李 希，王 曦，吳蘇君，羅惠娣，毛楊毅，賀東昌，周勝花，李春艷，張 麗，郭慧慧，薛麗娜，黨文慶

呂梁黑山羊的體細胞克隆

李 希，王 曦，吳蘇君，羅惠娣，毛楊毅，賀東昌，周勝花，李春艷，張 麗，郭慧慧，薛麗娜，黨文慶

（山西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

研究旨在嘗試利用體細胞克隆技術進行地方優(yōu)良品種呂梁黑山羊的克隆保種。剪取呂梁黑山羊耳緣組織，通過組織塊培養(yǎng)法獲得了呂梁黑山羊皮膚成纖維細胞，使用第6代的皮膚成纖維細胞作為供體細胞進行核移植，將重構胚胎通過手術移植到受體遼寧白絨山羊母羊體內，結果成功獲得了2只體細胞克隆黑山羊，生長發(fā)育狀況良好，且與供體黑山羊一致，表明體細胞克隆技術是可行的。這是山西省首例呂梁黑山羊克隆個體，它的成功為優(yōu)良地方品種改良、保種等研究提供了有效可行的方法，為下一步進行呂梁黑山羊的轉基因育種研究奠定了技術基礎。

呂梁黑山羊；克?。槐７N；核移植

呂梁黑山羊是山西省地方優(yōu)良品種之一，主要產于山西西部黃土高原山區(qū)一帶，具有遺傳性穩(wěn)定、適應性好、抗病力強、耐粗飼、易抓膘、肉質鮮嫩等特點，是山西省乃至全國珍貴的畜種資源，有很高的經(jīng)濟生物種用價值。但由于近年來對地方品種重視不夠，無序化雜交，使得其經(jīng)濟實用價值受到嚴重影響，品種資源保護也受到嚴重威脅。調查研究發(fā)現(xiàn)，呂梁黑山羊的數(shù)量不僅以驚人的速度銳減，而且已處于瀕危或滅絕的邊緣，如何更高效地保護呂梁黑山羊這一地方優(yōu)良品種已經(jīng)刻不容緩[1]。

傳統(tǒng)的保種方法是建立活畜保種場，但是，活畜保種方法不僅成本費用高，而且能夠保存的品種以及個體數(shù)量有限。體細胞克隆技術的成功為珍稀瀕危物種保種提供了另一條有效途徑。體細胞克隆技術是將供體細胞通過顯微操作的方法注射到去核的卵母細胞中構建重組胚，經(jīng)胚胎移植給受體產生存活后代的方法。由于體細胞的保存方法成熟且效率高，結合克隆技術，能夠實現(xiàn)動物在短時間內重現(xiàn)?？寺〖夹g在動物種質資源保護中具有獨特的優(yōu)勢，是動物活體保種的最有力輔助手段[2-3]。

本試驗擬通過對呂梁黑山羊耳成纖維細胞培養(yǎng)及其克隆研究，探討保種的可行性，旨在為今后山西省瀕危動物保護和畜禽品種改良研究提供有效可行的方法。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

呂梁黑山羊的耳緣組織采自山西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所克隆基地試驗羊場；受體羊為健康無病，特別是無生殖系統(tǒng)疾病、且有良好繁殖記錄的經(jīng)產遼寧白絨山羊。

DMEM和TCM-199購自Gibco公司；胎牛血清FBS購自Hyclone公司；FSH，PG購自寧波市三生藥業(yè)有限公司；CIDR購自新西蘭Inter Ag公司；維生素ADE注射液購自陜西西鄉(xiāng)長江動物藥品公司；胰蛋白酶，NaHCO3，HEPES，DPBS，二甲基亞砜（DMSO），Hoechst33342，離子霉素，6-DMAP等均購自Sigma公司，青、鏈霉素為國產。細胞培養(yǎng)皿及胚胎培養(yǎng)4孔板購自NUNC公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 呂梁黑山羊耳緣成纖維細胞系的建立 用鑷子夾住雙面刀片除凈黑山羊耳毛，依次用碘酒、75%酒精消毒干凈,拿采樣鉗剪取靠近耳尖的皮膚組織塊（1 cm2），在有青霉素和鏈霉素的DPBS中洗3遍，放入含有青霉素和鏈霉素的DMEM中，封口膜封口，4 h內帶回實驗室。在超凈工作臺中將組織塊徹底除凈毛發(fā)，放入75%的酒精中浸泡30 s，用DPBS漂洗3遍,在有培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中用消毒的眼科剪剔除掉結締組織，并把耳組織剪成約1 mm2的小塊，接種到60 mm培養(yǎng)皿的底部，使組織塊均勻分布且有一定間距，倒置培養(yǎng)于37℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中6～8 h，待組織塊貼壁后，沿皿壁加入含有15%FBS的DMEM培養(yǎng)液4 mL，使培養(yǎng)液慢慢浸沒組織塊，培養(yǎng)5～7 d觀察組織塊周圍有無細胞爬出，待細胞生長至80%匯合時，進行傳代培養(yǎng)或冷凍保存。

