劉洋，李艷菊，唐東昕，王寧，劉振華，王飛清

(1貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，貴陽550001；2貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院；3貴州省骨科醫(yī)院；4貴州省人民醫(yī)院)

天門冬對氟中毒大鼠認知行為能力的影響及機制

劉洋1，李艷菊2，唐東昕1，王寧3，劉振華4，王飛清1

(1貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，貴陽550001；2貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院；3貴州省骨科醫(yī)院；4貴州省人民醫(yī)院)

目的探討天門冬水煎劑灌胃對氟中毒大鼠認知行為能力的影響，并探討其作用機制。方法將60只SD大鼠分成5組各12只，模型對照組和天門冬低、中、高劑量組給予含氟50 mg/kg的玉米飼料制作氟中毒大鼠模型，對照組給予普通飼料喂養(yǎng)。天門冬低、中、高劑量組在大鼠食用含氟飼料當天開始，每天給予天門冬水煎劑3、6、12 g/kg灌胃1次，連續(xù)90 d。實驗結(jié)束前7 d采用Morris水迷宮法檢測各組大鼠認知行為能力；分離血清和腦組織，用黃嘌呤氧化酶法測定血清和腦組織中SOD活性，硫代巴比妥酸法測定血清和腦組織中MDA含量。結(jié)果空間探索實驗顯示，模型對照組和天門冬低、中、高劑量組大鼠首次穿越平臺時間大于對照組，穿越平臺次數(shù)和穿越平臺區(qū)時間少于對照組，天門冬高劑量組大鼠首次穿越平臺時間少于中、低劑量組，穿越平臺次數(shù)和穿越平臺區(qū)時間高于中、低劑量組(P均<0.05)。模型對照組和天門冬低、中、高劑量組大鼠血清和腦組織SOD水平低于對照組，模型對照組低于天門冬低、中、高劑量組，天門冬高劑量組高于中、低劑量組(P均<0.05)。模型對照組和天門冬低、中、高劑量組大鼠血清和腦組織MDA水平高于對照組，模型對照組高于天門冬低、中、高劑量組，天門冬高劑量組低于中、低劑量組(P均<0.05)。結(jié)論氟中毒可導致大鼠血清及腦組織中氧化與抗氧化水平紊亂，影響大鼠的認知行為能力；天門冬水煎劑灌胃可調(diào)整氟中毒大鼠血清及腦組織中的氧化水平與抗氧化水平，改善大鼠的認知行為能力。

氟中毒；天門冬；丙二醛；超氧化物歧化酶；氧化應激；認知行為能力；腦損傷；中藥

流行病學調(diào)查顯示，氟化物蓄積于腦組織可引起大腦損傷、智力下降、學習記憶功能損害及行為障礙[1～4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，氟引起腦損傷與體內(nèi)的自由基、脂質(zhì)過氧化物水平明顯相關(guān)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，中草藥天門冬具有抗氧化、抗衰老、抗凋亡等作用[6～8]，而天門冬能否通過較強的清除氧化應激產(chǎn)物達到拮抗氟的毒性，目前尚無定論。2016年12月～2017年2月，我們構(gòu)建了氟中毒大鼠模型，觀察天門冬對大鼠認知行為能力的影響，并探討其作用機制，為中草藥防治地方性氟中毒腦損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量90～100 g，由貴州醫(yī)科大學動物實驗中心提供，適應性喂養(yǎng)1周后用于實驗。天門冬購于貴陽仁濟堂，取天門冬50 g加入500 mL水，沸水煎煮2次，煮沸1 h，抽濾，用水補足減少的質(zhì)量，藥液在70 ℃減壓濃縮，得到濃度為1 g/mL的天門冬水煎劑，2～8 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。超氧化物歧化?SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，氟化鈉(分析純)購自無錫市展望化工試劑有限公司；pF-1型氟離子選擇性電極為上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品；Morris水迷宮圖像自動采集和處理系統(tǒng)為中科院藥物研究所產(chǎn)品。

1.2 動物分組及處理 將大鼠隨機分為模型組48只和對照組12只，對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組自由食用模擬氟病區(qū)配方的原煤加拌泥煤烘烤的玉米飼料(飼料內(nèi)含氟50 mg/kg)，連續(xù)90 d。以模型組尿氟和骨氟含量高于對照組為模型構(gòu)建成功。將模型組48只大鼠分為模型對照組和天門冬低、中、高劑量組各12只，天門冬低、中、高劑量組在大鼠食用含氟飼料當天開始每天給予天門冬水煎劑3、6、12 g/kg灌胃1次，連續(xù)90 d。

1.3 認知行為能力觀察 采用Morris水迷宮實驗。實驗結(jié)束前第7天開始，連續(xù)4 d對大鼠實施定向航行實驗，觀察大鼠在不同象限尋找平臺的時間。24 h后行空間探索實驗，撤除平臺，將各組大鼠從平臺對側(cè)象限放入水中，記錄其在60 s內(nèi)首次穿越平臺時間、穿越平臺次數(shù)以及在平臺所在象限停留時間。

