丁樹慧，王立梅，齊斌，張晶

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500）

雙酶分步水解低值海洋魚粉制備低聚肽的研究

丁樹慧1，2，王立梅2，齊斌2，張晶1，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500）

為了得到更多的低聚肽，分析比較堿性蛋白酶、中性蛋白酶等多種蛋白酶對(duì)低值海洋魚粉的酶解效果，以水解度為指標(biāo)，篩選出中性蛋白酶和堿性蛋白酶為最佳水解酶，并通過響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化酶解工藝。結(jié)果表明：最優(yōu)酶解條件為：堿性蛋白酶與中性蛋白酶酶活力配比為6∶4先后加入，總加酶量為2 500 U/g，pH值為8時(shí)堿性蛋白酶酶解2 h，pH值降為7時(shí)中性蛋白酶酶解3 h，酶解溫度為50℃，該條件下水解度高達(dá)41.84%。

低值海洋魚粉；蛋白酶；雙酶酶解；響應(yīng)面分析

全球約有一半生物來自于海洋，其也是功能成分多樣性生物的豐富來源[1]。過去幾十年來，許多傳統(tǒng)魚種存儲(chǔ)量大幅度減少，海洋物種過度開發(fā)的比例增加，造成了世界海洋漁業(yè)嚴(yán)重惡化的狀態(tài)[2-3]。此外，人口的增長(zhǎng)和對(duì)健康海洋食品消費(fèi)意識(shí)的提高，增加了對(duì)魚類和魚副產(chǎn)物的需求，但許多幾乎沒有商業(yè)利益的非目標(biāo)物種仍未得到充分利用[4]，一般加工成魚粉，用于飼料、肥料等低附加值的產(chǎn)品[5-6]。如何開發(fā)這些量大質(zhì)低的魚類，提高低值魚粉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物活性[7-8]，對(duì)于我國(guó)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展有著重要意義。

隨著酶技術(shù)的發(fā)展，酶法水解在水產(chǎn)加工利用中的應(yīng)用越來越廣泛[9-10]。不僅可以提高未充分利用魚類資源的利用率[11]，而且能夠釋放肽類改善生物活性[12-15]。單酶水解是以往研究最常用的方法，但水解效果通常不太理想，蛋白質(zhì)很難被徹底水解，水解率較低，生產(chǎn)效益低下[16-17]，雙酶酶解則因其良好的水解效果而得到人們的廣泛關(guān)注[18-20]。

低值海洋魚粉的蛋白質(zhì)含量占50%～70%，消化率高達(dá)90%，氨基酸平衡，富含維生素B和礦物質(zhì)，水解液中含有較豐富的具有特殊生理活性的功能性肽。目前，市場(chǎng)上的蛋白酶耐受鹽濃度較低，在酶解含鹽濃度較高的魚粉時(shí)，水解度較低。因此，開發(fā)海洋低值魚粉低聚肽，蛋白酶的選擇重中之重。本試驗(yàn)利用低值海洋魚粉進(jìn)行酶催化反應(yīng)，篩選出最佳蛋白酶，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶解工藝條件，獲得較多的低聚肽，提高資源利用率和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，豐富低值海洋魚粉的功能食品開發(fā)和利用。

1 材料與方法

1.1 材料

脫脂海洋魚粉：中海海洋科技有限公司（青島，中國(guó)）。

堿性蛋白酶（Alcalase，2×105U/g）、中性蛋白酶（Neutral，8×105U/g）、復(fù)合蛋白酶（Protamex，1.07×105U/g）、風(fēng)味蛋白酶（Flavourzyme，2.85×105U/g）：諾維信生物技術(shù)有限公司；木瓜蛋白酶（Papain，8×105U/g）、胰蛋白酶（Trypsin，2.5×106U/g）：上海西寶生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純：上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

酸度計(jì)（EL-20K）：上海梅特勒儀器廠；定氮儀（KND-2C）：上海纖檢儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4）：常州國(guó)華電器；高速冷凍離心機(jī)（CR22G-Ⅱ）：日本日立公司；磁力加熱攪拌器（CL-2）：上海豫康科教有限公司；超低溫冰箱（Heto）：美國(guó)Thermo電氣公司；真空冷凍干燥機(jī)：德國(guó)CHRIST公司；電子天平（FA604A）：上海精天電子儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脫脂魚粉酶解工藝流程