1.2.2 成纖維細胞的純化 依據(jù)上皮樣細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶的敏感性不同（成纖維細胞對胰蛋白酶敏感，脫壁快，而上皮樣細胞則不敏感，脫壁慢；其次，接種以后成纖維細胞也比上皮樣細胞貼壁快，大多數(shù)細胞能在0.5～1.0 h內貼壁，而上皮細胞短時間內不能貼壁）經(jīng)過2～3次傳代分離即可獲得純化的成纖維細胞。

1.2.3 成熟卵母細胞的采集

1.2.3.1 供體母羊的處理 采用同期發(fā)情與超數(shù)排卵相結合的方法，在發(fā)情周期的任意一天將陰道栓CIDR放入供體母羊陰道，放入CIDR第1天記為0 d，同時肌肉注射維生素ADE 5 mL，于第14天開始采用遞減法注射超數(shù)排卵藥物FSH，連續(xù)3 d，每天7：00和19：00分別等量注射一次（表1），并在最后一次注射FSH的同時肌肉注射氯前列烯醇PG 1 mL（0.1 mg），同時撤栓；撤栓24 h后利用公羊試情。超排供體一般在最后一次注射FSH后24～48 h內發(fā)情。

表1 FSH的注射量 mL

1.2.3.2 卵母細胞的采集 手術前空腹24 h，將供體羊四肢固定并呈前低后高仰臥于手術保定架上，臀部肌注0.5 mL鹿眠新麻醉，剪毛并刮凈毛茬，常規(guī)消毒處理，蓋上手術創(chuàng)巾，在乳房下2～4 cm處沿腹中線打開腹腔，找到卵巢，觀察記錄卵巢上的卵泡數(shù)及黃體發(fā)育情況，然后在宮管結合部的子宮側插入沖卵套管針，注入37℃沖卵液，將卵母細胞從輸卵管傘部沖出，收集于離心管中。然后換另一側子宮角和輸卵管，方法同前。收集的離心管立即帶回實驗室在體視顯微鏡下檢查卵子情況，挑選出形態(tài)完整、胞質均勻并排出第一極體的卵母細胞作為體細胞核移植的受體細胞。

1.2.4 體細胞核移植 將供體細胞和成熟的卵母細胞同時轉移到顯微操作液滴中，操作液為添加20 mmol/LHepes的TCM199＋10%FBS。然后在倒置顯微鏡（Olympus）下用固定針吸住卵母細胞，去核針去核，選擇大小合適光滑的單個成纖維細胞，注入到去核卵母細胞的卵周隙。操作30～40個卵后，將重構卵轉移到TCM199培養(yǎng)液中，在38.5℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中恢復0.5～1.0 h，然后檢測重構卵完整性并進行激活操作。

