張飛燕，王振華，潘康成，唐慧琴，谷笑笑，李 偉

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物微生態(tài)研究中心，四川 成都 611130；2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 成都 611130)

類胰島素生長(zhǎng)因子-1(Insulin-like growth factor 1，IGF-1)是從動(dòng)物血清中發(fā)現(xiàn)的一種具有調(diào)控動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝的一個(gè)重要因子，主要介導(dǎo)生長(zhǎng)激素發(fā)揮促生長(zhǎng)作用[1]。IGF-1 為動(dòng)物體內(nèi)多功能生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖和氨基酸攝取與利用，增加糖原、脂肪和蛋白等的合成，刺激細(xì)胞遺傳物質(zhì)的復(fù)制、細(xì)胞增殖分化、性腺分泌，促進(jìn)產(chǎn)后動(dòng)物泌乳以及新生動(dòng)物的腸道發(fā)育[2-4]。IGF-1具有內(nèi)分泌、旁分泌、自分泌特性，主要由肝臟合成分泌到血液中，依賴與IGFBPS家族基因的運(yùn)載而提高IGF-1的半衰期，以及組織的偏向性而促進(jìn)組織細(xì)胞的分化與增殖[5]。豬IGF-1基因位于體細(xì)胞的第5號(hào)染色體上，基因全長(zhǎng)80 kb(含5個(gè)內(nèi)含子和6個(gè)外顯子)，該基因具有高度的保守性，其成熟肽氨基酸序列與牛、人的相同，但與鼠有3～4個(gè)氨基酸相異[6-8]。研究表明，豬血漿中IGF-1 水平與體重及增重呈正相關(guān)，IGF-1基因可以作為影響動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的候選基因，該基因受到研究者的廣泛關(guān)注[9-10]。藏豬為地方特色品種資源，耐粗飼、肉質(zhì)優(yōu)良、肌肉鮮紅、鮮嫩多汁、富含肌內(nèi)脂肪，因此成為人們所追求的新型生態(tài)食品，且藏豬能適應(yīng)高寒的放牧氣候和以放牧為主的低劣飼養(yǎng)條件，也是一種優(yōu)良的試驗(yàn)用小型豬品種[11-12]，這些優(yōu)點(diǎn)使藏豬具有廣闊的應(yīng)用前景，但其生長(zhǎng)速度緩慢，屬選育程度極低的品種。IGF-1在調(diào)控藏豬生長(zhǎng)發(fā)育、代謝上扮演了一個(gè)重要的角色，然而目前沒有關(guān)于藏豬IGF-1原核表達(dá)的報(bào)道。本研究首次對(duì)藏豬IGF-1成熟肽基因進(jìn)行克隆，構(gòu)建IGF-1成熟肽基因融合表達(dá)載體pET-32α-IGF-1，并在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行初步表達(dá)，優(yōu)化表達(dá)條件，獲得IGF-1融合蛋白，為研究藏豬IGF-1成熟肽蛋白的生物學(xué)功能及在藏豬生長(zhǎng)發(fā)育過程中的調(diào)節(jié)作用及功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 藏豬肝臟、質(zhì)粒及菌株

豬肝臟采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖場(chǎng)屠宰的健康成年藏豬；E.coliDH5α、E.coliBL21(DE)、質(zhì)粒pMD19-T、表達(dá)質(zhì)粒pET-32α 均為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物微生態(tài)研究中心保存。

1.2 酶和試劑

RNA抽提純化試劑盒(動(dòng)物組織)和PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒、Ni-NTA SefinoseTMResin試劑盒(上海生工公司)；T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、QUuickCutTMEcoR Ⅰ和QUuickCutTMXhoⅠ(TaKaRa公司)，2×Taq Master Mix(北京康為世紀(jì)公司)；Rabbit anti-human IGF-1和HRP標(biāo)記的Goat anti-rabbit IgG(武漢博士德公司)。

1.3 PCR引物

擴(kuò)增藏豬IGF-I基因全長(zhǎng)序列P1、P2引物[13]，擴(kuò)增IGF-1成熟肽系列引物P3：5′- CGGAATTCGGACCTGAGACCCTCTGTGG-3′，P4：5′- CCGCTCGAGCATTCTGTAGTTCTTGTTTC -3′(下劃線分別為EcoR Ⅰ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)，斜體部分為終止密碼子序列)，引物由成都擎科生物科技有限公司合成。