脫脂海洋魚粉→加去離子水→加酶→調(diào)pH值→恒溫水解→100℃滅酶15 min→冷卻→10 000 r/min離心15 min→取上清液→冷凍干燥→多肽成品

1.3.2 最適蛋白酶的篩選

稱取適量魚粉，按照料液比為1∶10（g/mL）加入去離子水，在恒溫水浴中不斷攪拌，分別加入堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，加酶量都為2 500 U/g，在各自最適酶解溫度和pH值下，酶解6 h，每隔1 h取水解液測(cè)定水解度，見表1所示。

表1 低值海洋魚粉的酶解參數(shù)Table 1 Parameters for enzymatic hydrolysis of low-value marine fish meal

1.3.3 雙酶酶解最佳條件的確定

篩選出水解度較高的兩種蛋白酶，將酶解條件統(tǒng)一為：總加酶量 2 500 U/g，料液比 1 ∶10（g/mL），在各自溫度、pH值下，酶解5 h，研究先后加入和同時(shí)加入不同加酶方式對(duì)酶解效果的影響。

1.3.4 單因素的優(yōu)化

以蛋白質(zhì)水解度為衡量指標(biāo)，對(duì)影響酶解反應(yīng)的主要因素如加酶量、pH值、溫度、酶解時(shí)間、酶活力配比進(jìn)行研究，確定最佳酶解工藝。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)的需要，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken試驗(yàn)，選取加酶量、酶解時(shí)間、pH值和酶解溫度4個(gè)因素，以水解度為響應(yīng)值，進(jìn)一步優(yōu)化低值海洋魚粉的酶解條件。

1.4 肽分子量分布

采用高效凝膠過濾色譜法測(cè)定[21]。魚粉酶解產(chǎn)物溶于去離子水中，離心，微孔過濾膜過濾后上TSK gel 2000 SWXL，流動(dòng)相為乙腈和水，流速0.5 mL/min，溫度30℃，波長(zhǎng)為220 nm。以細(xì)胞色素C、抑膚酶、桿菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品做相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線。

1.5 數(shù)據(jù)分析

本研究運(yùn)用Design expert8.06軟件進(jìn)行中心點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)和方差分析，試驗(yàn)數(shù)均以x±s表示。各組數(shù)據(jù)均數(shù)間用t檢驗(yàn)判斷其差異顯著性。p＜0.05為顯著性差異，p＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 最適蛋白酶的篩選

Aluko等[22]指出生物活性肽的活性與其分子量大小、末端氨基酸的種類有關(guān)，且不同蛋白酶具有不同的酶切位點(diǎn)和反應(yīng)條件[23]，決定了水解肽鍵的數(shù)量和位置，使酶解產(chǎn)物有著不同的生理活性，因此酶的選擇尤為重要，其決定了產(chǎn)物的組成、風(fēng)味、功能等性質(zhì)。在本試驗(yàn)中，以低值海洋魚粉為底物，選擇堿性、中性、復(fù)合、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶為水解反應(yīng)催化劑，在酶各自最適溫度、pH值下進(jìn)行酶解，6 h后試驗(yàn)結(jié)果如圖1。

由圖1可知，水解度隨時(shí)間而增加，5 h后漸漸趨于平緩。其中，堿性蛋白酶和中性蛋白酶水解度相差不太大，但都高于其他4種蛋白酶。由于蛋白酶具有專一性[24]，單酶水解時(shí)，只能從幾個(gè)固定的氨基酸殘基處進(jìn)行水解，水解程度會(huì)受到一定程度的限制，水解產(chǎn)生的肽片段的末端氨基酸也較為單一。為得到分子量更小和活性更好的水解產(chǎn)物，選用堿性蛋白酶和中性蛋白酶兩種酶。

圖1 低值海洋魚粉各蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度Fig.1 The hydrolysis degree of all protease enzymolysis products from low-value fish meal

2.2 雙酶分步酶解最佳工藝的研究

2.2.1 分步酶解最佳條件的確定

選用水解度較高的酶制劑堿性蛋白酶①和中性蛋白酶②，統(tǒng)一酶解條件為：總加酶量為2 500 U/g，酶解時(shí)間為5 h，在各酶最適溫度和pH值下，不同酶解方案和參數(shù)見表2。