1.2.5 重組胚的融合激活 將恢復好的完整的重構胚胎分批轉移到融合液中平衡3～5 min，然后每批5個放入電極寬度為1mm的已經(jīng)鋪滿融合液的電融合槽（BTX ECM2001電融合儀）中，用自制撥卵針調節(jié)，使供體細胞與卵母細胞相接觸的界面與電極平行，然后由ECM2001細胞融合儀施加2個直流脈沖，2.0 kV/cm，25μs，間隔 1 s。電擊之后將經(jīng)過電融合的重構胚轉入TCM199中培養(yǎng)0.5 h后，顯微鏡下觀察其融合情況。融合好的胚胎轉移到含5μmol/L離子霉素的TCM199培養(yǎng)液中激活5 min，然后轉移到含2 mmol/L 6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）的TCM199培養(yǎng)液中，在38.5℃，5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。最后轉入TCM199培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.2.6 胚胎移植和妊娠檢測 重構胚完成融合激活后，立即進行胚胎移植。挑選形態(tài)和發(fā)育較好的重構胚，采用外科手術法移入同步發(fā)情的受體遼寧絨山羊母羊輸卵管中。同前，母羊在手術前24 h內禁食禁水，手術前刮毛，并保定于手術架上。同樣在腹中線距乳房約4 cm處開口，接著將子宮角和輸卵管拉出，觀察記錄卵巢上的黃體發(fā)育情況。挑選黃體較多的一側進行移植，用帶有1 mL注射器的移植針從輸卵管傘部進針，細心地將含有重構胚胎的液體緩緩注入，然后慢慢拔出移植針。每只受體移植12枚左右胚胎。胚胎移植后45～60 d可進行超聲波妊娠檢測，對懷孕的母羊調整飼養(yǎng)管理，直至克隆羊出生。

2 結果與分析

2.1 呂梁黑山羊耳緣皮膚成纖維細胞系的建立

通過組織塊貼壁培養(yǎng)法成功制備出了呂梁黑山羊的耳緣皮膚成纖維細胞。組織塊經(jīng)過5～6 d的培養(yǎng)即可觀察到細胞從組織塊邊緣向外遷出，10 d左右能清楚看到沿組織塊周圍生長出來的成纖維細胞。從形態(tài)來看，細胞主要呈梭形、長條狀、多角形或不規(guī)則形，且細胞之間有較大間隙，排列疏松，當細胞長到鋪滿皿底時，呈放射狀或漩渦狀分布。一般細胞生長到70%～80%匯合時，就立即將其進行消化傳代或液氮凍存。呂梁黑山羊的原代及傳代成纖維細胞如圖1所示。

2.2 克隆胚胎的構建

本研究首先采集卵母細胞292枚，通過體外成熟164枚，構建體細胞核移植胚胎68枚，融合率為41.46%。在此基礎上，利用相同方法對295枚體內成熟卵母細胞進行去核，得到295枚去核卵母細胞。經(jīng)核移植與電融合操作獲得重組胚146枚，融合率為49.49%。卵母細胞及克隆胚胎生產情況列于表2。體內成熟的卵細胞如圖2所示，核移植的注核過程如圖3所示。

表2 克隆胚胎生產與發(fā)育

2.3 克隆胚胎的移植

挑選身體狀況與同期發(fā)情良好的受體母羊12只，通過手術移植的方法，將重構胚胎移植到12只母羊體內，移植情況列于表3。

表3 呂梁黑山羊克隆胚胎移植情況

移植后60 d對這些受體進行B超檢查，確認妊娠1只，共移植母羊12只，受胎1只，受胎率為8.33%（1/12）。于2017年6月24日足月產下2只健康胎兒，出生體質量分別為2.7，3.7 kg；其克隆羊都是雌性，毛色為黑色，與代孕母羊的毛色不同（圖4）。

目前，2只克隆羊生長發(fā)育狀況良好。從本研究克隆的情況來看，呂梁黑山羊的克隆可能還存在一定問題，雖然我們成功獲得了呂梁黑山羊克隆個體，但胚胎移植的受胎率較低，生產出的克隆羊數(shù)也少，說明我們的技術還存在不完善的地方，還有待改進。

3 討論

體細胞克隆技術已經(jīng)成為畜禽遺傳資源保護的一種有效方法。克隆技術是指將供體細胞轉移到去核的第2次減數(shù)分裂中期卵母細胞中，經(jīng)過融合、激活、體外培養(yǎng)、胚胎移植等一系列手段生產出與供體細胞遺傳信息完全一致的新個體的一項技術[4-6]。通過建立動物體細胞系、結合體細胞克隆技術，是保護物種最為理想的方法之一，比常規(guī)活體保種的方法更為經(jīng)濟、有效[7]。另外，通過核移植和基因導入技術還可以為家畜育種開辟新途徑[8]。本研究成功生產出2只呂梁黑山羊體細胞克隆羊，獲得了山西省首例呂梁黑山羊克隆個體，說明通過體細胞克隆技術來實現(xiàn)呂梁黑山羊保種是可行的，同時可為下一步進行畜禽品種保護和改良育種研究奠定技術基礎。

