陳麗艷 夏 延 王 萍 張 蕾 孫銀玲 王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院·哈爾濱 1 5 0 0 3 6）

·方藥研究·

細菌型淡豆豉發(fā)酵底物及前酵、后酵工藝研究*

陳麗艷 夏 延 王 萍 張 蕾 孫銀玲 王偉明**

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院·哈爾濱 1 5 0 0 3 6）

目的：研究細菌型淡豆豉發(fā)酵底物及前酵、后酵工藝。方法：分別以黃豆和黑豆為底物，以枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種，以4種異黃酮成分的含量為指標考察淡豆豉前酵和后酵工藝。結果：以黃豆和黑豆為底物前酵過程都出現(xiàn)大豆苷和染料木苷的含量下降，大豆苷元和染料木素含量上升的結果，后酵樣品中除黃豆后酵組大豆苷元的含量繼續(xù)升高外，其他異黃酮成分的含量均有不同程度的下降；發(fā)酵后黃豆組結合型糖苷含量低于黑豆組，苷元含量則高于黑豆組。結論：從結合型糖苷的降解和苷元的轉化角度分析，生產細菌型淡豆豉不需要后酵過程，以黃豆為底物優(yōu)于黑豆。

淡豆豉 底物 后酵 異黃酮 含量

淡豆豉是以大豆為主料，青蒿、桑葉為輔料經固態(tài)發(fā)酵制備的傳統(tǒng)中藥，具有解表、除煩、宣發(fā)郁熱之功效[1]。淡豆豉傳統(tǒng)炮制工藝以黑豆為底物居多[2]，而中國藥典（2015年版）規(guī)定是成熟大豆的發(fā)酵加工品[3]，未明確黑豆還是黃豆，淡豆豉飲片生產企業(yè)使用的原料也參差不齊。中國藥典中淡豆豉的制備工藝用“黃衣上遍”和“再悶15～20天”來控制發(fā)酵過程，并沒有考察活性成分或指標性成分的變化，再悶的過程屬于后酵過程，其對微生物的生長、代謝以及發(fā)酵制品的品質影響很大，也會影響初級或次級代謝產物的成分和含量[4]，從而直接影響藥效。另外，藥典標準中淡豆豉的生產采用的是多菌種混合自然發(fā)酵，存在產品質量不穩(wěn)定、生產周期長、安全性不可靠等問題[5]，因此無菌條件下純菌發(fā)酵淡豆豉成為必然趨勢。目前對于淡豆豉發(fā)酵菌種的研究多以細菌和霉菌居多，每類菌生長周期及酶系不同會直接影響淡豆豉的制備工藝和質量。關于細菌型豆豉的研究已有很多報道，采用的菌種為公認的枯草芽孢桿菌，都是以大豆為底物直接接種細菌菌液制成[6-8]，而淡豆豉不同于豆豉，是在發(fā)酵過程中添加了青蒿、桑葉作為共同的藥性基質，可促進大豆異黃酮苷向苷元的轉化，增強了淡豆豉除煩解表功效[9]。

本研究以從市售淡豆豉飲片中分離并經酶活篩選的枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株，以黃豆和黑豆為發(fā)酵底物，考察前酵和后酵過程對淡豆豉中4種異黃酮類成分含量的影響，為淡豆豉炮制工藝的標準化提供參考。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

DL-CJ-2N型超凈工作臺；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋；KQ-300DB數控超聲波清洗器；Sartorius BSA224S電子天平，DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱，DK-S24水浴鍋，LG10-2.4A離心機，Waters e2695-2489高效液相色譜儀。

1.2 材料

桑葉、青蒿購自河北祁新中藥顆粒飲片有限公司，由黑龍江省中醫(yī)藥科學院王偉明研究員分別鑒定為桑Morus alba L.的干燥葉和黃花蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分；黑豆購自哈爾濱北京同仁堂藥店，鑒定為豆科植物大豆Glycine max (L.) Merr.的干燥成熟種子；黃豆購自哈爾濱北京華聯(lián)超市。

大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素對照品購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為D-013-150928、D-016-150423、R-002-150802、R-001-150421。

菌種：分離自淡豆豉飲片（黑龍江德順長中藥飲片有限公司，批號：140701），經中國工業(yè)微生物菌種保藏中心鑒定為枯草芽孢桿菌亞種（拉丁名Bacillus subtilis subsp.subtilis）。

2 方法

2.1 淡豆豉樣品的制備

2.1.1 接種液的制備 取保存的枯草芽孢桿菌菌種采用劃線法接種于營養(yǎng)瓊脂試管斜面上，于37℃培養(yǎng)18～24h，加10mL無菌生理鹽水將斜面菌落沖洗混勻制成菌懸液，用血球計數板計數，菌液濃度為109CFU/mL，備用。

2.1.2 發(fā)酵工藝 參照《中華人民共和國藥典》2015年版一部淡豆豉的制備工藝，分別稱取黃豆、黑豆各100g（平行3份）,洗凈，每份加青蒿、桑葉煎煮液(稱取青蒿7g，桑葉10g，加水煎煮2次，每次0.5h，合并濾液，濃縮至120mL)浸泡，中間翻混兩次，俟煎煮液充分吸盡，裝袋，121℃滅菌40min，放涼，其中黃豆和黑豆組各取2袋，每袋接種2.1.1制備的菌液1mL，搖勻，37℃培養(yǎng)7d（前酵），每種底物樣品各取出一份，另一份平行樣品轉置42℃培養(yǎng)15d（后酵），剩余1袋黃豆和1袋黑豆不接種菌液作為空白樣品。

