張琳，陸超，李天宇

(1無(wú)錫市兒童醫(yī)院，江蘇無(wú)錫214023；2江蘇省人民醫(yī)院)

急性T淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA T-ALL-R-LncR1的發(fā)現(xiàn)、鑒定及其功能研究

張琳1，陸超2，李天宇1

(1無(wú)錫市兒童醫(yī)院，江蘇無(wú)錫214023；2江蘇省人民醫(yī)院)

目的對(duì)新發(fā)現(xiàn)的急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA進(jìn)行鑒定并研究其功能。方法①提取T-ALL Jurkat細(xì)胞RNA進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了一種新的T-ALL相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA，命名為T-ALL-R-LncR1。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和瓊脂糖凝膠電泳法觀察Jurkat細(xì)胞和T-ALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中T-ALL-R-LncR1的表達(dá)情況。②將體外培養(yǎng)的T-ALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組、空質(zhì)粒組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染T-ALL-R-LncR1小干擾RNA(siRNA)，空質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒，對(duì)照組不轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h時(shí)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞T-ALL-R-LncR1相對(duì)表達(dá)量。轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)用CCK-8法觀察各組細(xì)胞增殖情況(以O(shè)D450表示)，轉(zhuǎn)染48 h用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)算各組細(xì)胞凋亡率。結(jié)果① T-ALL-R-LncR1具有原癌基因特性，在人T-ALL Jurkat細(xì)胞及T-ALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中高表達(dá)。用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR法從Jurkat細(xì)胞及急性T淋巴細(xì)胞白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞中獲得PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果符合T-ALL-R-LncR1。測(cè)序結(jié)果證實(shí)PCR產(chǎn)物為T-ALL-R-LncR1。②實(shí)驗(yàn)組、空質(zhì)粒組和對(duì)照組T-ALL-R-LncR1相對(duì)表達(dá)量分別為0.79±0.18、 1.12±0.08和1。實(shí)驗(yàn)組骨髓單個(gè)核細(xì)胞 T-ALL-R-LncR1相對(duì)表達(dá)量低于空質(zhì)粒組和對(duì)照組(P均<0.05)，空質(zhì)粒組和對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞 T-ALL-R-LncR1相對(duì)表達(dá)量相比P>0.05。轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組骨髓單個(gè)核細(xì)胞OD450值均低于空質(zhì)粒組和對(duì)照組(P均<0.05)，空質(zhì)粒組和對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞OD450相比P均>0.05。轉(zhuǎn)染48 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組、空質(zhì)粒組、對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為38.67%±1.32%、1.80%±0.14%、1.79%±0.13%。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率高于空質(zhì)粒組和對(duì)照組(P均<0.05)，空質(zhì)粒組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率相比P>0.05。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)了一種具有原癌基因特性的新T-ALL相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA，即T-ALL-R-LncR1。沉默T-ALL-R-LncR1可以促進(jìn)T-ALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞凋亡并抑制其增殖。

急性T淋巴細(xì)胞白血??；長(zhǎng)鏈非編碼RNA；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)在兒童血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的發(fā)病率約為15%,病死率約20%[1]。目前T-ALL的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)參與了腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡調(diào)控等過程，并可通過表觀遺傳調(diào)控的方式影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，可能成為新型腫瘤標(biāo)志物或腫瘤治療的靶點(diǎn)[2，3]。為尋找T-ALL相關(guān)LncRNA，本研究于2012年3月對(duì)T-ALL細(xì)胞株Jurkat進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序，將新發(fā)現(xiàn)的T-ALL相關(guān)LncRNA命名為T-ALL-R-LncR1，并觀察了轉(zhuǎn)染T-ALL-R-LncR1 siRNA對(duì)T-ALL患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖、凋亡的影響，旨在明確T-ALL-R-LncR1在T-ALL中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 Jurkat細(xì)胞株來(lái)源及T-ALL患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞制備 Jurkat細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。抽取無(wú)錫市兒童醫(yī)院血液科收治的1例T-ALL患兒的骨髓2 mL，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞Ficoll分離液分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用含100 g/L FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，生長(zhǎng)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究已獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家長(zhǎng)簽署知情同意書。