表2 雙酶水解低值魚粉蛋白的不同酶解方案及結(jié)果Table 2 Different programs and results for composite enzymatic hydrolysis of low-value fish meal proteina

由表2可知，以堿性蛋白酶和中性蛋白酶先后加入方式水解度最高，達(dá)到（39.35±0.32）%。說明這種方案優(yōu)于其他方式，在后續(xù)試驗(yàn)中即選用中性蛋白酶和堿性蛋白酶先后加入方式。

2.2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.2.1 總加酶量對(duì)水解效果的影響

總加酶量對(duì)水解效果的影響見圖2。

由圖2可知，隨著加酶量的增加水解度逐步增加，但在總加酶量大于2 500 U/g時(shí)，水解度漸漸下降，可能因?yàn)殚_始加酶量低，酶和底物能夠完全結(jié)合；當(dāng)酶量大于最適濃度時(shí)，酶分子過于飽和，有些酶分子未能與蛋白質(zhì)結(jié)合，所以水解度不會(huì)有太大變化[25-26]。結(jié)合試劑最大利用率和實(shí)際成本，選用2 500 U/g。

圖2 總加酶量對(duì)低值魚粉蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of total enzyme dose on DH of low-value fish meal protein

2.2.2.2 兩種酶活力配比對(duì)水解效果的影響

兩種酶活力配比對(duì)水解效果的影響見圖3。

圖3 堿性和中性蛋白酶酶活力配比對(duì)低值魚粉蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of enzyme activity ratio of alcalase and neutrase on DH of low-value fish meal protein

由圖3可知，隨著堿性蛋白酶的比例增加，水解度不斷增加，在堿性蛋白酶和中性蛋白酶酶活力配比為6∶4（U/mg）時(shí)，水解度達(dá)到最高，高達(dá) 42.02%。

2.2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)水解效果的影響

酶解時(shí)間對(duì)水解效果的影響見圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)低值魚粉蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on DH of low-value fish meal protein

由圖4可見，水解度隨時(shí)間的增加而增加，但在5h之后水解速率開始下降?？赡苁且?yàn)殡S著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，底物濃度減小，反應(yīng)位點(diǎn)逐漸被酶分子飽和，產(chǎn)物濃度增大，反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)性抑制加強(qiáng)，酶活力下降，中間復(fù)合物經(jīng)過初始階段的積累達(dá)到穩(wěn)態(tài)，逐漸恒定[27]。綜合考慮，適宜的酶解時(shí)間為5 h。

2.2.2.4 pH值對(duì)水解效果的影響

pH值對(duì)水解效果的影響見圖5。

圖5 酶解pH值對(duì)低值魚粉蛋白水解度的影響Fig.5 Effect of pH value on DH of low-value fish meal protein

由圖5可知，堿性和中性蛋白酶的pH值都是先上升后下降，可能是因?yàn)閜H值的不斷上升使酶活力降低，酶與底物的結(jié)合能力下降。故本試驗(yàn)中中性蛋白酶最適pH值為7.0，堿性蛋白酶最適pH值為8.0。

2.2.2.5 溫度對(duì)水解效果的影響

溫度對(duì)水解效果的影響見圖6。

圖6 酶解溫度對(duì)低值海洋魚粉蛋白水解度的影響Fig.6 Effect of temperature on DH of low-value fish meal protein

由圖6可知，在一定溫度范圍內(nèi)，水解度隨溫度的上升而增加，在50℃時(shí)水解度達(dá)到最大值；此階段，溫度增加可以提高底物分子的熱能，從而使反應(yīng)的速率加大，水解度也隨之增加。當(dāng)溫度超過50℃后，水解度急劇下降，這是因?yàn)槊副旧硎堑鞍踪|(zhì)，溫度逐漸上升造成酶蛋白變性失活，從而影響水解度，使之降低。故雙酶分步酶解的最適溫度為50℃。

2.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)分析雙酶分步水解低值魚粉

2.2.3.1 分析因素的選取

考慮到各因素之間的交互影響，結(jié)合2.2.2節(jié)單因素試驗(yàn)結(jié)果，為了得到最佳反應(yīng)條件，對(duì)加酶量、酶解pH值、時(shí)間和溫度4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，四因素三水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中24個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn)，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表3。

