劉佐君，劉寶華，孟凡彪

(深圳大學(xué)，廣東深圳518060)

雷帕霉素對(duì)衰老細(xì)胞生物節(jié)律關(guān)鍵基因的調(diào)控作用觀察

劉佐君，劉寶華，孟凡彪

(深圳大學(xué)，廣東深圳518060)

目的觀察雷帕霉素對(duì)衰老細(xì)胞生物節(jié)律關(guān)鍵基因的調(diào)控作用。方法通過傳代誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞復(fù)制性衰老，獲得衰老的人皮膚成纖維細(xì)胞。加入50%的馬血清刺激誘導(dǎo)細(xì)胞同步化，將細(xì)胞分為觀察組和對(duì)照組，分別加入100 mmol/L的雷帕霉素和DMSO培養(yǎng)24 h。采用熒光定量PCR法檢測(cè)生物節(jié)律關(guān)鍵基因芳烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白3(BMAL1)、節(jié)律周期蛋白2(PER2)、藍(lán)光受體蛋白1(CRY1)、孤兒核受體α(Rev-erbα)、孤核受體α(Rorα)mRNA表達(dá)，利用JTK-CYCLE軟件分析各基因的節(jié)律周期，Western blotting法檢測(cè)BMAL1、PER2、CRY1蛋白表達(dá)。結(jié)果觀察組PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA表達(dá)高于對(duì)照組(P均<0.05)。對(duì)照組BMAL1、CRY1、Rev-erbα、Rorα基因的節(jié)律周期為24 h，PER2基因的節(jié)律周期為28 h。觀察組BMAL1、CRY1、Rorα基因的節(jié)律周期為24 h，Rev-erbα基因的節(jié)律周期為27.5 h，PER2的節(jié)律周期為24 h。觀察組CRY1蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，PER2蛋白表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)，兩組BMAL1 mRNA及蛋白表達(dá)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論雷帕霉素可以提高衰老的人皮膚成纖維細(xì)胞生物節(jié)律關(guān)鍵基因BMAL1、PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA的表達(dá)，縮短PER2的節(jié)律周期，對(duì)紊亂的節(jié)律鐘功能具有調(diào)控作用。

生物節(jié)律；雷帕霉素；生物節(jié)律關(guān)鍵基因；芳烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白3；節(jié)律周期蛋白2；藍(lán)光受體蛋白1；孤兒核受體α；孤核受體α；哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白

