侯云龍++高淑芹++馬曉萍++陳健++邱紅梅++王躍強

摘 要：大豆的共生固氮能力得益于根瘤，根瘤數(shù)與固氮效率是典型的數(shù)量性狀受多基因調(diào)控。目前，已經(jīng)在大豆中克隆到結(jié)瘤因子（Nodular Factor，NF）的關(guān)鍵受體，以及一些在結(jié)瘤信號傳導(dǎo)途徑中的分子組分，這些組分涉及到結(jié)瘤基因、肽類激素、受體激酶和小的信號代謝產(chǎn)物。其中部分基因的功能及作用機理得以闡明，參與的共生固氮途徑及部分節(jié)點也已明晰。

關(guān)鍵詞：大豆根瘤；共生固氮；機制研究；進展

中圖分類號：S-1 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20171132011

共生固氮是一個極其復(fù)雜的生物過程，它是由根瘤菌與寄主植物互作產(chǎn)生的，主要過程為寄主根部產(chǎn)生類黃酮，吸引根瘤菌附著于根毛，產(chǎn)生并釋放NF，被寄主的NF受體識別，產(chǎn)生鈣峰信號—結(jié)瘤信號，根毛變形彎曲包裹根瘤菌，根瘤菌侵入后通過宿主植物中所形成的一些管狀結(jié)構(gòu)達到宿主根的皮層，形成侵入線。隨后，皮層細胞進行有絲分裂，繼而形成根瘤原基。經(jīng)過發(fā)育，成熟的根瘤即可固氮，當(dāng)根瘤達到一定數(shù)量時寄主會產(chǎn)生信號“Q”，傳導(dǎo)到莖，莖部受體接收信號，產(chǎn)生細胞分裂素，傳導(dǎo)回根部，終止結(jié)瘤[1]。在這個過程中，涉及到寄主植物的多個基因，主要包括調(diào)控根瘤原基形成的基因、參與根瘤發(fā)育的基因、根瘤自我調(diào)控途徑基因以及固氮相關(guān)的基因。

1 調(diào)控根瘤元基形成的基因

經(jīng)過攻關(guān)已初步解析了豆科植物根瘤形成的遺傳機制?，F(xiàn)已在百脈根、苜蓿、大豆中克隆了NF受體1（NFR1）和受體5（NFR5）基因，為編碼跨膜的Lys-M-型絲氨酸/蘇氨酸受體激酶。在百脈根中發(fā)現(xiàn)一個與NFR5互作的小GTP酶ROP6，其對侵入線形成及結(jié)瘤過程均具有正調(diào)控作用[2，3]。NFR1和NFR5形成異源二聚體接收NF，啟動一系列的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，包括質(zhì)膜上受體激酶（DMI2、SYM19、NORK）的表達，以及離子通道蛋白（DMI1）等的表達，從而誘導(dǎo)鈣峰的產(chǎn)生以及根毛的彎曲變形[4，5]。依賴鈣離子蛋白的激酶（DMI3）和GRAS-家族轉(zhuǎn)錄因子NSP1和NSP2基因也被克隆，處于NFR和DM2、DM1等基因的下游對胞質(zhì) Ca2+濃度變化產(chǎn)生響應(yīng)[6]。轉(zhuǎn)錄因子NIN也在侵染線和根瘤原基中起著重要的作用，它可能與NSP1和NSP2聯(lián)合在一起，共同調(diào)節(jié)表皮中結(jié)瘤基因的表達和結(jié)瘤過程[7]。