1.4 藏豬肝總RNA提取及cDNA合成

取新鮮的藏豬肝臟組織50 mg，用液氮反復(fù)研磨成粉末，轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，然后參照試劑盒說明書提取、純化肝組織總RNA，1%瓊脂糖電泳(AGE)檢查。以總RNA提取液3 μL為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min)。

1.5 pMD19-T-IGF-1質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以cDNA為模板，擴(kuò)增IGF-1全基因(反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，10 pmol/μLP1、P2各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，57 ℃ 55 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min)，預(yù)期產(chǎn)物612 bp。PCR產(chǎn)物純化回收后與pMD19-T載體連接，再轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，陽性單菌落經(jīng)PCR鑒定和測(cè)序鑒定，正確的克隆命名為pMD19-T-IGF-1。

1.6 藏豬IGF-1成熟肽基因擴(kuò)增及重組表達(dá)載體pET-32α-IGF-1的構(gòu)建

以pMD19T-IGF-1為模板，進(jìn)行藏豬IGF-1成熟肽基因的擴(kuò)增(反應(yīng)體系：2 μL pMD19T-IGF-1，上下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，10 μL 2×Taq Master Mix，6 μL ddH2O，反應(yīng)條件同上)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% AGE純化回收。將純化回收的IGF-1成熟肽PCR產(chǎn)物和載體PET-32α用EcoR Ⅰ和XhoⅠ 37 ℃ 雙酶切25 min (雙酶切體系為IGF-1/ PET-32α 50 μL，10×酶切Buffer 6 μL，EcoR Ⅰ 1 μL，XhoⅠ 1 μL)，將IGF-1酶切片段與PET-32α酶切產(chǎn)物16 ℃連接酶過夜連接，獲得重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化E.coli.BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于LB 抗性平板(含Amp+ 100 μg/mL)，37 ℃恒溫需氧培養(yǎng)16～18 h。挑單個(gè)菌落，接種于LB肉湯(含Amp+)，37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)12～14 h，取菌液進(jìn)行PCR鑒定，選取PCR鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒，EcoR Ⅰ和XhoⅠ 雙酶切鑒定，將菌落PCR鑒定與雙酶切鑒定正確的陽性克隆轉(zhuǎn)化子送上海生工測(cè)序鑒定。

1.7 誘導(dǎo)劑IPTG濃度及誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的優(yōu)化

將重組菌BL21-IGF-1接種于LB肉湯(含Amp+)37 ℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，按1∶100比例轉(zhuǎn)種到LB肉湯(含Amp+)中培養(yǎng)至OD600=0.5時(shí)，加入IPTG溶液使終濃度分別為0，0.1，0.2，0.3，0.5，0.8，1.0 mmol/L誘導(dǎo)10 h，收集菌體進(jìn)行全菌SDS-PAGE分析。同時(shí)，當(dāng)重組菌BL21-IGF-1培養(yǎng)至OD600=0.5時(shí)，加入IPTG溶液使終濃度達(dá)上述優(yōu)化的濃度，誘導(dǎo)至6，8，10 h時(shí)，取1 mL菌液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)分析。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物的定位分析及Western Blot鑒定

按方法1.7優(yōu)化后的結(jié)果進(jìn)行重組菌BL21-IGF-1培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)，4 ℃ 12 000 r/min(Sigma 3k15 Inc)離心10 min，棄上清，用1/10體積的PBS(pH值8.0)重懸沉淀，加入適量裂解液，在冰浴下超聲破碎至溶液清亮。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min收集上清和沉淀，沉淀用PBS重懸。取少量上清液和沉淀重懸液，加入等體積的5×Loading Buffer，SDS-PAGE分析。破碎后離心收集的上清液中，加等體積的平衡緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L 咪唑，pH值8.0)混勻，0.45 nm濾膜過濾，濾液按照上海生工公司Ni-NTA SefinoseTMResin Kit試劑盒使用說明操作。洗脫蛋白經(jīng)10 kDa超濾管濃縮。將誘導(dǎo)表達(dá)和未誘導(dǎo)的產(chǎn)物與純化的融合蛋白先行SDS-PAGE分析，轉(zhuǎn)PVDF膜，再進(jìn)行Western Blot分析，一抗為兔抗人IGF-1，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏豬IGF-1全基因及成熟肽序列的擴(kuò)增