生物節(jié)律是生物為了適應(yīng)外界環(huán)境(如光照、溫度以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等)而產(chǎn)生的內(nèi)在的、具有節(jié)律性的生命活動(dòng)。人體的許多生理活動(dòng)都具有生物節(jié)律，包括體溫、睡眠、激素分泌、代謝以及免疫系統(tǒng)等。生物節(jié)律紊亂不僅會(huì)導(dǎo)致一系列的代謝疾病如糖尿病、肥胖等，而且與衰老以及衰老相關(guān)的心血管疾病等的發(fā)生息息相關(guān)[1，2]。研究[3，4]顯示，生物節(jié)律關(guān)鍵基因芳烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白3(BMAL1)和節(jié)律調(diào)控蛋白(CLOCK)缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠壽命縮短，并且伴隨出現(xiàn)早衰的相關(guān)表型。人體的生物節(jié)律由兩個(gè)主要的反饋環(huán)調(diào)節(jié)，其中一個(gè)反饋環(huán)是由BMAL1和CLOCK形成的異源二聚體激活下游的節(jié)律周期蛋白(PERs)和藍(lán)光受體蛋白(CRYs)基因家族，PERs和CRYs基因反饋抑制BMAL1的轉(zhuǎn)錄活性，形成一個(gè)負(fù)反饋調(diào)控環(huán)；BMAL1還可以激活孤兒核受體(Rev-erb)和孤核受體(Ror)基因家族，Rev-erb和Ror基因反饋抑制BMAL1的轉(zhuǎn)錄活性，形成另外一個(gè)反饋環(huán)。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一類進(jìn)化保守的絲氨酸/蘇氨酸類的蛋白激酶，與壽命有關(guān)，可以直接調(diào)控生物節(jié)律。抑制mTOR信號(hào)通路可以延長(zhǎng)酵母[5]、線蟲[6]、果蠅[7]、老鼠的壽命[8]。2015年1月～2017年1月，我們利用mTOR抑制劑雷帕霉素處理衰老的人皮膚成纖維細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)生物節(jié)律關(guān)鍵基因BMAL1、節(jié)律周期蛋白2(PER2)、CRY1、Rev-erbα、Rorα的表達(dá)變化，探討雷帕霉素對(duì)衰老細(xì)胞生物節(jié)律的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人皮膚成纖維細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室凍存。胎牛血清(FBS)購(gòu)自PAN-Biotech公司，雷帕霉素、巴佛洛霉素A1和氯喹購(gòu)自Sigma公司，TRIzol和馬血清購(gòu)自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，PER2、CRY1、BMAL1抗體購(gòu)自Abcam公司，細(xì)胞β-Galactosidase染色試劑盒購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 向人皮膚成纖維細(xì)胞中加入含有10% FBS、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。通過傳代(從第16代培養(yǎng)到第30代)誘導(dǎo)細(xì)胞的復(fù)制性衰老，并通過β-gal染色確定細(xì)胞衰老。β-gal染色陽性(呈藍(lán)色)細(xì)胞為衰老細(xì)胞。經(jīng)測(cè)定，第30代細(xì)胞β-gal染色陽性細(xì)胞比例為60%±6%，符合實(shí)驗(yàn)要求。細(xì)胞生長(zhǎng)到100%的細(xì)胞密度后，加入50%的馬血清處理2 h誘導(dǎo)細(xì)胞同步化。將細(xì)胞分為兩組，觀察組加入100 mmol/L雷帕霉素，對(duì)照組加入DMSO。培養(yǎng)24 h后開始取樣，每隔4 h取樣1次，共取6次。

1.3 細(xì)胞內(nèi)BMAL1、PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。馬血清處理24 h后開始收集樣品，分別收集24、28、32、36、40、44 h的細(xì)胞樣品。向細(xì)胞中加入TRIzol裂解液，提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列：BMAL1上游引物5′-CATTAAGAGGTGCCACCAATCC-3′，下游引物5′-TCATTCTGGCTGTAGTTGAGGA-3′；CRY1上游引物5′-CTCCTCCAATGTGGGCATCAA-3′，CRY1下游引物5′-CCACGAATCACAAACAGACGG-3′；PER2上游引物5′-CTTCAGCGATGCCAAGTTTGT-3′，PER2下游引物5′-CGGATTTCATTCTCGTGGCTTT-3′；Rev-erbα上游引物5′-TCATGCTTGCGAAGGCTGTAA-3′，Rev-erbα下游引物5′-CGCTTAGGAATACGACCAAACC-3′；Rorα上游引物5′-TGCGAGGAACAATAGACCCAA-3′，Rorα下游引物5′-ATGGCCTATGTGTGCGTTGTA-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；60 ℃ 15 s；72 ℃ 20 s；72 ℃ 5 min。熒光定量PCR通過BIO-RAD CFX ConnectTMReal-time PCR儀器進(jìn)行檢測(cè)和分析。讀取基因擴(kuò)增的Ct值，以2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。利用JTK-CYCLE軟件分析各基因的相對(duì)震蕩幅度和節(jié)律周期[13]。

1.4 細(xì)胞內(nèi)PER2、CRY1、BMAL1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。馬血清處理24 h后開始收集樣品，分別收集24、28、32、36、40、44 h的細(xì)胞樣品。向細(xì)胞中加入SDS上樣緩沖液裂解，煮沸10 min。經(jīng)過SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜到含有正電荷的PVDF膜。經(jīng)過TBST含有5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4 ℃過夜，TBST沖洗，加入羊抗兔的二抗孵育1 h，TBST沖洗，化學(xué)發(fā)光顯影。利用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析，以目標(biāo)蛋白與β-actin灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組BMAL1、PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA的相對(duì)震蕩幅度比較 觀察組BMAL1 mRNA的相對(duì)震蕩幅度與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA的相對(duì)震蕩幅度較對(duì)照組升高(P<0.05或<0.01)。見表1。

