王婷婷，裴露，李晉，朱峰，耿杰，李雨晴，劉紅春,3

(1. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450052；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450002；3.鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，鄭州 450052)

·研究生園地·

食管鱗狀細(xì)胞癌組織中VRK1及BANF1的表達(dá)及其意義*

王婷婷1，裴露2，李晉1，朱峰1，耿杰1，李雨晴1，劉紅春1,3

(1. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450052；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450002；3.鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，鄭州 450052)

目的探討牛痘病毒相關(guān)性激酶1(VRK1)及屏障自整合因子1(BANF1)在食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)組織中的表達(dá)及其意義。方法免疫組化染色法檢測120例ESCC患者癌組織及配對的癌旁組織中VRK1和BANF1蛋白的表達(dá)水平;RT-qPCR法檢測VRK1和BANF1 mRNA在ESCC癌組織和配對的癌旁組織中的表達(dá)水平;并分析其與ESCC患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。結(jié)果免疫組化染色結(jié)果表明，VRK1和BANF1蛋白在癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為70.815，60.286，P均<0.05)，且兩者的表達(dá)水平與TNM分期和分化程度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，而與不同性別、年齡和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。RT-qPCR結(jié)果顯示，VRK1和BANF1 mRNA在癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(0.88±0.09 vs 0.59± 0.08，0.78±0.08 vs 0.41±0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為1.95,1.99，P均<0.05)。結(jié)論VRK1和BANF1在ESCC患者組織中呈過表達(dá)，且與ESCC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

食管鱗狀細(xì)胞癌；牛痘病毒相關(guān)性激酶1；屏障自整合因子1

牛痘病毒相關(guān)性激酶1(vaccinia-related kinase 1，VRK1)是絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶家族的成員之一[1]。VRK1基因在人體組織中廣泛表達(dá)，并在分裂旺盛的細(xì)胞(如睪丸細(xì)胞，胸腺細(xì)胞，胎肝細(xì)胞和癌細(xì)胞)中的表達(dá)水平較高。研究表明，VRK1蛋白激酶在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中發(fā)揮著重要作用，其能調(diào)控正?；驉盒约?xì)胞的增殖和存活[1-3]。BAF蛋白由屏障自整合因子1(barrier to autointegration factor 1，BANF1)基因編碼，是有絲分裂核重組[4]、調(diào)節(jié)逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合前復(fù)合體穩(wěn)定性[5]、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄功能的必需蛋白質(zhì)。然而VRK1和BANF1在食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)組織中表達(dá)的研究報(bào)道國內(nèi)少見。本研究通過免疫組化和RT-qPCR檢測VRK1和BANF1蛋白質(zhì)及mRNA在ESCC癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平,分析其與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系,旨在探討兩者在ESCC中的作用，為臨床的治療提供新的思路。

1 對象與方法

1.1研究對象 收集2015年9月至2016年11月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的ESCC癌組織及配對的癌旁組織(距腫瘤邊緣5 cm以上)120例。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理組織學(xué)確診為ESCC癌；(2)首次發(fā)現(xiàn)，且以往未接受手術(shù)和放化療治療；(3)經(jīng)系統(tǒng)檢查后無心臟、肺部疾病和糖尿病等慢性疾病史，無肺結(jié)核、肝炎等傳染病史。排除嚴(yán)重感染、自身免疫性疾病、肝腎功能不全及其他腫瘤等相關(guān)疾病。ESCC患者的臨床病理參數(shù)見表1。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2主要試劑及儀器 兔抗人VRK1多克隆抗體、兔抗人BANF1多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗兔二抗(貨號分別為bs-7706R，bs-12571R，bs-0295M，北京博奧森公司)；Trizol試劑、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；引物、山羊血清、無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)、乙醇、雙蒸水、蘇木素染液、DAB顯色液、DEPC水以及一次性耗材(上海生工公司)。5417R臺式高速冷凍離心機(jī)(德國Eppdendorf公司)，安捷倫3005P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Agilent公司)。

