方軍，林晨，張志軍，王李平，熊娟，陳敏兒

（中國(guó)廣州分析測(cè)試中心，廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510070）

實(shí)時(shí)熒光PCR法在魚(yú)翅鑒別中的應(yīng)用

方軍，林晨，張志軍，王李平，熊娟，陳敏兒

（中國(guó)廣州分析測(cè)試中心，廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510070）

為有效鑒別市售魚(yú)翅的真?zhèn)?，針?duì)魚(yú)翅中鯊魚(yú)源性成分的線粒體基因組的部分序列，利用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)，通過(guò)特異性引物和探針的設(shè)計(jì)建立起一種有效的真?zhèn)舞b別方法。該方法中對(duì)樣品脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）的提取方法、DNA檢測(cè)的濃度靈敏度、質(zhì)量靈敏度以及方法的特異性進(jìn)行研究。結(jié)果表明魚(yú)翅樣品用試劑盒進(jìn)行提取效果良好，其檢測(cè)的DNA濃度靈敏度可達(dá)1×10-5ng/μL，質(zhì)量靈敏度可達(dá)0.01%。利用該方法對(duì)市場(chǎng)上的購(gòu)買(mǎi)的47份魚(yú)翅類(lèi)樣品和18份非魚(yú)翅樣品進(jìn)行了檢測(cè)，43樣品檢測(cè)出鯊魚(yú)成分，包括4份仿魚(yú)翅在內(nèi)的22份未檢出鯊魚(yú)成分。

魚(yú)翅；實(shí)時(shí)熒光PCR；靈敏度；特異性；鑒別

魚(yú)翅，又稱(chēng)鮫鯊翅、鯊魚(yú)翅，是一種由軟骨魚(yú)系鯊魚(yú)或犁頭鰩經(jīng)加工而制作的產(chǎn)品，主要以鰭中的軟骨（又稱(chēng)翅筋）供食，主要包括背鰭、胸鰭、尾鰭、腹鰭等。魚(yú)翅制作工藝復(fù)雜，包括去沙、漂白、脫皮和去骨等多種工序。由于原料數(shù)量有限[1]，且魚(yú)翅富含膠原蛋白[2]，價(jià)格昂貴，尤其是在東南亞市場(chǎng)，屬高端消費(fèi)品。隨著人們生活水平的不斷提高，對(duì)魚(yú)翅的消費(fèi)需求量越來(lái)越大。由于我國(guó)相關(guān)法規(guī)的不完善，許多不法分子趁虛而入，選用明膠、海藻酸鈉為主要原料，研制出仿真魚(yú)翅，其在外觀和口感上和真魚(yú)翅類(lèi)似，很難辨認(rèn)。近年來(lái)，市場(chǎng)上出現(xiàn)大量的仿真魚(yú)翅[3]，擾亂市場(chǎng)秩序，極大的損害消費(fèi)者的權(quán)益。

為辨別魚(yú)翅的真?zhèn)?，保障消費(fèi)者的權(quán)益，研究人員已開(kāi)發(fā)出多種鑒別魚(yú)翅真?zhèn)蔚姆椒╗4-11]，如郭云霞等[5]建立利用感官技術(shù)和普通PCR技術(shù)鑒別真?zhèn)蔚姆椒ǎ滞窳岬萚6]用熱脹冷縮的方法鑒別真?zhèn)?，冼燕萍等[7]用掃描電鏡鑒別真?zhèn)?，韓婉清等[8]發(fā)展紅外光譜鑒別魚(yú)翅真?zhèn)蔚募夹g(shù)。PCR作為檢測(cè)遺傳信息載體DNA的一種新方法，具有操作簡(jiǎn)單、特異性好、靈敏度高的特性，廣泛用于物種鑒定和生物體的真?zhèn)舞b別[9-24]，國(guó)內(nèi)也有大量文獻(xiàn)報(bào)道利用PCR技術(shù)鑒別鯊魚(yú)源性成分的方法[12-15]，如覃芳芳等[12]、郭云霞等[13]使用普通PCR技術(shù)鑒別鯊魚(yú)源性成分，建立相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)作為一種在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新的技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)全程采用的是閉管式檢測(cè)，不需PCR后處理，克服普通PCR假陽(yáng)性問(wèn)題和交叉污染，靈敏度高，特異性強(qiáng)，無(wú)需電泳，簡(jiǎn)單快速[10]，郭云霞等[14]建立SYBR Green熒光PCR技術(shù)鑒別鯊魚(yú)源性成分的方法。王德蓮等[16]利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)成功地鑒別了魚(yú)翅制品中的鯊魚(yú)源性成分。但是熒光染色PCR法由于產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物較多，容易導(dǎo)致高背景和假陽(yáng)性，使其應(yīng)用受到了一定程度的限制。