2.2 4種異黃酮成分的含量測定

采用高效液相色譜法測定大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素含量。

2.2.1 色譜條件[10，11]色譜柱：Waters Symmetry C18 （5 μm, 4.6×150 mm）,甲醇為流動相A，0.5%冰醋酸溶液為流動相B，洗脫程序見表2。流速為1mL/min，檢測波長：254 nm，柱溫：40℃，進樣量 10 μL。

表 1 洗脫程序

2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取對照品大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素，加甲醇制成含大豆苷11.76 μg/mL，染料木苷15.40 μg/mL，大豆苷元16.80 μg/mL，染料木素12.10 μg/mL的混合對照品貯備溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 將2.1.2得到的樣品于60℃烘干，粉碎過80目篩，精密稱取干粉2g置25 mL容量瓶中，加石油醚超聲脫脂，再用80%甲醇溶液超聲30 min，放冷，定容至刻度，混勻，以5000 r/min離心10 min，取上清液過0.45μm濾膜用于高效液相色譜分析。

2.2.4 線性關系考察 將混合對照品溶液分別進樣2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL、14μL，按2.2.1的色譜條件測定，分別以進樣量（μg）為橫坐標，以峰面積(因峰面積較大，故縮小106倍)為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程見表2。

表 2 4種異黃酮對照品線性回歸方程

結果表明，大豆苷含量在0.024μg～0.164μg，染料木苷含量在0.031μg～0.216μg，大豆苷元含量在0.034μg～0.235μg，染料木素含量在0.024μg～0.169μg內與其峰面積呈良好線性關系。

3 結果

大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量測定結果如表3。與空白組相比，黃豆前酵組大豆苷和染料木苷含量降低了3-5倍，大豆苷元和染料木素的含量分別提高了3倍和1.3倍；黑豆前酵組大豆苷和染料木苷含量均降低了約1.5倍，大豆苷元的含量提高了7.6倍，染料木素含量則有所下降。與前酵相比，后酵樣品中除黃豆后酵組大豆苷元的含量繼續(xù)升高外，其它樣品及成分的含量均均有不同程度的下降，其中大豆苷分別下降了13.50%和7.20%，染料木苷分別下降39.46%和30.62%，染料木素分別下降94.89%和71.67%。發(fā)酵樣品組中黃豆組結合型糖苷含量均低于對應的黑豆組，且苷元含量均高于對應黑豆組。

表3 不同樣品4種異黃酮含量測定結果(單位：μg/g)

4 討論

通過淡豆豉發(fā)酵前后異黃酮苷及苷元類成分的含量對比，前酵樣品苷類向苷元類成分的轉化率較高，這與β-葡萄糖苷酶活性升高密切相關。后酵過程苷類成分含量進一步降低，但不顯著，大豆苷元的含量有一定提高，而染料木素含量下降明顯，表明大豆苷元在酶的作用下相對比較穩(wěn)定，而染料木素含量的降低可能是后酵15 d在β-葡萄糖苷酶作用下繼續(xù)降解為鷹嘴豆芽素或其他異黃酮苷元類物質[12]。與前酵相比，除黃豆后酵組大豆苷元的含量繼續(xù)升高外，后酵樣品其他異黃酮類成分的含量均有不同程度的下降，發(fā)酵后黃豆組結合型糖苷含量低于黑豆組，苷元含量則高于黑豆組。由于苷類物質不能被人體直接吸收，需轉化為苷元才能被利用，因此，從結合型糖苷的降解和苷元的轉化角度分析，生產細菌型淡豆豉不需要后酵過程，以黃豆為底物優(yōu)于黑豆。

[1] 李剛,龍凱,蘇明聲,等.淡豆豉炮制至“黃衣上遍”過程中微生物菌群動態(tài)變化的初步研究[J].中國實驗方劑學雜志,2014,24(11):139-142.

[2] 徐爾雅.淡豆豉的原料應使用黑大豆[J].中藥材,1994,17(4):44-46.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:328.

[4] 李剛,梁永紅,龍凱,等.再悶過程影響淡豆豉炮制工藝研究[J].中草藥,2014,45(8):1083-1088

[5] 潘平平,邱琳,鄧開野.曲霉型豆豉多菌種制曲工藝優(yōu)化的研究[J].中國調味品,2016,41(3):26-31.

[6] 李華，李鐸，沈立榮，等. 細菌型豆豉純種發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].中國糧油學報，2009，24（2）：50-54.

[7] 楊勝遠,韋錦. 不同豆類細菌型豆豉的功能性成分分析[J].生物技術通報，2014，（2）：166-170.

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[9] 張敏敏，廖麗娜，曹尉尉,等. 在淡豆豉發(fā)酵過程中桑葉、青蒿對大豆異黃酮含量的影響[J]. 藥學服務與研究，2013，13(2):119-123.

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[12] 葛娟.槐角染料木素裂褶菌轉化研究[D].華中科技大學,2011.

國家中醫(yī)藥管理局公益性行業(yè)科研專項經費項目（2 0 1 5 0 7 0 0 4-0 3）；哈爾濱市應用技術研究與開發(fā)項目（2 0 1 6 R A X Y J 1 0 1）

** 通信作者