曹穎麗，石婷，胡蓉，高戈

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，長沙 410013；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院婦產(chǎn)科，長沙 410008)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

MALAT1在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及研究*

曹穎麗1，石婷1，胡蓉2，高戈1

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，長沙 410013；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院婦產(chǎn)科，長沙 410008)

目的探討肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(MALAT1)在子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis, EMS)中的表達(dá)及其診斷價(jià)值。方法于GCBI平臺(tái)收集并分析EMS相關(guān)樣本基因信息，篩選出MALAT1基因；提取EMS患者及非子宮內(nèi)膜異位癥患者(非EMS)組織及血清樣本中的總RNA， qRT-PCR驗(yàn)證MALAT1基因的表達(dá)水平，并分析其與月經(jīng)周期的關(guān)系，采用ROC曲線分析血清MALAT1鑒別EMS的效能。結(jié)果GCBI平臺(tái)基因信息分析結(jié)果提示,與非EMS組相比，EMS組中MALAT1基因表達(dá)下調(diào)1.35倍(t=-3.27，P<0.01)；EMS患者卵巢囊腫組織及在位內(nèi)膜MALAT1的表達(dá)水平(0.41±0.18，0.61±0.12)均低于非EMS患者子宮內(nèi)膜組織(1.05±0.34)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為5.87和4.48，P<0.01)，但與EMS患者及非EMS患者月經(jīng)周期均無關(guān)(t分別為1.54和1.52，P>0.05)；EMS患者卵巢異位囊腫組織MALAT1的表達(dá)水平低于其在位內(nèi)膜(t=3.77，P<0.01)；EMS患者血清MALAT1表達(dá)水平(0.60±0.18)低于非EMS患者(1.05±0.32)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.18，P<0.01)；ROC曲線下面積(AUCROC)為0.88，當(dāng)cut-off值為0.74時(shí)，MALAT1鑒別EMS的敏感性和特異性分別為82.4%和92%，約登指數(shù)為74.4%。結(jié)論MALAT1的低表達(dá)可能與EMS發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，血清MALAT1水平對(duì)EMS具有一定的鑒別價(jià)值。

卵巢子宮內(nèi)膜異位癥；肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1；差異基因篩選；診斷

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis, EMS)是一種子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))出現(xiàn)在子宮體外的婦科良性疾病，具有種植、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等類似惡性腫瘤的生物學(xué)行為特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript1, MALAT1)可通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程[1]。已知上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在EMS的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[2]，但MALAT1在EMS中的表達(dá)及其功能的研究國內(nèi)少見。本研究通過生物信息學(xué)分析EMS患者中MALAT1基因的差異表達(dá)，并予以驗(yàn)證及分析其與月經(jīng)周期的關(guān)系，探討MALAT1與EMS發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，旨在為EMS的診斷和治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1差異基因篩選

1.1.1差異基因的篩選及基因熱圖的制作 通過GCBI平臺(tái)(https://www.gcbi.com.cn/)收集Affymetrix數(shù)據(jù)庫中EMS相關(guān)樣本數(shù)據(jù)共193例，其中EMS樣本101例，非EMS樣本92例。193例樣本通過HG-U133_Plus_2(Affymetrix GeneChip Human Genome U133_Plus_2)平臺(tái)質(zhì)檢，并利用基因芯片顯著性分析(significance analysis of microarray，SAM)R程序按照Q<0.05，P<0.05，基因差異倍數(shù)>1.2的篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選出EMS組與非EMS組的差異表達(dá)基因。將基因芯片的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Microsoft Excel軟件中并存為txt文本文件。在Cluster 3.0軟件中打開txt文件，對(duì)導(dǎo)入數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，選擇層次聚類分析方法(Hierarchical Clusteriyng Analysis)，縱向?qū)蜻M(jìn)行聚類，橫向?qū)?shí)驗(yàn)處理進(jìn)行聚類，選擇計(jì)算方法為平均連鎖(Average linkage)，聚類完畢后用Treeview打開擴(kuò)展名為CDT的文件，即得到差異表達(dá)的基因熱圖。

1.1.2基因功能富集分析(GO-Analysis) 在GCBI平臺(tái)上對(duì)差異基因進(jìn)行基因功能富集分析(GO-Analysis)，主要涉及生物過程、細(xì)胞組分及分子過程3個(gè)方面，而在差異基因篩選時(shí)，因生物過程提供的信息較多，因此在GCBI平臺(tái)上進(jìn)行GO分析時(shí)，參數(shù)設(shè)置中的“分析類型”應(yīng)選擇生物過程，P<0.05且FDR<0.05。