細(xì)胞中的線粒體基因特異性較強(qiáng)，具有潛在靶基因的優(yōu)勢(shì)[11，17]。本研究根據(jù)鯊魚(yú)綱在細(xì)胞色素氧化酶序列，設(shè)計(jì)出特異性引物和探針，建立了實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)鑒別魚(yú)翅真?zhèn)蔚男路椒ǎ囼?yàn)結(jié)果優(yōu)于文獻(xiàn)[15]的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售47份魚(yú)翅樣品，包括29份魚(yú)翅干制品（明翅）、8份未加工的干魚(yú)翅（生翅），4份泡發(fā)魚(yú)翅，2份凍干魚(yú)翅（明翅），4份仿魚(yú)翅類(lèi)樣品：廣州市海味干果行業(yè)商會(huì)；鱈魚(yú)、石斑魚(yú)、魷魚(yú)、秋刀魚(yú)、帶魚(yú)、金鯧魚(yú)、黃魚(yú)、平菇、花生、海帶、玉米、冬瓜、土豆、紅薯、黃豆、雞、鴨、羅非魚(yú)：市售。DNA提取試劑盒：廣州迪澳生物科技有限公司；魚(yú)翅引物（COI-F、COI-R）：生工生物工程（上海）有限公司；TaqMan探針：Invitrogen公司；PCR預(yù)混合溶液（PCR-mix）：天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7500熒光定量PCR儀：美國(guó)Applied Biosystems公司；PICO17高速臺(tái)式離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

選取細(xì)胞色素氧化酶COI基因?yàn)轸~(yú)翅的特異基因，利用Vector NTI軟件對(duì)查到的各序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明COI基因具有一定的保守性，并通過(guò)軟件Primer Express 3.0.1設(shè)計(jì)特異引物及探針。引物和探針序列如表1所示。

表1 魚(yú)翅引物及探針Table 1 Primers and probes for shark fins

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

魚(yú)翅干制品、未加工的干魚(yú)翅和凍干魚(yú)翅用銼刀磨碎成粉狀后備用，泡發(fā)魚(yú)翅烘干后用粉碎機(jī)制成粉狀后備用，羅非魚(yú)肉樣品烘干后研磨成粉末。取粉末狀魚(yú)翅樣品按一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)比添加到粉末狀的羅非魚(yú)樣品中，混合均勻，用于質(zhì)量靈敏度的測(cè)定。

1.3.2 DNA提取

分別稱(chēng)取約0.01 g樣品，利用迪澳公司的動(dòng)物組織的基因組提取試劑盒或者植物組織的基因組提取試劑盒進(jìn)行樣品DNA的提取，作為DNA擴(kuò)增的模板。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

經(jīng)試驗(yàn)確定的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體為：12.5 μL的 PCR-Mix，引物 COI-F/R 各 1 μL，Probe 0.5 μL，無(wú)菌水 5 μL，5 μL DNA。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取方案的確定

