李卓，張亞鋒，李榮，董曼曼，賈寒冰

（西安市食品藥品檢驗所，陜西西安710054）

HPLC測定小米中非法添加姜黃素及不確定度分析

李卓，張亞鋒，李榮，董曼曼，賈寒冰

（西安市食品藥品檢驗所，陜西西安710054）

采用高效液相色譜法（HPLC）對小米中非法染色姜黃素進行定性定量測定，并對其不確定度進行分析。以乙腈-4%冰乙酸（45+55）為流動相，流速1.0 mL/min，經(jīng)C18柱分析，檢測波長425 nm。采用外標(biāo)法定量，姜黃素在0.585 μg/mL～4.88 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 9，平均回收率92%，檢出限為0.08 mg/kg，整個試驗的合成不確定度為1.937%，擴展不確定度為X=（7.15±0.29）mg/kg；k=2。本方法操作簡單，重復(fù)性好，檢出限低，可用于小米中姜黃素非法染色的測定。

高效液相色譜法（HPLC）；姜黃素；小米；不確定度

姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃、莪術(shù)等根莖中提取的一種有效成分，是一種二酮、二羥基，帶有共軛苯環(huán)和雙鍵結(jié)構(gòu)的天然黃色素[1]。在GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定姜黃和姜黃素可作為著色劑在部分食品中添加并有相應(yīng)的限量要求，但在小米中沒有明確規(guī)定[2]，應(yīng)不得使用。但有些不法商販為了掩蓋陳小米或小米輕度發(fā)霉現(xiàn)象，將小米漂洗后加入姜黃粉或姜黃素進行再加工，使色暗的陳小米變得顏色鮮黃誘人，充當(dāng)新小米進行售賣，長期食用這種小米對人體健康有害無益?，F(xiàn)姜黃素檢測方法主要有高效液相色譜法[3-5]、液質(zhì)聯(lián)用法[6]、薄層色譜法[7]等，尚未有小米非法染色姜黃素的檢測方法。

本文通過優(yōu)化檢測波長、流動相、樣品提取等檢測條件，建立了一種小米中非法染色姜黃素的高效液相色譜測定方法，做了方法學(xué)考察，并采用JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[8]對試驗過程中的不確定度分量進行了分析，找出影響結(jié)果的因素，為結(jié)果準(zhǔn)確性，可靠性提供真實、有效的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米：市售；姜黃素（批號0823-9802）：中國食品藥品檢定院；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Ulimate 3000型高效液相色譜儀（配DAD檢測器）：美國Thermo公司；MS105電子分析天平、ME204E電子分析天平：瑞士Mettler公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取1.95 mg姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成195 μg/mL姜黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。移取1 mL姜黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于10 mL容量瓶，用甲醇定容，制成姜黃素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。再移取 0.3、0.5、1、2、2.5 mL 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)中間液于10 mL容量瓶，用甲醇定容，制成0.585、0.975、1.95、3.90、4.88 μg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品制備

稱取粉碎均勻的樣品5.00 g于100 mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇20 mL，超聲提取10 min，放置至室溫，搖勻后，用0.45 μm有機系濾膜過濾于棕色樣品瓶中，待測。

1.3.3 色譜條件

流動相：乙腈+4%冰乙酸=45+55；色譜柱：Agela，C184.6 mm×250 mm，5 μm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：425 nm；進樣體積：10 μL。

1.4 結(jié)果計算

式中：X為姜黃素的含量，mg/kg；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品溶液中姜黃素的濃度，μg/mL；m為樣品的質(zhì)量，g；V 為甲醇加入體積，mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

姜黃素光譜圖見圖1。

圖1 姜黃素光譜圖Fig.1 Spectrum of curcumin

如圖1所示，采用二極管陣列檢測器在190 nm～800 nm波長下對姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行掃描，結(jié)果顯示姜黃素在425 nm處有最大吸收峰，為了使其靈敏度最佳，選擇425 nm為檢測波長。

2.1.2 流動相的選擇

姜黃素具有兩個羥基，羥基氫易解離，在流動相中加入一定量酸可以抑制姜黃素的解離，以改善其在C18柱中的保留及峰型。本試驗比較了乙腈-水、乙腈-1%磷酸、乙腈-0.1%冰乙酸、乙腈-4%冰乙酸4個體系的流動相，結(jié)果表明，在乙腈-水、乙腈-1%磷酸、乙腈-0.1%冰乙酸流動相體系下，姜黃素目標(biāo)峰都有不同程度的拖尾現(xiàn)象，而以乙腈-4%冰乙酸體系為流動相，目標(biāo)峰峰型對稱效果好，故選擇乙腈-4%冰乙酸為流動相。圖2、圖3為姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品及樣品溶液色譜圖。

圖2 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 Chromatogram of curcumin

圖3 樣品中姜黃素色譜圖Fig.3 Chromatogram of sample

2.1.3 提取溶劑的選擇

姜黃素極性較小，不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、冰乙酸等試劑中[9]。本試驗比較了甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、冰乙酸、70%冰乙酸5種提取溶劑，結(jié)果如圖4。

圖4 不同溶劑提取率Fig.4 Different solvent extraction rate

由圖4可知，提取率由大至小依次為：甲醇＞冰醋酸＞無水乙醇＞乙酸乙酯＞70%冰醋酸，甲醇的提取率最高，故選擇甲醇為提取溶劑。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取1.3.1項下姜黃素系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在本試驗所選色譜條件下測定，以姜黃素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.890 7x-0.029 4，相關(guān)系數(shù)為r2=0.999 9，結(jié)果表明，姜黃素在0.585 μg/mL～4.88 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.2 回收率與重復(fù)性