以抽提的藏豬肝組織RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增IGF-1基因全長(zhǎng)序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% AGE檢測(cè)，在約612 bp位置處出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的單一條帶(圖1-A)。將目的片段擴(kuò)增到克隆載體pMD19-T上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定(圖1-B)，獲得 5陽性克隆，陽性菌株送成都擎科梓熙生物技術(shù)公司測(cè)序，獲得堿基序列為612 bp，Blast在線比對(duì)與GenBank中豬IGF-1序列(登錄號(hào)DQ121132.1)同源性達(dá)100%，結(jié)果表明克隆成功。以P3/P4為引物，pMD19-T-IGF-1為模板擴(kuò)增出的IGF-1成熟肽序列，在約315 bp的位置出現(xiàn)單一條帶，與預(yù)期相符(圖1-C)，未加模板的陰性對(duì)照未見條帶，說明已成功擴(kuò)增了IGF-1成熟肽。

A.藏豬IGF-1全序列PCR產(chǎn)物； B. 菌落PCR鑒定； C. IGF-1成熟肽序列的PCR產(chǎn)物。M. 2 000 bp Marker；A:1. IGF-1全基因PCR產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照；B:1～5.陽性菌株菌落PCR產(chǎn)物；C:1,2.IGF-1成熟肽序列的PCR產(chǎn)物；3.陰性對(duì)照。

2.2 重組表達(dá)載體pET32α-IGF-1構(gòu)建與鑒定

回收的成熟肽基因片段與質(zhì)粒pET-32α分別雙酶切后，連接酶連接，獲取重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli.BL21(DE3)，陽性菌株進(jìn)行菌落PCR鑒定，另小量提取質(zhì)粒后用EcoR Ⅰ、XhoⅠ雙酶切鑒定，均可得到約315 bp 的IGF-1序列片段，與預(yù)期產(chǎn)物一致(圖2)，質(zhì)粒送公司測(cè)序鑒定，正確的轉(zhuǎn)化子命名為BL21-IGF-1。

2.3 誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)IPTG濃度的優(yōu)化

采用0.1，0.2，0.3，0.5，0.8，1.0 mmol/L 5種IPTG終濃度進(jìn)行誘導(dǎo)重組菌BL21-IGF-1表達(dá)融合蛋白，SDS-PAGE分析。以未誘導(dǎo)重組菌為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)在31 kDa大小處出現(xiàn)特異性條帶，當(dāng)IPTG濃度從0.1 mmol/L升到0.5 mmol/L，融合蛋白的表達(dá)量明顯增加，但I(xiàn)PTG濃度在0.8～1.0 mmol/L時(shí)對(duì)融合蛋白表達(dá)量的影響不明顯(圖3)。因此，選擇IPTG的誘導(dǎo)濃度為0.5 mmol/L。

A. pET32α-IGF-1重組質(zhì)粒的PCR鑒定；M. DL2000 Marker；1～4. 陽性克隆菌落PCR鑒定；B. pET32α-IGF-1重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定；M.DL15000 Marker；1. 重組質(zhì)粒pET32α-IGF-1的EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切鑒定；2.重組質(zhì)粒pET32α-IGF-1。

M. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；1.未誘導(dǎo)；2～7.分別為0.1，0.2，0.3，0.5，0.8，1.0 mmol/L IPTG對(duì)融合蛋白IGF-1的誘導(dǎo)表達(dá)。

2.4 不同誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

為了探索融合蛋白表達(dá)的最優(yōu)IPTG誘導(dǎo)時(shí)間，以未誘導(dǎo)的和空載體的菌液作對(duì)照，SDS-PAGE分析6，8，10 h融合蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示，在IPTG誘導(dǎo)的各個(gè)時(shí)間段，重組菌BL21-IGF-1均在31 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，并且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量增加，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和空載體菌在31 kDa處均未見有明顯條帶(圖4)，因此，選擇10 h作為IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的最佳時(shí)間。

2. 5 pET32α-IGF-1融合蛋白表達(dá)的可溶性分析

將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液經(jīng)過超聲波破碎后，離心分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，IGF-1融合蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)于菌體中，上清有少量的表達(dá)產(chǎn)物(圖5)。

M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；1.未誘導(dǎo)；2. pET-32α空載體誘導(dǎo)；3-5.IPTG誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為6，8，10 h。M.Marker of standard protein； 1. BL21-IGF-1 without IPTG induction； 2. pET-32α-BL21(DE3) with IPTG induction；3-5.Expression of pET-32α-IGF-1 with 6,8,10 h IPTG induction.

M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；1.pET32α空載體的IPTG的誘導(dǎo)；2.未誘導(dǎo)；3.裂解上清；4.未誘導(dǎo)上清；5.裂解沉淀；6.未誘導(dǎo)沉淀。M.Marker of standard protein； 1. pET-32α-BL21(DE3) with IPTGinduction；2.Expression without IPTG induction；3.Supernatant of lysate；4.Supernatant without induction；5.Precipitation of lysat of lysate；6.Precipitation without induction.