1.2 T-ALL相關(guān)LncR的檢測(cè)及鑒定 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Jurkat細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔106個(gè)細(xì)胞。每孔加入1 mL TRIzol裂解細(xì)胞，用移液器(去RNA酶)輕輕來(lái)回吹吸裂解細(xì)胞，將裂解后的細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移至無(wú)菌無(wú)RNA酶的1.5 mL EP管，置于干冰箱中運(yùn)送至深圳華大基因公司進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)由華大基因公司進(jìn)行生物信息分析，獲得一種T-ALL相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，并命名為T-ALL-R-LncR1。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)T-ALL-R-LncR1在Jurkat細(xì)胞及FALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)情況。引物設(shè)計(jì)應(yīng)用Primer5.0軟件。T-ALL-R-LncR1上游引物序列：5′-TGCCAGCACGGCTAGGATAAA-3′，下游引物序列:5′-GTGAAGGAAGCCTGGTTTTGA-3′；內(nèi)參照GAPDH上游引物:5′-GGTCGGAGTCAACGGATT-TGGTCG-3′，下游引物5′-CCTCCGACGCCTGCTTCA-CCAC-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性1 min，然后98 ℃變性30 s、64 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，熱循環(huán)(變性、退火和延伸)35次，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小，部分PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.3 轉(zhuǎn)染T-ALL-R-LncR1 siRNA對(duì)T-ALL患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖、凋亡的影響 將體外培養(yǎng)的T-ALL患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1.5 mL培養(yǎng)基含(3～5)×105個(gè)細(xì)胞。設(shè)實(shí)驗(yàn)組、空質(zhì)粒組和對(duì)照組，每組6孔。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染T-ALL-R-LncR1小干擾RNA(siRNA)，空質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒，對(duì)照組不轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法參照LipofectamineTM2000說(shuō)明書。

1.3.1 各組骨髓單個(gè)核細(xì)胞T-ALL-R-LncR1相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。轉(zhuǎn)染24 h后收集各組細(xì)胞，采用TRIzol一步法提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。T-ALL-R-LncR1上游引物序列5′-GAAGGCGCCATTTCTCTGTG-3′，下游引物序列5′-AGATGTGCGGGTCTTTTCCG-3′；內(nèi)參照β-actin上游引物序列5′-ACTGGAACGGTGAAGGTGAC-3′，下游引物序列5′-AGAGAAGTGGGGTGGCTTTT-3′。反應(yīng)體系為10 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算T-ALL-R-LncR1相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 各組骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖情況觀察 采用CCK-8法。轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)每孔加入10 μL CCK-8，輕輕混勻，37 ℃條件下孵育2 h，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度(OD450)值，用其表示各組骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖情況。

1.3.3 各組骨髓單個(gè)核細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞術(shù)。轉(zhuǎn)染48 h，收集各組細(xì)胞懸液至2.0 mL的EP管，1 000 r/min離心5 min，棄上清。用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL，100 μL細(xì)胞懸液中加5 μL AnnexinV-APC和5 μL放線菌素D(7AAD),混勻，避光，室溫放置15 min后每個(gè)樣品加入400 μL Binding buffer，振蕩混勻后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 T-ALL-R-LncR1的特征及其在Jurkat細(xì)胞、T-ALL骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)情況 T-ALL-R-LncR1由2個(gè)外顯子組成，2個(gè)外顯子的大小分別是338、1 130 bp，這2個(gè)外顯子在6號(hào)染色體上的起點(diǎn)和終點(diǎn)分別是147176058、147177525，使用RNAFold軟件對(duì)T-ALL-R-LncR1進(jìn)行了深層次的分析，發(fā)現(xiàn)其有穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但是在其開放閱讀框架(ORFs)5′端的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)缺乏Kozak序列，它的ORFs不能翻譯成蛋白質(zhì)。用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR法從Jurkat細(xì)胞及T-ALL骨髓單個(gè)核細(xì)胞中獲得PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果符合T-ALL-R-LncR1。送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序的PCR產(chǎn)物證實(shí)為T-ALL-R-LncR1。

2.2 各組骨髓單個(gè)核細(xì)胞T-ALL-R-LncR1相對(duì)表達(dá)量比較 實(shí)驗(yàn)組、空質(zhì)粒組和對(duì)照組T-ALL-R-LncR1相對(duì)表達(dá)量分別為0.79±0.18、 1.12±0.08和1。實(shí)驗(yàn)組骨髓單個(gè)核細(xì)胞 T-ALL-R-LncR1相對(duì)表達(dá)量低于空質(zhì)粒組和對(duì)照組(P均<0.05)，空質(zhì)粒組和對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞 T-ALL-R-LncR1相對(duì)表達(dá)量相比P>0.05。

2.3 各組骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖情況比較 相同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組骨髓單個(gè)核細(xì)胞OD450值低于空質(zhì)粒組和對(duì)照組(P均<0.05)，空質(zhì)粒組和對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞OD450值相比P>0.05。見表1。

表1 各組轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)骨髓單個(gè)核細(xì)胞OD450值比較

注：與對(duì)照組、空質(zhì)粒組相比，*P均<0.05。

2.4 各組骨髓單個(gè)核細(xì)胞凋亡率比較 轉(zhuǎn)染48 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組、空質(zhì)粒組、對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為38.67%±1.32%、1.80%±0.14%、1.79%±0.13%。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率高于空質(zhì)粒組和對(duì)照組(P均<0.05)，空質(zhì)粒組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率相比P>0.05。