1.3免疫組織化學(xué)染色 分別將石蠟包埋的食管癌組織及癌旁組織切為5 μm的薄片，然后黏附在涂層顯微鏡載玻片上，50 ℃烤箱中烤1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇(100%、99%、95%、90%、80%、70%)依次脫水。經(jīng)3%過氧化氫溫育10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶。將切片置于0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中加熱20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫冷卻后用PBS沖洗3次。切片用5%正常山羊血清(1∶10稀釋)室溫封閉30 min。滴加50 μL兔抗人VRK1多

克隆抗體(1∶200稀釋)和50 μL兔抗人BANF1多克隆抗體(1∶200稀釋)，4 ℃過夜，PBS洗滌3次，每次5 min。加入HRP標(biāo)記的小鼠抗兔二抗(1∶1 000稀釋)，37 ℃溫育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min。DAB顯色液顯色5min。自來水沖洗、蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯脫水及中性樹脂固定。陰性對照以兔正常血清(1∶200稀釋)代替一抗，空白對照以PBS代替一抗，陽性對照由抗體公司提供，其余步驟相同。在光學(xué)顯微鏡高倍鏡下觀察100個(gè)細(xì)胞并根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)占該類細(xì)胞總數(shù)的百分比將染色面積依次計(jì)為0(1%)、1(0%～30%)、2(31%～60%)和3(>60%)分；染色強(qiáng)度按顏色由淺入深依次計(jì)為0分(不著色)、1分(淡黃色)、2分(棕黃色)及3分(棕褐色)。計(jì)算染色面積和染色強(qiáng)度的積，0～2分為陰性，3～9分為陽性。所有染色標(biāo)本均由3名研究者分別進(jìn)行判斷，結(jié)果不一致時(shí)共同觀察確定。

1.4RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 食管癌組織和癌旁組織各取50 mg，用Trizol試劑提取總RNA。用核酸定量分析儀測定RNA的純度和濃度，選取吸光度(A260/280 nm)比值在1.8～2.0的總RNA樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照PrimeScript RT試劑盒說明書操作將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA樣本置-20 ℃保存。

1.5引物設(shè)計(jì)及實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR) 根據(jù)GenBank中VRK1、BANF1和GAPDH的序列號(分別為NM_003384.2；NM_003860.3；NM_001256799.2)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物由上海生工公司合成。VRK1上游引物序列：5′-CTACCAA

CGAGCTGCAAAACC-3′，下游引物序列5′-TCACTCC

CAAAGCGATCCATTA-3′，產(chǎn)物大小為153 bp，退火溫度60 ℃。BANF1上游引物序列：5′-TGGCTGAAA

GACACTTGTGG-3′，下游引物序列：5′-CACTCTCGAA

GGCATCCGAAG-3′，產(chǎn)物大小為68 bp，退火溫度58 ℃。GAPDH上游引物序列：5′-GGAGCGAGATCCCT

CCAAAAT-3′，下游引物序列：5′-GGCTGTTGTCATA

CTTCTCATGG-3′，產(chǎn)物大小為197 bp，退火溫度60℃。制備反應(yīng)混合物：以1 μL cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括SYBR Green 12 μL，ROX 校正染料0.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 3 s，60 ℃(VRK1、GAPDH)/58 ℃(BANF1)30 s，72 ℃ 15 s，85 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。在85 ℃下收集熒光信號，用MxPro 3005軟件進(jìn)行熔解曲線分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-△△Ct法計(jì)算待測基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1免疫組化染色檢測VRK1和BANF1蛋白在組織切片中的定位及表達(dá) 高倍鏡下，VRK1主要定位于細(xì)胞核，BANF1染色定位主要定位于細(xì)胞核，少量定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1)。ESCC患者癌組織中 VRK1和BANF1蛋白的陽性率分別為80.8%(97/120)和77.5%(93/120)，明顯高于癌旁組織[26.6%(32/120)，24.1%(29/120)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為70.815，68.286，P均<0.05)。

2.2VRK1和BANF1蛋白的表達(dá)與ESCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 VRK1和BANF1蛋白的表達(dá)與ESCC患者性別、年齡以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，而與腫瘤的臨床分期和分化程度有關(guān)(P<0.05)。見表1。

