]Lou Z,Wang H,Zhu S,et al.Improved extraction and identification by ultra performance liquid chromatography talldem mass spectrometry of phellolic compounds in burdock leaves[J].Joumal of Chromatography A,2012,34(17):2441-2446

[7]高新樓,李曉青,韓燕麗.牛蒡的營養(yǎng)保健功能與加工利用[J].食物與營養(yǎng),2005,12(2):43-44

[8]Lou Z,Wang H,Lv w,et al.Assessment of antibaCterial Activity of fractions from burdock leaf against Food-related bacterial[J].Food Control,2011,46(2):1272-1278

[9]魏安池,代紅麗,周瑞寶.56種植物原料抗氧化性能研究[J].糧食與油脂,2003(7):11-12

[10]趙華,王勁,楊松松.藥用植物牛蒡化學(xué)成分和藥理活性研究述要[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2005,7(2):128-129

[11]謝舜珍.局限青霉生淀粉水解酶的產(chǎn)生條件及酶一般性質(zhì)的研究[J].微生物學(xué)報,1994,34(3):263-238

[12]李晨晨,呂杰,楊瑞娟.普洱茶渥堆發(fā)酵過程中嗜熱細(xì)菌的分離和鑒定[J].北京化工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2012,39(2):74-78

[13]譚和平,周李華,錢杉杉.茶葉發(fā)酵中的酶學(xué)研究進(jìn)展[J].中國測試,2009,35(1):19-23

Study on the Technological Conditions of Pile Fermented Burdock Tea

YU Pei-pei，TU Yue-zhi，XU Yan-shun，JIANG Qi-xing，WANG Bin，YANG Fang，XIA Wen-shui*
（College of Food Science&Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

The pile-fermentation conditions of burdock tea were explored in this article.The effect of the fermentation content，moisture content，temperature，time and inoculum on the fermentation technology was studied，based on the soluble sugar and total flavonoids as characteristic indexes.Furthermore，the optimal fermentation process was determined by single factor and orthogonal optimization test.The optimum fermentation conditions were as follows：the fermentation content was 1 000 g，water content was 40%，the temperature was 60℃，inoculum was 3.5%，and pile-fermentation time was 21 d.The influence of four factors on the comprehensive score in the orthogonal test was as follows：moisture content＞temperature＞inoculum ＞ time.

pile fermented；burdock tea；fermentation process

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.016

江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心資助項目

于沛沛（1983—），女（漢），實驗師，碩士，研究方向：食品加工與配料。

*通信作者：夏文水（1958—），男，教授，博士生導(dǎo)師。

2017-07-27