稱(chēng)取不同質(zhì)量的魚(yú)翅樣品，利用迪澳公司的動(dòng)物組織的基因組提取試劑盒進(jìn)行樣品DNA的提取，使用核酸定量分析儀測(cè)定其質(zhì)量，檢測(cè)結(jié)果顯示，DNA濃度為358 ng/μL，OD260/OD280比值為1.8。表明本試驗(yàn)所用DNA試劑盒能夠提取到足夠量的DNA，滿(mǎn)足后續(xù)檢測(cè)的要求。以提取的DNA作為陽(yáng)性模板，ddH2O作為陰性對(duì)照，以COI-F/R作為引物，加入相應(yīng)的探針，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。參照ABI7500熒光PCR儀使用說(shuō)明書(shū)，設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)椋篐olding Stage為95℃5 min，1個(gè)循環(huán)；Cycling Stage為95℃ 20 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，并收集熒光信號(hào)，結(jié)果圖1所示。

從圖 1可以看出，0.01、0.02、0.005 g魚(yú)翅樣品的擴(kuò)增曲線的Ct值分別在27、28、29，均為有效擴(kuò)增。0.01 g樣品量時(shí)擴(kuò)增效果最好，因此取0.01 g樣品作為本試驗(yàn)的取樣量。

2.2 濃度靈敏度試驗(yàn)

將魚(yú)翅 DNA 分別稀釋至 1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5ng/μL幾個(gè)梯度，每個(gè)稀釋度分別取5 μL進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，以ddH2O代替DNA模板作為陰性對(duì)照，以COI-F/R作為引物，加入相應(yīng)的探針，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并收集熒光信號(hào)，以確定該檢測(cè)方法對(duì)魚(yú)翅檢測(cè)的濃度靈敏度，結(jié)果如圖2所示。

從圖2中可以看出，將魚(yú)翅DNA稀釋至不同濃度梯度進(jìn)行擴(kuò)增后，出峰時(shí)間和濃度梯度呈明顯梯度變化，1×10-5ng/μL的魚(yú)翅在Ct值為35時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增，其DNA檢測(cè)的濃度靈敏度可達(dá)1×10-5ng/μL。與王德蓮[15]相比，檢測(cè)DNA靈敏度更高，是其1000倍左右。

圖1 不同提取方案得到的擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curves from different extraction method

圖2 DNA濃度靈敏度試驗(yàn)Fig.2 Sensitivity of different DNA concentration

2.3 質(zhì)量靈敏度試驗(yàn)

將粉碎后的魚(yú)翅樣品與粉碎后的羅非魚(yú)肉樣品混合，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.01、0.1、1、10%的幾個(gè)梯度，加入相應(yīng)的探針，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并收集熒光信號(hào)，以確定該檢測(cè)方法對(duì)魚(yú)翅檢測(cè)的靈敏度，結(jié)果如圖3所示。

從圖3中可以看出，將魚(yú)翅DNA稀釋至不同的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，COI-F/R作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，出峰時(shí)間和質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈明顯梯度變化，含0.01%（m/m）魚(yú)翅的混合樣品在Ct值為33時(shí)出現(xiàn)有效擴(kuò)增，因此該方法能檢測(cè)出樣本中0.01%的鯊魚(yú)源性成分。與王德蓮[15]相比，檢測(cè)的質(zhì)量靈敏度也大幅度提高，是其10倍左右。

2.4 特異性試驗(yàn)

分別選取1個(gè)明翅、1個(gè)生翅、1個(gè)泡發(fā)魚(yú)翅、1個(gè)凍干魚(yú)翅、1個(gè)仿魚(yú)翅以及18個(gè)非魚(yú)翅樣品，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖4。

從圖4可以看出，COI-F/R引物只在鯊魚(yú)源性樣品（包含明翅、生翅、凍干魚(yú)翅、泡發(fā)魚(yú)翅）中有擴(kuò)增，在仿翅樣品中未發(fā)生擴(kuò)增，與文獻(xiàn)[3]的報(bào)道的仿魚(yú)翅主要為明膠、海藻酸鈉，不含鯊魚(yú)成分的調(diào)查結(jié)果相吻合。在其余18個(gè)非魚(yú)翅樣品（包括合鱈魚(yú)、石斑魚(yú)、魷魚(yú)、秋刀魚(yú)、帶魚(yú)、金鯧魚(yú)、黃魚(yú)、平菇、花生、海帶、玉米、冬瓜、土豆、紅薯、黃豆、雞、鴨和羅非魚(yú)）中也未發(fā)生擴(kuò)增，說(shuō)明該檢測(cè)方法的特異性良好，可用于鯊魚(yú)源性樣品的檢測(cè)。