電融合是生產克隆動物的關鍵步驟，直接影響著重組胚的后續(xù)發(fā)育[9]。電融合是一個復雜的生理物理學變化過程，其原理是在緊密接觸的卵母細胞膜與供體細胞膜上利用電場電擊形成微孔，借助Ca2+離子在胞質內的流動而融為一體[10]。當體細胞被注入去核卵母細胞卵周隙后，必須經(jīng)過細胞融合，才能最終成為一個完整的細胞繼續(xù)發(fā)育。在克隆技術中，融合率越高,后續(xù)可用胚胎數(shù)就越多，克隆效率也越高。本研究融合率只有49.49%，這一結果反映了體細胞核移植技術尚有不完善之處?？赡芘c核移植和重構胚融合間隔時間的延長有直接關系，還有待進一步驗證。據(jù)STON等[11-13]報道，融合與激活步驟的間隔時間的延長不僅會影響早期克隆胚胎的卵裂率和囊胚率，而且對妊娠率也有較顯著的影響[14]。此外，供體細胞的形態(tài)大小也影響體細胞核移植的融合率[15-16]。因此，篩選生長狀態(tài)好的供體細胞是提高胚胎融合率的關鍵。

由于克隆胚胎生成的復雜性，移植時必須保證受體動物生殖周期與克隆胚發(fā)育階段同步[17]，否則會對胚胎造成不利的影響，直接影響受胎率。因此，使胚胎保持在相對同步的環(huán)境是移植成功的關鍵，但在實際操作中很難做到完全同步。用發(fā)育程度較低的重構胚移植到受體動物體內環(huán)境，能得到較好的妊娠率[18]，本試驗中所移植的呂梁黑山羊胚胎為構建后1～2細胞期的胚胎；受體是試情后36 h左右的絨山羊，在胚胎移植時所選受體母羊均已經(jīng)發(fā)生排卵且卵巢大小正常。共移植受體12只，受胎率為8.33%（1/12），未出現(xiàn)流產、畸形、死胎等問題，說明體內成熟的卵母細胞質量遠遠優(yōu)于體外成熟的卵母細胞。移植胚胎的數(shù)目以及發(fā)育狀況對受體母羊的妊娠率也有顯著影響[19]。此外，克隆胚胎的質量、胚胎移植的操作技術、受體母羊的激素水平、營養(yǎng)狀況及生理狀況等因素都會影響妊娠率[20]。

以往克隆技術的研究大多通過改變供體細胞的類型、改善培養(yǎng)體系和融合激活條件等來提高克隆效率[21-22]，本研究結果顯示，克隆胚胎移植后受體的妊娠率和后代存活率也會影響克隆效率的高低。因此，應該進一步探索如何提高克隆羊的受胎率、存活率及受體移植同步性等問題。

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Somatic Cell Cloning of Lüliang Black Goats

LIXi，WANGXi，WUSujun，LUOHuidi，MAOYangyi，HEDongchang，ZHOUShenghua，LIChunyan，ZHANGLi，GUOHuihui，XUELina，DANGWenqing
（Instituteof Animal Husbandry and Veterinary，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030032，China）

The objective of this study was to clone Lüliang black goat using the SCNT （somatic cell nuclear transfer）technology and to protect local variety.A piece of ear tissue was collected from Lüliang black goat and cultured to get skin fibroblast cells.The reconstructed embryos were produced by nuclear transfer usingthe G6 generation of Lüliang black goat ear firbroblast cellsas donors and Liaoning whitecashmere goat ooctyes as receptors,and we successfully cloned two lüliang black lambs on June 24,2017 which were consistent with the donor.The result indicated that Lüliang black goat was successfully cloned by SCNT technology.This study obtains the first cloned offspring of Lüliang black goat,which will provide a effective feasible method for breeding,and lay a foundation for next step that producetransgenetic goatsby somatic nuclear transfer.

Lüliangblack goat;clone；breed conservation;somatic cell nuclear transfer

S827

A

1002-2481（2017）12-2001-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.12.25

2017-08-17

山西省農業(yè)科學院科技自主創(chuàng)新能力提升工程項目（2017ZZCX-02）

李 希（1982-），女，山西交城人，助理研究員，碩士，主要從事動物細胞胚胎工程及克隆研究工作。