取陰性小米樣品，分別添加了3個水平濃度，每個水平添加3個平行，按照本試驗的方法測定姜黃素質(zhì)量濃度，加標(biāo)回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表1。由結(jié)果可以看出，該方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

表1 回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Recovery and relative standard deviation

2.2.3 穩(wěn)定性

由于姜黃素分子結(jié)構(gòu)中含有共軛雙鍵，易在光與熱作用下發(fā)生氧化降解[10]，故應(yīng)將提取溶液過濾后貯存于棕色樣品瓶中，在室溫下放置 0、3、6、12、24、48 h進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素在0～24 h內(nèi)比較穩(wěn)定，24 h時后有小幅度下降，說明處理好的樣品應(yīng)盡快測定，不宜放置過久。

圖5 姜黃素穩(wěn)定性Fig.5 Stability of curcumin

2.2.4 檢出限與定量限

在本試驗所選色譜條件下，用空白樣品溶液稀釋姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液至10倍信噪比、3倍信噪比，結(jié)果10S/N時姜黃素質(zhì)量濃度為0.06 μg/mL，3S/N時姜黃素質(zhì)量濃度為0.02 μg/mL，經(jīng)計算，姜黃素定量限為0.24 mg/kg，檢出限為 0.08 mg/kg。

2.3 不確定度分析

2.3.1 A類不確定度

2.3.1.1 樣品的重復(fù)性引入的不確定度

在重復(fù)條件下，對樣品進行了6次測定，含量分別是 7.15、7.20、7.22、7.13、7.22、7.20 mg/kg， 平 均 值 為7.19 mg/kg，則由樣品重復(fù)性引入的相對不確定度為：

2.3.1.2 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品濃度引入的不確定度

采用了5個水平的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進行1次測定，以相應(yīng)的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度用最小二乘法進行擬合，結(jié)果如表2。

表2 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Table 2 Uncertainty resulting from least square curve fitting

擬合曲線求樣品溶液中姜黃素引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：s為殘余標(biāo)準(zhǔn)差s=0.023 372；Scc為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度殘差和Scc=13.910 93；C為樣品溶液的質(zhì)量濃度C=1.786 4；為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的平均質(zhì)量濃度=2.458；a為回歸方程斜率a=0.890 7；N為樣品平行測定次數(shù)N=2；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液測定次數(shù)n=5。

2.3.2 B類不確定度

2.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息中并未給出不確定度，故暫忽略不計。

2.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度

由檢定證書查得，該電子天平在0≤m≤50 g范圍示值誤差為為±0.03 mg，稱取標(biāo)準(zhǔn)品1.95 mg，按矩形分布，則由稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容及稀釋過程引入的不確定度

按照1.3.1配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的不確定度主要包括移液管、容量瓶以及溫度效應(yīng)。其中移液管和容量瓶根據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[12]，按矩形分布計算。溫度效應(yīng)由于溫度變化引起液體體積變化明顯大于容量瓶體積的變化，所以溫度變化帶來的不確定度只考慮液體體積帶來的不確定度，已知甲醇的體積膨脹系數(shù)為1.2×10-3，實驗室室溫在±2℃之間變動，按照矩形分布計算，引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度如表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引入的相對不確定度Table 3 Uncertainty during standard solution dilution

由表3中數(shù)據(jù)合成，配制姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下：

2.3.2.4 樣品稱量引入的不確定度

由檢定證書查得，該電子天平在0≤m≤50 g范圍示值誤差為±0.000 1 g，稱取樣品5.00 g，按矩形分布，則由樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2.5 樣品提取劑加入量引入的不確定度

樣品中精密加入甲醇20 mL，與2.3.2.2同理，20 mL A類單標(biāo)吸量管容量允差為±0.030 mL，溫度在±2℃之間變動，引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴展不確定度的計算

3 結(jié)論

本文建立了HPLC測定小米中非法染色姜黃素的方法，優(yōu)化了色譜條件，方法操作簡單，且具有較好的準(zhǔn)確度和重復(fù)性，可為非法添加物質(zhì)測定提供一定參考。另外，對該方法進行了不確定度分析，分析了各個影響結(jié)果的分量，發(fā)現(xiàn)在不確定因素5個分量中，對結(jié)果影響最大的主要為標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液曲線擬合求濃度。針對這些不確定度因素，在實際檢測過程中可通過選擇適當(dāng)量器、增加標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的測定次數(shù)、增大標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量等措施減小測量結(jié)果的不確定度，提高測量結(jié)果的可信度。

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Detection of Curcumin Illegally Added in Millet by HPLC and Uncertainty Analysis

LI Zhuo，ZHANG Ya-feng，LI Rong，DONG Man-man，JIA Han-bing
（Xi'an Institute for Food and Drug Control，Xi'an 710054，Shaanxi，China）

High performance liquid chromatography（HPLC）was used to qualitatively and quantitatively determine curcumin in millet and its uncertainty was analyzed.Acetonitrile-4%acetic acid（45+55）solution was used as the mobile phase，and 1.0 mL/min as the flow rate，and C18as the analysis column.Good linear relationship was obtained in the concentration range of 0.585 μg/mL-4.88 μg/mL of curumin，with correlation coefficient of 0.999 9.Under the optimized conditions，the average recoveries were 92%.The limit of detection（S/N=3）of curcumin was 0.08 mg/kg.The combined uncertaincy was 1.937%and the expanded uncertainty was X=（7.15±0.29）mg/kg；k=2.The method was sample，reproducible，low detection limit，and can be used to determine the illegal staining of curcumin in millet.

high performance liquid chromatography（HPLC）；curcumin；millet；uncertainty

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.034

李卓（1984—），女（漢），工程師，碩士研究生，主要從事食品安全檢測方向。

2017-04-06