表3 低值海洋魚粉蛋白響應(yīng)面分析法因素水平表Table 3 Factors and levels of low-value fish meal protein in response surface design

2.2.3.2 方差分析及響應(yīng)曲面分析圖

方差分析見表4，各因素間的相關(guān)性對(duì)水解度的影響見圖7。

表4 水解度回歸方程方差分析Table 4 ANOVA for regression equation of DH

圖7 各因素間的相關(guān)性對(duì)水解度的影響Fig.7 Response surface plots showing the pairwise interactive effects of four hydrolysis conditions on the DH

由表4可知，二次回歸模型的F值為71.16，大于0.01水平上的臨界值，P值＜0.000 1，失擬項(xiàng)的F值為2.38＞0.05，差異不顯著，說明未知因素對(duì)試驗(yàn)干擾很小，方程沒有失擬因素存在，回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.986 1，說明回歸方程擬合的較好，可用回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析[29]。將回歸方程的各項(xiàng)回歸系數(shù)進(jìn)行 t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) B、AD、BC、A2、B2、C2、D2因素非常顯著（P＜0.01），說明各因素對(duì)酶解參數(shù)有交互作用，不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

根據(jù)回歸系數(shù)，對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到相應(yīng)回歸方程：

從圖7分析可知，pH值對(duì)水解度的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線最陡；時(shí)間的影響次之，而圖中溫度曲線最平滑，因此影響最不顯著。時(shí)間和溫度、pH值和時(shí)間兩者之間的交互作用顯著，溫度與pH值的交互作用次之，而其它因素兩者之間的交互作用不太明顯。

2.3 分子量分布

分子量分布圖見圖8所示。

圖8 低值海洋魚粉的分子量分布Fig.8 Molucular weight distribution of low-value fish meal oligopeptide

圖8體現(xiàn)了通過酶法水解低值海洋魚粉后大多數(shù)大分子蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子寡肽。分子量在180 Da～1 000 Da范圍的高達(dá)（91.09±0.23）%，值得一提的是，二肽和三肽比例占（58.90±0.48）%，分子量大于10 000 Da的蛋白質(zhì)只占（0.29±0.03）%。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以低值海洋魚粉為原料，以水解度為指標(biāo)，采用蛋白酶酶解技術(shù)制備魚粉多肽。通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)及響應(yīng)面的分析優(yōu)化堿性蛋白酶和中性蛋白酶雙酶酶解魚粉工藝條件。確定最佳酶解條件為：加入pH值為8的堿性蛋白酶酶解2 h，pH值降到7時(shí)再加入中性蛋白酶，酶解3 h，酶解溫度50℃，加酶量為2 500 U/g。分子量分布主要在180 Da～1 000 Da范圍內(nèi)，大分子蛋白質(zhì)水解徹底。

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The Study of Oligopeptides from Low-value Marine Fish Meal with Double Enzyme Hydrolysis

DING Shu-hui1，2，WANG Li-mei2，QI Bin2，ZHANG Jing1，*
（1.College of Chinese Medicinal Materials，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China；2.School of Biotechnology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

In order to get more oligopeptides，establish low-value marine fish meal hydrolysis conditions，degree of hydrolysis as the indexes to compare the effect of hydrolysis of alkaline protease，neutral protease and so on the many kinds of protease.Alkaline protease and neutral protease was selected as the best protease.The hydrolysis conditions was optimized by response surface methodology.The results showed the optimal enzymatic hydrolysis conditions：the alkaline protease and neutral protease enzyme activity ratio of 6 ∶4 successively joined，enzyme amount was 2 500 U/g，the alkaline protease kept hydrolyzing for 2 h when the pH was 8.Until the pH value dropped to 7.0，the neutral protease was added and continued stirring for another 3 h，enzymolysis temperature 50℃.Under the condition of the hydrolysis degree as high as 41.84%.

marine low-value fish meal；protease；double enzyme hydrolysis；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.009

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（863計(jì)劃）（2013AA102203-03）；江蘇省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（BE2017316）；江蘇省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（BE2017326）

丁樹慧（1991—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通信作者：張晶（1971—），女（漢），教授，博士，研究方向：中藥化學(xué)。

2017-05-16