1.4 血清和腦組織SOD、MDA檢測 實驗第90天，股動脈取血處死各組大鼠，離心分離血清，低溫保存?zhèn)溆?。取腦組織，加入生理鹽水制成10%的組織勻漿，離心取上清，再用生理鹽水按1∶9稀釋成1%組織勻漿，待測。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，具體步驟嚴格按照試劑說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠認知行為能力比較 模型對照組和天門冬低劑量組首次穿越平臺時間較對照延長，天門冬中、高劑量組首次穿越平臺時間較模型對照組和天門冬低劑量組縮短(P均<0.05)。對照組穿越平臺次數(shù)較其余各組增多，天門冬高劑量組穿越平臺次數(shù)多于中、低劑量組(P均<0.05)；對照組平臺停留時間較模型對照組和天門冬低劑量組延長，天門冬高劑量組平臺停留時間較中、低劑量組延長(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠空間探索實驗結(jié)果比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與天門冬低劑量組比較，△P<0.05。

2.2 各組血清SOD、MDA水平比較 各模型組血清SOD水平低于對照組，模型對照組血清SOD水平低于天門冬中、高劑量組，天門冬高劑量組血清SOD水平高于中、低劑量組(P均<0.05)。各模型組血清MDA水平高于對照組，模型對照組血清MDA水平高于天門冬各劑量組，天門冬組高劑量組血清MDA水平低于中、低劑量組(P均<0.05)。見表2。

2.3 各組腦組織SOD、MDA水平比較 各模型組腦組織SOD水平低于對照組，模型對照組腦組織SOD水平低于天門冬中、高劑量組，天門冬高劑量組腦組織SOD水平高于中、低劑量組(P均<0.05)。

表2 各組血清SOD和MDA水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與天門冬高劑量組比較，△P<0.05。

各模型組腦組織MDA水平高于對照組，模型對照組腦組織MDA水平高于天門冬各劑量組，天門冬高劑量組腦組織MDA水平低于中、低劑量組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組腦組織SOD和MDA水平比較

注:與對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與天門冬高劑量組比較，△P<0.05。

3 討論

動物實驗證實，過量攝入氟的大鼠學習記憶能力顯著下降。氟離子可通過血腦屏障蓄積于腦組織造成腦損傷，致使腦組織代謝、酶活性、學習記憶能力等異常改變，而脂質(zhì)過氧化作用被認為是氟中毒的機制之一[9，10]。氟化物蓄積可消耗體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)和自由基清除酶類，導致抗氧化水平與自由基之間失去平衡，造成機體組織損傷[11～13]。氟對腦組織的損傷作用逐漸受到人們重視。氟在大腦內(nèi)蓄積可直接損傷腦組織，從而影響記憶和思維能力[14，15]。研究[16]發(fā)現(xiàn)，飲用不同劑量氟化鈉溶液的小鼠學習記憶能力降低，并與染氟劑量明顯相關(guān)。腦組織富含不飽和脂肪酸，是氟化物損傷的主要靶器官，腦組織又是耗氧量最多的器官，容易產(chǎn)生活性氧，進一步影響腦的正常生理功能[17]。氟中毒對大腦認知行為能力改變可能是通過氟中毒致大腦氧化應激損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型對照組腦組織SOD水平明顯低于對照組，模型對照組腦組織MDA含量明顯高于對照組。

針對氟中毒致氧化應激的抗氧化藥物研究較多，主要是利用一些礦物質(zhì)微量元素和維生素等治療慢性氟中毒[18，19]。近年來，具有抗氧化作用的中草藥逐漸用于防治氟中毒的研究。我們的前期實驗[6～8]發(fā)現(xiàn)，天門冬具有明顯抗氧化作用。本實驗結(jié)果顯示，大鼠血清SOD活力增高，血清MDA含量降低，機體抗氧化能力得到提升，且高劑量組效果更佳。本實驗結(jié)果顯示，對氟中毒大鼠模型給予天門冬水煎劑灌胃，可提高大鼠腦組織SOD活力，降低腦組織MDA含量，腦組織抗氧化能力得到提升，且高劑量組效果更佳。水迷宮空間探索實驗結(jié)果顯示，天門冬各劑量組首次穿越平臺時間較模型對照組縮短，穿越平臺次數(shù)增加，穿越平臺區(qū)時間延長。表明天門冬水煎劑灌胃可降低大腦組織氧化水平，提高大腦抗氧化能力，并進一步改善大鼠的認知行為能力。

綜上所述，氟中毒可降低大鼠血液和腦組織SOD水平，提高大鼠血液和腦組織MDA水平，降低大鼠認知行為能力；天門冬水煎劑灌胃可降低血液和腦組織中MDA水平，提高血液和腦組織SOD水平，改善大鼠的認知行為能力。這為今后中草藥用于氟中毒腦損傷提供了實驗依據(jù)。

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貴州省科技合作計劃項目(黔科合LH字2016-7511號，黔科合基礎(chǔ)2016-1019)；貴州省教育廳青年科技人才成長項目(黔教合KY2016-190)。

王飛清(E-mail: cnwangfeiqing2006@126.com)

2017-02-19)