1.2基因芯片中MALAT1基因的表達(dá)驗(yàn)證

1.2.1研究對(duì)象 收集2016年3月至2017年3月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院婦產(chǎn)科經(jīng)腹腔鏡及病理組織學(xué)檢查確診的46例卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者(EMS組)，年齡(33.5±6.5)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)[3]：(1)腹腔鏡下可見典型的卵巢內(nèi)囊腫，囊內(nèi)聚集陳舊性血液形成的咖啡色黏稠液體。(2)顯微鏡下檢查可見子宮內(nèi)膜腺體，子宮內(nèi)膜間質(zhì)，并存在組織出血或富含含鐵血黃素的巨噬細(xì)胞。選取同期因卵巢成熟性畸胎瘤行腹腔鏡手術(shù)的34例非子宮內(nèi)膜異位癥患者作為非EMS組，年齡(32.5±6.7)歲。所有病例經(jīng)臨床診斷、病理學(xué)或影像學(xué)診斷為卵巢成熟性畸胎瘤。根據(jù)末次月經(jīng)及子宮內(nèi)膜組織學(xué)檢查結(jié)果確定標(biāo)本所處月經(jīng)周期，EMS組中增殖期21例，分泌期25例；非EMS組中增殖期20例，分泌期14例。兩組患者均月經(jīng)規(guī)律，無內(nèi)外科合并癥，術(shù)前6個(gè)月內(nèi)未行放化療及激素類藥物治療，兩組年齡的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審查并認(rèn)可，研究對(duì)象均知情同意。

1.2.2主要儀器及試劑 5415R冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；K5500超微量分光光度計(jì)(北京凱奧公司)；ABI Stepone plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)；超純RNA提取試劑盒(DNase I，康為世紀(jì)公司)；血液總RNA提取試劑盒(天根公司)；RevertAid第一鏈 cDNA合成試劑盒(Thermo公司)；熒光定量PCR試劑(PowerUp SYBR Green Master Mix，Applied Biosystems公司)。

1.2.3標(biāo)本采集及RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄 經(jīng)腹腔鏡手術(shù)活檢及刮宮取得EMS患者卵巢囊腫組織及在位內(nèi)膜、非EMS癥患者子宮內(nèi)膜，迅速置于液氮中保存。RNA提取時(shí)，取各組織30～50 mg進(jìn)行研磨，按照超純RNA提取試劑盒(DNase I)說明書操作提取組織總RNA。于手術(shù)前采集各研究對(duì)象靜脈血5 mL，3 500×g離心15 min,收集上層血清，再按照血液總RNA提取試劑盒說明書提取血清RNA。用K5500超微量分光光度計(jì)檢測提取RNA純度，取吸光度(A260/280 nm)為1.8～2.1之間的樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，樣本置-80 ℃保存；用RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置-20 ℃保存。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)GenBank中MALAT1基因序列號(hào)(378938)及GAPDH基因序列號(hào)(26330)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并送上海生工公司合成。MALAT1上游引物序列：5′-TCATACCTAACCAGGCATAACA-3′，下游引物序列：5′-CTAAGCGAATGGCTTTGTCTCC-3′，產(chǎn)物片段大小為304 bp；GAPDH上游引物序列：5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCT-3′，下游引物為5′-ACTCCGACCTTCACCTTCC-3′，產(chǎn)物片段大小為200 bp。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.75 μL，cDNA 4.5 μL，Rnase-free H2O 4.75 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。使用StepOneTM軟件在72 ℃時(shí)采集熒光信號(hào)，并進(jìn)行熔解曲線分析，以GAPDH為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計(jì)算MALAT1相對(duì)表達(dá)水平，公式ΔΔCt=(EMS組CtMALAT1-EMS組CtGAPDH)-(非EMS組CtMALAT1-EMS組CtGAPDH)。所有的實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.3.1基因芯片差異基因分析 利用SAM R程序按照Q<0.05，P<0.05，基因差異倍數(shù)>1.2的篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選出EMS組與非EMS組的差異表達(dá)基因(其中顯著性Q值對(duì)顯著性P值的校正，一般認(rèn)為Q<0.05差異的可信度較高)。在GO分析中，按照P<0.05且FDR<0.05進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1EMS組與非EMS組差異基因表達(dá) 在GCBI平臺(tái)中，利用SAM R程序按照Q<0.05，P<0.05，基因差異倍數(shù)>1.2的篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選出EMS組與非EMS組的差異表達(dá)基因共9 463個(gè)，其中上調(diào)基因2 326個(gè)，下調(diào)基因7 137個(gè)。MALAT1基因表達(dá)下調(diào)1.35倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.27，P<0.01)。利用Cluster 3.0及Treeview軟件對(duì)EMS組與非EMS組的差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析及對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，結(jié)果見圖1。