表1 兩組BMAL1、PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA相對(duì)震蕩幅度比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 兩組BMAL1、PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA的節(jié)律周期比較 對(duì)照組BMAL1、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA的節(jié)律周期為24 h，PER2 mRNA的節(jié)律周期為28 h；觀察組BMAL1、CRY1、Rorα mRNA的節(jié)律周期為24 h，Rev-erbα mRNA的節(jié)律周期為27.5 h，PER2 mRNA的節(jié)律周期縮短到24 h。

2.3 兩組BMAL1、PER2、CRY1蛋白表達(dá)水平比較 觀察組PER2蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，CRY1蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，BMAL1蛋白表達(dá)無明顯變化。見表2。

表2 兩組BMAL1、PER2、CRY1蛋白表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

生物節(jié)律控制著人體的睡眠、覺醒、進(jìn)食等生理活動(dòng)。生物節(jié)律紊亂會(huì)導(dǎo)致多種疾病的產(chǎn)生。機(jī)體衰老伴隨著生物節(jié)律功能的失調(diào)，最明顯的就是老年人的睡眠質(zhì)量和睡眠規(guī)律性下降。Chang等[9]研究認(rèn)為，衰老導(dǎo)致生物節(jié)律功能失調(diào)的分子機(jī)制可能是由生物節(jié)律關(guān)鍵基因BMAL1、PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα表達(dá)水平以及震蕩幅度降低所致。研究顯示，生物節(jié)律關(guān)鍵基因BMAL1、CLOCK突變會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)早衰的表型[3，4]。因此，上調(diào)生物節(jié)律基因表達(dá)可能有助于提高生物節(jié)律基因的震蕩幅度，進(jìn)一步恢復(fù)老年人的生物節(jié)律功能。研究[10～13]顯示，mTOR與生物節(jié)律關(guān)鍵基因BMAL1有相互調(diào)控的關(guān)系，mTOR下游的蛋白質(zhì)激酶S6K1磷酸化BMAL1，BAML1的磷酸化修飾進(jìn)一步調(diào)控真核細(xì)胞的翻譯過程。抑制mTOR信號(hào)通路可以顯著延長(zhǎng)酵母、線蟲、果蠅、老鼠的壽命，但是否可以影響人衰老細(xì)胞的生物節(jié)律尚無定論。

雷帕霉素是mTOR的抑制劑，雖然mTOR信號(hào)通路調(diào)控生物節(jié)律的研究已經(jīng)有相關(guān)的報(bào)道，但是直接利用雷帕霉素處理衰老細(xì)胞以及在動(dòng)物體內(nèi)的研究還鮮有報(bào)道。節(jié)律基因的震蕩幅度是研究生物節(jié)律的一個(gè)重要指標(biāo)，其主要表示一個(gè)節(jié)律周期內(nèi)基因的最高表達(dá)量與最低表達(dá)量的相對(duì)比值。節(jié)律鐘關(guān)鍵基因BMAL1和CLOCK突變都會(huì)導(dǎo)致節(jié)律基因的震蕩幅度的喪失[3，4]。而衰老老鼠的節(jié)律鐘基因的震蕩幅度是降低的[9]。本研究通過傳代獲得衰老的人皮膚成纖維細(xì)胞，加入mTOR抑制劑雷帕霉素，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能夠上調(diào)生物節(jié)律關(guān)鍵基因PER2、CRY1、Rev-erbα、RORα mRNA的震蕩幅度，這表明雷帕霉素可能有助于延緩衰老導(dǎo)致的生物節(jié)律功能的下降；從蛋白質(zhì)水平上，雷帕霉素處理顯著降低了PER2蛋白的表達(dá)。由于PER2可以與BMAL1直接相互作用，并且抑制BMAL1的轉(zhuǎn)錄活性，因此雷帕霉素處理導(dǎo)致PER2蛋白表達(dá)降低，進(jìn)一步解除了PER2對(duì)BMAL1下游基因的抑制作用，從而導(dǎo)致PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA表達(dá)上升。