圖3 質(zhì)量靈敏度Fig.3 Sensitivity of different weight concentration

圖4 鯊魚(yú)源性成分檢測(cè)的特異性試驗(yàn)Fig.4 Specific detection of shark-origin components

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用本試驗(yàn)建立的方法對(duì)采集到的市售47份各種魚(yú)翅樣品進(jìn)行檢測(cè)，包括仿魚(yú)翅、明翅、生翅、泡發(fā)魚(yú)翅和凍干魚(yú)翅，結(jié)果如圖5所示。

圖5 實(shí)際樣品檢測(cè)的DNA擴(kuò)增譜圖Fig.5 Amplification curves of shark fins

從圖5可以看出，COI-F/R引物在4份仿魚(yú)翅樣品中未出現(xiàn)擴(kuò)增，在其余43個(gè)魚(yú)翅樣品中均出現(xiàn)有效擴(kuò)增，說(shuō)明該43個(gè)樣品中含有鯊魚(yú)源性成分，上述43份魚(yú)翅均為銷(xiāo)售方聲稱(chēng)的真魚(yú)翅樣品，說(shuō)明目前廣州海味市場(chǎng)銷(xiāo)售的魚(yú)翅中均含有鯊魚(yú)成分。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)設(shè)計(jì)特征的引物和探針，建立實(shí)時(shí)熒光PCR法鑒別魚(yú)翅真?zhèn)蔚姆椒?。通過(guò)相關(guān)試驗(yàn)表明，該方法DNA濃度靈敏度可達(dá)1×10-5ng/μL，質(zhì)量靈敏度可達(dá)0.01%，檢出限可達(dá)0.1%。與王德蓮等[15]采用的實(shí)時(shí)熒光PCR方法相比，濃度靈敏度提高3個(gè)數(shù)量級(jí)，質(zhì)量靈敏度提高1個(gè)數(shù)量級(jí)，且具有較高的物種特異性。通過(guò)對(duì)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的魚(yú)翅樣本及非魚(yú)翅類(lèi)的動(dòng)植物樣本進(jìn)行檢測(cè)，43份真魚(yú)翅樣本中均檢出鯊魚(yú)源性成分，而22份非鯊魚(yú)源性魚(yú)翅樣本中均未檢出鯊魚(yú)源性成分，顯示出該方法具有良好的特異性和通用性，為鑒別市售魚(yú)翅的真?zhèn)翁峁┝艘环N可靠的技術(shù)手段。

[1]肖樂(lè),郝向舉.魚(yú)翅消費(fèi)的是與非[J].中國(guó)水產(chǎn),2013(7):21-25

[2]徐鳳香,高昕,李昭勇,等.魚(yú)翅營(yíng)養(yǎng)成分提取與定性分析[J].食品工業(yè)科技,2007,28(1):225-227

[3]張莉.“假魚(yú)翅”后有“真問(wèn)題”[J].中國(guó)食品,2013(5):17-19

[4]LUO Dong-hui,HAO Dong,XIAN Yan-ping.Stable Isotope Ratios Combined with Fourier Transform Infrared Spectroscopy and Scanning Electron Microscope Analysis to Identify the Dried Shark Fins[J].Food Anal.Methods,2016(9):2400-2405

[5]郭云霞,冒海琳,張舒亞,等.魚(yú)翅的分類(lèi)及鑒別方法[J].食品工業(yè),2011(6):96-99

[6]林婉玲,楊少玲,楊賢慶,等.天然魚(yú)翅與仿生魚(yú)翅快速鑒別方法的建立[J].現(xiàn)代食品科技,2015,31(10):287-294

[7]冼燕萍,董浩,羅海英,等.掃描電鏡法快速鑒別魚(yú)翅干制品品質(zhì)[J].食品科技,2015,40(2):343-347

[8]韓婉清,羅海英,冼燕萍,等.魚(yú)翅干制品品質(zhì)的ATR-FTIR鑒別研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2015,35(2):379-383