除了鈣離子通道蛋白參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)外，在百脈根中發(fā)現(xiàn)共生信號鉀離子通道蛋白基因：2個同源基因Castor和Pollux，它們可以彌補鉀離子滲透所產(chǎn)生的電荷不平衡，是細胞核周圍鈣離子激增所必需的，其中Castor 定位于核膜上[8]。這項成果表明：除了上述根瘤共生體信號通路元件，還存在其他與共生體相關(guān)的信號元件。無論結(jié)瘤信號怎樣傳導(dǎo)，最終都會使早期結(jié)瘤基因ENOD40表達，進而形成根瘤。ENOD40基因編碼含12個氨基酸的多肽A和24個氨基酸的多肽B。多肽A 通過二硫鍵共價與蔗糖合酶93ku亞基上的一個半胱氨酸結(jié)合，多肽B的結(jié)合位點尚不清楚。蔗糖合酶是蔗糖代謝的重要組成部分，蔗糖的裂解是植物固氮的關(guān)鍵一步，也是根瘤形成的先決條件[9]。

2 參與根瘤發(fā)育的基因

根瘤原基形成后，通過發(fā)育可以分別形成無效根瘤和有效根瘤。Rj2控制大豆與根瘤菌USDA7、USDA14和USDA112發(fā)育形成無效根瘤。無效結(jié)瘤Rj2基因廣泛存在于我國東北大豆中，無效結(jié)瘤率為64%，導(dǎo)致大豆植株干重及根瘤固氮酶活性下降，并產(chǎn)生缺綠病。顯性基因Rj4也控制大豆與根瘤菌USDA33發(fā)育形成無效根瘤。目前通過精細定位及原位克隆已獲得該基因Glyma.01g165800-D，其編碼類甜蛋白。通過CRISPR/Cas9-based基因編輯敲除該基因，有效根瘤數(shù)顯著增加[10]。通過對大豆基因組分析及根瘤不同發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組測序，周新安課題組（2016， 2017）獲得了調(diào)控根瘤發(fā)育基因Glyma.15G227500[11]和延遲根瘤衰老的基因Glyma18g12240[12]，均編碼半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Cystatin）。通過基因過表達分析，轉(zhuǎn)Glyma.15G227500的植株根瘤數(shù)增加，轉(zhuǎn)Glyma18g12240的根瘤衰老減慢。

目前已在百脈根中克隆到的調(diào)控根瘤發(fā)育的基因，包括硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白、錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白、無效結(jié)瘤基因、高檸檬酸合成酶、鐵轉(zhuǎn)運蛋白、突觸融合蛋白、檸檬酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白、外排蛋白等基因 [13，14]。但基因間的互作及調(diào)控機制仍未知。在苜蓿中克隆到的調(diào)控根瘤發(fā)育基因分別為Kruppel-like 鋅指蛋白、HLH類轉(zhuǎn)錄因子、ERF類轉(zhuǎn)錄因子Mt-EFD、C2H2類轉(zhuǎn)錄因子Mt-RSD [15]。其中，Mt-RSD在苜蓿結(jié)瘤后6d在根瘤中特異表達，且在的侵染區(qū)的表達量最高。苜蓿rsd-1和rsd-2突變體的Mt-RSD基因不能正常表達翻譯，導(dǎo)致根瘤原基不能發(fā)育為成熟的根瘤。Mt-RSD通過抑制突觸小泡膜基因Mt-VAMP721a（Medtr4g022570）的表達，而調(diào)控根瘤的發(fā)育。

3 根瘤自我調(diào)控途徑基因

根瘤形成會耗費寄主能量，數(shù)目過多將對其生長造成不利的影響。因此，在長期進化中已經(jīng)發(fā)展出1套自主調(diào)控機制（Autoregulation of Nodulation，AON）。AON是在根瘤發(fā)育過程中通過合成一個衍生于根的信號“Q”來參與從根—莖的長距離信號傳遞。最近的研究表明，Q可能是一種屬于CLAVATA3/ Endosperm-surrounding region （CLE）家族多肽[16]。根瘤達到一定數(shù)量時，CLE基因表達，形成小多肽分子，自根向地上運輸，并作為富含亮氨酸受體激酶（LRR-RLK）的配體在莖部與LRR-RLK互作并使之激活。目前已知的LRR-RLK家族成員主要有GmNARK、LjHAR1和MtSUNN，與擬南芥CLV1有著極高的序列同源性。激活態(tài)的類受體蛋白激酶可能介導(dǎo)合成相應(yīng)的信號分子，這些信號分子通過韌皮部被運送至根部，調(diào)控根部結(jié)瘤的數(shù)量和發(fā)生位置。endprint