注：橫軸表示對(duì)EMS組和非EMS組進(jìn)行聚類，藍(lán)色為EMS組，棕色為非EMS組?？v軸表示基因聚類，紅色代表上調(diào)的差異基因，綠色代表下調(diào)的差異基因，黑色表示無差異，基因差異表達(dá)越顯著，顏色亮度越強(qiáng)。

圖1 EMS與非EMS差異表達(dá)基因熱圖

2.2基因功能富集分析(GO-Analysis) 差異表達(dá)基因通過GO分析，發(fā)現(xiàn)共有903個(gè)達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)要求的生物過程，按照P值及FDR值由小到大排列，EMS組與非EMS組差異基因主要富集于基因轉(zhuǎn)錄過程，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程，小分子代謝過程，基因表達(dá)過程，細(xì)胞周期過程，細(xì)胞凋亡過程，信號(hào)傳導(dǎo)過程，RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程。其中最為顯著的前10個(gè)生物學(xué)過程見表1。

表1 EMS組與非EMS組差異基因功能富集結(jié)果

2.3MALAT1在EMS組織中的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示MALAT1在EMS患者卵巢囊腫組織中表達(dá)量為(0.41±0.18)，低于EMS患者子宮內(nèi)膜(1.05±0.34)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.87，P<0.01)；MALAT1在EMS在位內(nèi)膜組織中的表達(dá)量(0.61±0.12)低于非EMS患者子宮內(nèi)膜(1.05±0.34)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.48,P<0.01)。MALAT1的表達(dá)水平在EMS患者卵巢囊腫組織低于其在位內(nèi)膜中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.77，P<0.01)。EMS患者在位內(nèi)膜增殖期(21例)與分泌期(25例)MALAT1的表達(dá)水平分別為(0.66±0.11)和(0.56±0.12)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.54，P>0.05)。非EMS增殖期(20例)和分泌期(14例)MALAT1的表達(dá)水平分別為(1.09±0.11)和(0.84±0.12)，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.52，P>0.05)。

2.4MALAT1在EMS患者血清中的表達(dá)MALAT1在46例EMS患者血清標(biāo)本中的表達(dá)水平(0.60±0.18)低于34例非EMS患者(1.05±0.32)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.18，P<0.01)。血清MALAT1鑒別EMS組(46例)與非EMS組(34例)的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.88(95%CI:0.759～0.997)。當(dāng)cut-off值為0.74時(shí)，其敏感性和特異性分別為82.4%和92%，約登指數(shù)為74.4%。

3 討論

EMS是一種雌激素依賴性疾病，研究發(fā)現(xiàn)，雌激素誘導(dǎo)下的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，參與EMS發(fā)生、發(fā)展[2]。MALAT1是一種在轉(zhuǎn)錄前后參與基因表達(dá)調(diào)控的長鏈非編碼RNA。研究表明，MALAT1在多種腫瘤中存在過表達(dá)[4]。如在子宮內(nèi)膜癌[5]、乳腺癌[6-7]和卵巢癌[8]等雌激素依賴性腫瘤中，MALAT1表達(dá)下調(diào)，并可通過調(diào)節(jié)EMT參與腫瘤的生長，遷移和侵襲過程。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，MALAT1在EMS中也存在表達(dá)下調(diào)，且對(duì)基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在基因轉(zhuǎn)錄及調(diào)控過程。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證MALAT1在EMS組中的表達(dá)水平明顯低于非EMS組。由此推測，MALAT1可能通過調(diào)控某些基因的表達(dá)參與EMS的發(fā)生。但其是否也通過調(diào)控上EMT參與EMS有待進(jìn)一步的研究。

研究表明，EMS異位病灶組織不但有雌孕激素受體的表達(dá)還能產(chǎn)生雌激素，形成局部高雌激素狀態(tài)[9]。在一項(xiàng)乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，高濃度的雌激素可降低乳腺癌中MALAT1的表達(dá)[10]。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)EMS患者卵巢囊腫組織MALAT1的表達(dá)水平低于其在位內(nèi)膜較為一致。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，在EMS及非EMS患者的在位子宮內(nèi)膜中MALAT1的表達(dá)與月經(jīng)周期無關(guān)。這可能與EMS患者在位子宮內(nèi)膜中雌激素受體已不存在周期性變化有關(guān)，而正常子宮內(nèi)膜中雖雌激素受體水平與月經(jīng)周期有關(guān)，但其雌激素水平明顯低于EMS患者[11]。因此，高濃度的雌激素可以影響MALAT1表達(dá)，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