[9]DANILLO P,OTTO BF G,ADRIANE P W,et al.Discrimination of shark species by simple PCR of 5S rDNA repeats[J].Genetics and Molecular Biology,2008,31(1):361-365

[10]FAJARDO V,GONZA I,ROJAS L,et.al.A review of current PCR-based methodologies for the authentication of meats from game animal species[J].Trends Food Sci Technol,2010,21(8):408-421

[11]郭鳳柳,熊蕊,劉曉慧,等.應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)摻假肉類(lèi)[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2014,5(2):541-545

[12]覃芳芳,王德蓮,冼燕萍,等.魚(yú)翅類(lèi)食品中鯊魚(yú)成分PCR鑒定方法研究[J].現(xiàn)代食品科技,2014,30(4):274-278

[13]郭云霞,包建強(qiáng),張舒亞,等.食品中鯊魚(yú)源性成分真實(shí)性PCR鑒別研究[J].食品工業(yè)科技,2011,32(10):421-424

[14]郭云霞,張舒亞,諶鴻超,等.SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)食品中鯊魚(yú)源性成分真實(shí)性方法的建立[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2012,31(12):1300-1306

[15]王德蓮,劉冬虹,許麗珠,等.魚(yú)翅制品中鯊魚(yú)源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法[J].現(xiàn)代食品科技,2015,31(4):289-293

[16]王敏,劉葒,黃海,趙曉萌,等.DNA條形碼技術(shù)在深圳魚(yú)肉制品鑒定中的應(yīng)用[J].食品科學(xué),2015,36(20):247-251

[17]王慶華.現(xiàn)代分析技術(shù)在鑒別偽劣食品中的應(yīng)用[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2002,23(2):67-68

[18]FABBRICE T.Molecular identification methods of fish species:reassessment and possible applications[J].Rev Fish Biol.Fisheries,2009(19):265-293

[19]RASUMSSEN R,MORRISSEY M.DNA-Based Methods for the I－dentification of Commercial Fish and Seafood Species[J].Compr Rev Food Sci Food Saf,2008(7):280-295

[20]ASENSIO L.PCR-based methods for fish and fishery products authentication[J].Trends Food Sci Technol,2007,18(11):558-566

[21]Wen Jing,ZENG Ling,Sun Yu-lin,et al.authentication and traceability of fish maw products from the market using DNA sequencing[J].Food Control,2015(55):185-189

[22]李向麗,劉垚,譚貴良,等.基于LAMP法快速檢測(cè)羊肉及其制品中的豬、鴨和羊源性成分[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2015,27(3):247-252

[23]冼鈺茵,易敏英,高東微,等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)肉及肉制品中的牛源性成分[J].食品工業(yè)科技,2016,37(7):278-282

[24]陳穎,王晶,吳亞君,等.動(dòng)物明膠中3種DNA提取方法的比較研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(4):42-45

Identification of Shark Fins with Real-Time PCR Method

FANG Jun，LIN Chen，ZHANG Zhi-jun，WANG Li-ping，XIONG Juan，CHEN Min-er
（China National Analytical Center，Guangzhou，Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for Dangerous Chemicals，Guangzhou 510070，Guangdong，China）

A novel effective method for identification of shark fins available in market was established by Real time Polymerase Chain Reaction（PCR）technique.Specific primers and probes were designed from a portion mitochondria genome of shark fin.Extraction method of Deoxyribonucleic acid（DNA），sensitivity of DNA concentration，sensitivity of DNA weight and specificity were investigated.It was indicated that enough concentration of DNA for detection would be obtained by kit extraction method.DNA concentration sensitivity of 1×10-5ng/μL and DNA weight sensitivity of 0.01%were abtained.47 shark fin products and 18 non-shark fin products available in market were determined with the above PCR method.DNA of shark was be found in 43 products while DNA of shark was not be found in other 22 products including 4 man-made shark fin products.

shark fin；real-time PCR；sensitivity；specificity；identification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.026

廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B020501005、2015B090906023）

方軍（1975—），男（漢），高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：食品檢測(cè)與質(zhì)量控制。

2017-04-02