2.3VRK1和BANF1 mRNA在ESCC患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá) RT-qPCR結(jié)果表明，癌組織中VRK1 mRNA的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(0.88±0.09 vs 0.59± 0.08)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.95，P=0.044)；癌組織中BANF1 mRNA的表達(dá)水平亦高于癌旁組織(0.78±0.08 vs 0.41±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.99，P=0.040)。

3 討論

VRK1是細(xì)胞周期蛋白D1的一個(gè)早期應(yīng)答基因，其可以通過磷酸化修飾的形式參與多種細(xì)胞生理活動(dòng)，如細(xì)胞周期進(jìn)程、染色體凝聚、核膜包膜的分解和重組以及DNA損傷反應(yīng)等[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，VRK1可能在乳腺癌[7]、肝細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌[8]等多種腫瘤中發(fā)揮著促癌作用。Del等[8]和Huang等[9]的研究均發(fā)現(xiàn)VRK1在原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)組織和細(xì)胞系中呈高表達(dá)，并證實(shí)其與美國腫瘤研究聯(lián)合委員會(AJCC)第8版癌癥分期系統(tǒng)中的HCC肝癌分級和不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測了食管鱗癌組織及配對的癌旁組織中VRK1 mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)VRK1在癌組織中過表達(dá)，與上述研究結(jié)果基本一致。本研究通過免疫組化染色法檢測120例患者組織切片中VRK1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示VRK1在低分化組中的陽性率明顯高于中、高分化組，且與腫瘤的TNM分期有關(guān)，表明其與ESCC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，同時(shí)也驗(yàn)證了VRK1的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。

注：A，VRK1在癌旁組織中表達(dá)陰性；B，VRK1在癌組織中表達(dá)陽性；C，BANF1在癌旁組織中表達(dá)陰性；D，BANF1在癌組織中表達(dá)陽性。

圖1 免疫組織化學(xué)染色檢測VRK1和BANF1蛋白的表達(dá)(×100)

BANF1編碼的BAF蛋白可以與雙鏈DNA非特異性結(jié)合，并且可以結(jié)合核膜上含有LEM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，從而促進(jìn)細(xì)胞核重組并將染色質(zhì)召集到核外周。核纖層蛋白lamin-A/C，LAP2α和BAF蛋白在有絲分裂過程中組成蛋白質(zhì)復(fù)合物能夠調(diào)節(jié)有絲分裂紡錘體的組裝和定位[10]。研究表明，BAF蛋白是VRK1蛋白激酶的高親和力底物。Ser4上BAF的磷酸化可解除其結(jié)合DNA的能力并降低其對LEM結(jié)構(gòu)域的親和力，使DNA與核包膜之間連接斷裂從而維持細(xì)胞周期進(jìn)程的正常進(jìn)行[11-12]。本研究亦通過免疫組化染色和RT-qPCR檢測了ESCC組織中BANF1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，結(jié)果顯示其在癌組織中的表達(dá)水平也明顯高于癌旁組織，且與腫瘤的TNM分期和分化程度有關(guān)。以上結(jié)果證實(shí)，BAF蛋白可能通過調(diào)節(jié)DNA與核周蛋白的結(jié)合以及紡錘絲的組裝和定位，使細(xì)胞有絲分裂過程異常進(jìn)行，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)VRK1和BANF1均在ESCC患者癌組織中過表達(dá)，并與分化程度和TNM分期有關(guān)，且BAF蛋白可被VRK1蛋白激酶磷酸化?；诖?，我們猜測在ESCC的發(fā)生和發(fā)展過程中，VRK1和BANF1可能直接或間接地發(fā)揮著協(xié)同作用，但兩者的相互作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外，本實(shí)驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)二者與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P>0.05)，原因可能與標(biāo)本選擇偏倚以及標(biāo)本量不足有關(guān)。今后我們將擴(kuò)大樣本量，對相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)論進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

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2017-07-03)

(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.11.15

河南省科技廳攻關(guān)項(xiàng)目(172102310028)。

王婷婷，1992年生，女，碩士研究生，主要從事腫瘤分子診斷研究。

劉紅春，教授，E-mail：xingyunerliu@163.com。

R735.1

A