目前在EMS診斷中，腹腔鏡是金標(biāo)準(zhǔn)，但其屬于創(chuàng)傷性操作且費(fèi)用昂貴。而血清CA125雖可作為一種無創(chuàng)、相對(duì)敏感的診斷手段，但其對(duì)輕型的EMS分期診斷不敏感且缺乏特異性[12]。本研究采用qRT-PCR法檢測血清MALAT1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EMS患者血清MALAT1水平均低于非EMS患者，ROC曲線分析表明，血清MALAT1的表達(dá)水平對(duì)EMS的鑒別效能較為滿意，提示血清MALAT1對(duì)EMS具有鑒別價(jià)值。

綜上所述，MALAT1在EMS的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要意義，血清MALAT1對(duì)EMS的診斷具有較高的敏感性和特異性。但本研究中MALAT1在EMS具體作用機(jī)制尚不清楚，是否存在雌激素-MALAT1-內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相互作用關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。且本研究對(duì)象僅為卵巢異位囊腫患者，后續(xù)還需收集其他類型異位癥標(biāo)本，擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步分析MALAT1表達(dá)量與EMS患者AFS分期的關(guān)系，及MALAT1能否其他血清標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用以提高EMS鑒別診斷的效能。

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2017-09-12)

(本文編輯：許曉蒙)

ExpressionandresearchofMALAT1inendometriosis

CAOYing-li1,SHITing1,HURong2,GAOGe1

(1.FacultyofLaboratoryMedicine,XiangyaMedicalCollegeofCentralSouthUniversity,Changsha410013,Hunan; 2.DepartmentofObstetricsandGynecology,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,Hunan,China)

ObjectiveTo investigate the expression of metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 (MALAT1) in endometriosis (EMS) and its diagnostic value.MethodsThe information of EMS gene expression was collected from Gene-Cloud of Biotechnology Information (GCBI) and analyzed, in whichMALAT1 gene was screened out accordingly. The total RNAs were extracted from tissues and serum samples of the patients with ovarian endometriosis and non-endometriosis and the expression ofMALAT1 was detected by real-time quantitative PCR. The correlation betweenMALAT1 expression level and menstrual cycle was analyzed. The differential diagnostic efficacy of serumMALAT1 levels was analyzed by receiver operating characteristic (ROC) curve.ResultsCompared with the non-EMS group the expression ofMALAT1 gene was down-regulated by 1.35-fold (t=-3.27，P<0.01) in EMS group according to gene information analysis of GCBI. The relative expression levels ofMALAT1 in ectopic and eutopic endometrium of patients with ovary endometriosis (0.41±0.18 and 0.61±0.12) were significantly lower than those in non-endometriosis patients (1.05±0.34,t=5.87 and 4.48,P<0.01). However, the expression level ofMALAT1 was not related with menstrual cycle of the patients with ovarian endometriosis and non-endometriosis (t=1.54 and 1.52,P>0.05). The expression ofMALAT1 in ectopic ovarian cysts was significantly lower than that in eutopic endometrium of ovary endometriosis (t=3.77,P<0.01). The relative expression of serumMALAT1 in ovary endometriosis (0.60±0.18) was significantly lower than that in non-endometriosis (1.05±0.32,t=5.18,P<0.01). The area under the curve (AUCROC) was 0.88. When the cut-off value of serumMALAT1 level was set as 0.74, the sensitivity and specificity of expression level ofMALAT1 were 82.4% and 92% respectively, and Youden′s index was 74.4%.ConclusionLow expression ofMALAT1 in endometriosis may be related with occurrence and development of endometriosis. SerumMALAT1 level may have certain differential diagnostic value for EMS.

ovarian endometriosis; lung adenocarcinoma metastasis-related transcription factor 1; differential gene screening; diagnosis

10.13602/j.cnki.jcls.2017.11.12

湖南省自然科學(xué)青年基金(2017JJ3483)。

曹穎麗，1987年生，女，碩士研究生，主要從事臨床疾病分子診斷研究。

高戈，博士，講師，E-mail：ggboxy@163.com。

R711.71

A