3 討論

LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度200 nt～100 kb的非編碼RNA，其表達(dá)具有時(shí)空特異性，是不具備編碼蛋白功能的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[4]。目前越來(lái)越多的研究證實(shí)，LncRNA以RNA的形式在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種層面調(diào)控基因的表達(dá)水平，它既可抑制蛋白編碼基因的表達(dá)，也可活化某些蛋白編碼基因表達(dá)。其作用機(jī)制亦多種多樣，如介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)及組蛋白修飾、影響下游基因的表達(dá)、影響轉(zhuǎn)錄因子活化與轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)特定蛋白質(zhì)的活性等[5]。多種腫瘤中存在LncRNA的異常表達(dá)，尤其是惡性腫瘤[6]。在腫瘤細(xì)胞中，某些特定LncRNA的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生特異性改變，在結(jié)腸癌細(xì)胞中OCC1基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯增高， OCC1 RNA具有明顯的組織特異性，且在正常黏膜中無(wú)或很少表達(dá)[7]。在前列腺癌中，DD3RNA只在前列腺組織中被特異性轉(zhuǎn)錄，約90%的前列腺癌患者中存在其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平增高[8]，故DD3RNA被作為特異性的標(biāo)志物用于前列腺癌的診斷[9]。在小細(xì)胞肺癌組織中MALAT-1與肺癌轉(zhuǎn)移形式的特殊關(guān)聯(lián)使其成為肺癌患者診斷的標(biāo)志物[10]。HOTAIR與乳腺癌、肝癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)[11]。Eis等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可由淋巴細(xì)胞中LncRNA BIC RNA序列加工而成。但目前為止，臨床上對(duì)T-ALL相關(guān)LncRNA的研究較少。

本研究我們通過高通量測(cè)序獲得了一個(gè)新的T-ALL相關(guān)LncRNA，將其命名為T-ALL-R-LncR1。T-ALL-R-LncR1由2個(gè)外顯子組成，2個(gè)外顯子的大小分別是338、1 130 bp，這2個(gè)外顯子在6號(hào)染色體上的起點(diǎn)和終點(diǎn)分別是147176058、147177525，使用RNAFold軟件對(duì)T-ALL-R-LncR1進(jìn)行深層次的分析發(fā)現(xiàn)，其有穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但是在其開放閱讀框架(ORFs)5′端的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)缺乏Kozak序列，它的ORFs不能翻譯成蛋白質(zhì)。這些表明T-ALL-R-LncR 具有原癌基因特點(diǎn)。本研究用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和瓊脂糖凝膠電泳法觀察Jurkat細(xì)胞和T-ALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中T-ALL-R-LncR1的表達(dá)情況，結(jié)果電泳結(jié)果符合T-ALL-R-LncR1。送去測(cè)序的PCR產(chǎn)物也被證實(shí)為T-ALL-R-LncR1。表明T-ALL患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中存在T-ALL-R-LncR1表達(dá)，T-ALL-R-LncR1可能是T-ALL的相關(guān)LncRNA。

為進(jìn)一步明確T-ALL-R-LncR1與T-ALL的相關(guān)性，并研究T-ALL-R-LncR1在T-ALL發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究觀察了轉(zhuǎn)染T-ALL-R-LncR1 siRNA對(duì)T-ALL患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖、凋亡的影響，結(jié)果顯示，相對(duì)于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組，轉(zhuǎn)染T-ALL-R-LncR1 siRNA的實(shí)驗(yàn)組T-ALL患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞T-ALL-R-LncR1相對(duì)表達(dá)量降低，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞增殖能力下降。表明T-ALL-R-LncR1確實(shí)參與了T-ALL患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控。

搜索國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)庫(kù)，筆者并未發(fā)現(xiàn)類似內(nèi)容的文獻(xiàn)。故本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的與T-ALL有關(guān)的LncRNA：T-ALL-R-LncR1；沉默T-ALL-R-LncR1能抑制T-ALL患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖，促進(jìn)T-ALL患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞凋亡。T-ALL-R-LncR1是T-ALL治療的一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。但是本研究并未涉及T-ALL-R-LncR1調(diào)控T-ALL患兒骨髓單個(gè)核增殖、凋亡的機(jī)制，今后我們將進(jìn)行這方面的研究。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81170487)；無(wú)錫市衛(wèi)生計(jì)生委“科教強(qiáng)衛(wèi)工程”醫(yī)學(xué)青年人才項(xiàng)目資助(QNRC014)；無(wú)錫市衛(wèi)生局重大項(xiàng)目(Z201302)。

李天宇(E-mail: wxlty999@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.022

R733.71

B

1002-266X(2017)40-0042-03

2016-08-11)