Yan等（2013）發(fā)現(xiàn)過表達mi R172或預(yù)測的靶基因可以相應(yīng)地增加或減少結(jié)瘤的數(shù)目和固氮酶的活性，從而證明了 mi R172 在大豆根系結(jié)瘤及共生固氮過程中的重要生物學(xué)功能[17]。遺傳學(xué)實驗證明了mi R172c正向調(diào)控大豆結(jié)瘤的早期侵染、根瘤原基發(fā)生發(fā)育和最終的結(jié)瘤數(shù)目。Wang等（2014）發(fā)現(xiàn)mi R172c 主要是通過剪切其關(guān)鍵的靶基因GmNNC1發(fā)揮作用。GmNNC1編碼一個AP2 家族的轉(zhuǎn)錄抑制子，直接結(jié)合在1個重要的早期結(jié)瘤基因ENOD40的啟動子上，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性，實現(xiàn)對結(jié)瘤數(shù)目的調(diào)控。實驗結(jié)果證明，miR172c 不僅是NF信號通路中的關(guān)鍵調(diào)控組分，其表達還受到一個AON信號通路的抑制。mi R172c有可能是整合NF和AON信號通路的關(guān)鍵節(jié)點。

4 固氮相關(guān)的基因

在固氮開始時和之后，表達的植物基因稱為晚期結(jié)瘤基因。如豆血紅蛋白（Lb）、谷氨酰胺合成酶（GS）等基因與固氮密切相關(guān)。研究最多的是豆血紅蛋白基因，為固氮過程中固氮酶兼氧所需?，F(xiàn)已鑒定出了4個Lb基因，基因結(jié)構(gòu)已解析，但調(diào)控機制未知。Lb基因及別的晚期結(jié)瘤基因，都只特異的在根瘤中轉(zhuǎn)錄，并且多數(shù)晚期結(jié)瘤基因似乎與豆血紅蛋白是協(xié)同表達的。GS催化氮素同化反應(yīng)的第一步，在氮素同化中起著極為關(guān)鍵的作用。根瘤固氮首先是在類菌體中將N2還原為NH4+，在GS的作用下，將植物吸收的無機態(tài)氨轉(zhuǎn)變成有機態(tài)的谷氨酸和谷氨酰胺，并在一系列酶的作用下形成酰脲向地上運輸，因此GS基因是根瘤固氮的關(guān)鍵酶基因之一。目前，僅有GS基因在不同施肥條件下的表達分析，未見其固氮效率調(diào)控機制的報道。

除以上兩類基因外，共生血紅蛋白也與共生固氮有關(guān)。共生血紅蛋白是血紅蛋白的1種，在促進氧擴散的同時又能保持類菌體周圍的低氧環(huán)境，從而保護對氧敏感的固氮酶活性，缺少豆血紅蛋白的根瘤沒有固氮活性。

目前，對宿主植物根瘤原基形成的遺傳分析（NF信號體系）、根瘤發(fā)育基因的克隆、AON途徑的解析及固氮相關(guān)基因的分離，為共生固氮分子遺傳機制的研究打開了一扇大門。但是，大部分基因在共生固氮過程中的具體作用并不完全清楚。而且，目前對參與共生固氮的調(diào)控基因仍然知之甚少。無疑包括共生早期信號分子的分離及其功能研究仍將繼續(xù)是共生領(lǐng)域的研究熱點，而隨后的共生過程如侵入線形成、根瘤菌的進入與釋放、根瘤的發(fā)育、共生固氮等現(xiàn)象的探明也非常令人期待，這將為最終建立1個完整明確的共生固氮的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供依據(jù)。

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作者簡介：侯云龍（1982-），男，吉林省公主嶺市，助理研究員，大專，主要從事大豆種質(zhì)資源鑒定與創(chuàng)新研究。endprint