衰老會(huì)伴隨生物節(jié)律周期的延長(zhǎng)，年輕老鼠的生物節(jié)律周期約為23.6 h，而老年老鼠約為24 h[9]。本研究顯示，衰老的人皮膚成纖維細(xì)胞PER2 mRNA的節(jié)律周期大于24 h，而雷帕霉素處理可以縮短PER2的節(jié)律周期。雷帕霉素能夠降低PER2蛋白表達(dá)，由于PER2蛋白穩(wěn)定性的降低會(huì)明顯縮短節(jié)律的周期[14]，因此雷帕霉素可能是通過加速PER2蛋白的降解進(jìn)而恢復(fù)PER2的節(jié)律周期。衰老與PER2蛋白的積累有非常緊密的聯(lián)系[15]，降低PER2表達(dá)可以明顯延緩衰老導(dǎo)致的造血干細(xì)胞功能下降，進(jìn)而延長(zhǎng)老鼠壽命[16]，雷帕霉素對(duì)于衰老的延緩作用是否通過PER2起作用有待進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)過表達(dá)PER2蛋白會(huì)顯著縮短Rev-erbα基因的節(jié)律周期，并且抑制Rev-erbα基因的節(jié)律震蕩水平。本研究結(jié)果顯示，雷帕霉素處理會(huì)延長(zhǎng)Rev-erbα基因的節(jié)律周期，增加Rev-erbα基因的節(jié)律震蕩水平。其機(jī)制可能與PER2蛋白水平降低有關(guān)[17]。

綜上所述，雷帕霉素可以提高衰老的人皮膚成纖維細(xì)胞生物節(jié)律關(guān)鍵基因BMAL1、PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα的表達(dá)，而且縮短PER2的節(jié)律周期，這意味著衰老所導(dǎo)致的節(jié)律鐘功能的下降有可能被回復(fù)或逆轉(zhuǎn)。這為雷帕霉素進(jìn)一步應(yīng)用于機(jī)體生物節(jié)律調(diào)控的研究提供了依據(jù)。

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Regulatoryeffectofrapamycinonkeygenesofcircadianrhythminsenescentcells

LIU Zuojun, LIU Baohua, MENG Fanbiao

(Shenzhen University, Shenzhen 518060, China)

ObjectiveTo investigated the effect of rapamycin on the cell autonomous circadian rhythm of senescent cells.MethodsWe induced replicative senescence of human dermal fibroblasts by series passage. The senescent human dermal fibroblasts cells were identified by SA-β-gal staining. The senescent human dermal fibroblasts cells were synchronized by 50% horse serum, and treated with DMSO or 200 nmol/L rapamycin. The oscillation profiles of BMAL1, PER2, CRY1, Rev-erbα and Rorα were examined by fluorogenic quantitative PCR. The circadian rhythm of genes was analyzed by JTK-CYCLE software. The protein expression of BMA1, CRY1, and PER2 was detected by Western blotting.ResultsThe mRNA expression of PER2, CRY1, Rev-erbα and Rorα in the observation group was higher than that of the control group (allP<0.05). The biorhythm cycle of BMAL1, CRY1, Rev-erbα, and Rorα genes in the control group was 24 h, and the biorhythm cycle of PER2 gene was 28 h. The biorhythm cycle of BMAL1, CRY1, and Rorα genes in the observation group was 24 h, and the biorhythm cycle of Rev-erbα gene was 27.5 h. The expression of CRY1 protein in the observation group was significantly higher than that in the control group, while PER2 protein expression was significantly lower than that in the control group (bothP<0.05). No significant difference was found in BMAL1 mRNA and protein expression between these two groups.ConclusionRapamycin can increase the expression of BMAL1, PER2, CRY1, Rev-erbα and Rorα mRNA in the aging human dermal fibroblasts and shorten the rhythmic cycle of PER2, which plays a regulatory role in the disturbance of circadian clock function.

biorhythm; rapamycin; key gene of biorhythm; aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator 3; PER2; cryptochrome 1; orphan nuclear receptor α; orphan nuclear receptor α; mammalian target of rapamycin

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.42.007

Q419

A

1002-266X(2017)42-0025-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81601215)。

劉佐君(1982-)，男，博士后，主要研究方向?yàn)樯锕?jié)律鐘調(diào)控衰老的分子機(jī)制。E-mail: ijing1982@szu.edu.cn

2017-04-18)