2.6 融合蛋白純化及表達(dá)產(chǎn)物Western Blot鑒定

利用融合蛋白中的組氨酸標(biāo)簽，通過固定化金屬親和層析來純化上清中的IGF-1蛋白，用洗脫液(含250 mmol/L)洗脫，洗脫液通過用10 kDa的超濾管濃縮得到純度較高的融合蛋白(圖6-A)。Western Blot鑒定結(jié)果，未誘導(dǎo)的重組菌BL21-IGF-1菌體超聲后上清和沉淀未出現(xiàn)特異性條帶，而誘導(dǎo)后的重組菌BL21-IGF-1菌體超聲破碎后的上清、沉淀以及純化后蛋白均出現(xiàn)了特異性條帶(圖6-B、C)。

3 討論與結(jié)論

本研究以藏豬肝組織總RNA為模板，通過RT-PCR成功擴(kuò)增出IGF-1全長(zhǎng)序列，長(zhǎng)度612 bp，設(shè)計(jì)引物P3/P4，以pMD19-T-IGF-1為模板擴(kuò)增出IGF-1成熟肽序列315 bp，定向插入pET-32α質(zhì)粒中，經(jīng)菌液PCR、EcoR Ⅰ/XhoⅠ雙酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果表明成功構(gòu)建了pET-32α-IGF-1原核表達(dá)質(zhì)粒。本試驗(yàn)所選用的pET-32α，由于連有T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，強(qiáng)大的T7啟動(dòng)子受控于T7 RNA聚合酶，宿主細(xì)胞可提供T7 RNA 聚合酶，其合成mRNA速度快，是普通大腸桿菌合成mRNA速度的5倍；而攜帶pET-32α表達(dá)質(zhì)粒受到充分誘導(dǎo)時(shí)，絕大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)的資源用于表達(dá)目的蛋白[14-15]。目前載體常用與本身溶解性高的多肽序列融合表達(dá)，或與催化二硫鍵形成的酶融合表達(dá)如硫氧還蛋白(Trx)，提高目的蛋白可溶性比例及活性[16-17]； His·Tag是常用的純化蛋白的融合標(biāo)簽，可以將蛋白在完全變性條件下溶解，結(jié)合于固化的Ni2+樹脂而進(jìn)行親和純化，從而提高蛋白純化效率[18]。孟星宇等[19]曾用Trx標(biāo)簽成功表達(dá)了梅花鹿IGF-1融合蛋白，pET-32α是融合型原核表達(dá)載體，融合標(biāo)簽為6×His Tag。因此，本試驗(yàn)將成功克隆得到的IGF-1成熟肽序列并選用pET-32α質(zhì)粒構(gòu)建藏豬IGF-1成熟肽表達(dá)載體。重組大腸桿菌BL21-IGF-1加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)時(shí)，當(dāng)IPTG誘導(dǎo)濃度從0.1 mmol/L增加到0.5 mmol/L，蛋白的表達(dá)量也隨之增加，0.8～1.0 mmol/L時(shí)，蛋白的表達(dá)量受誘導(dǎo)濃度的影響不大，考慮到IPTG的毒性以及IPTG與蛋白表達(dá)量的關(guān)系，確定IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度為0.5 mmol/L。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)量隨IPTG誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，誘導(dǎo)10 h時(shí)表達(dá)量最高，因此誘導(dǎo)時(shí)間10 h為最佳。pET-32α-IGF-1重組質(zhì)粒在BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白大小約為31 kDa，與理論值一致。本試驗(yàn)選擇的BL21(DE3)為蛋白酶缺陷形菌株，缺乏純化過程中降解蛋白的lon 蛋白酶及 ompT 外膜蛋白酶，實(shí)現(xiàn)目的蛋白在菌株中的穩(wěn)定表達(dá)。但在未誘導(dǎo)的重組菌和攜帶空載體的細(xì)菌誘導(dǎo)的對(duì)照組中，也出現(xiàn)與目的蛋白大小相近的雜蛋白，推測(cè)可能是大腸桿菌BL21(DE3)菌自身表達(dá)大小相似的蛋白所致。進(jìn)一步對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)的重組菌菌體的破碎上清液和沉淀以及純化的融合蛋白中能檢測(cè)到分子質(zhì)量約31 kDa有特異性蛋白條帶，而未誘導(dǎo)的菌體破碎上清液和沉淀均未出現(xiàn)特異性條帶，與SDS-PAGE結(jié)果相符，說明重組菌表達(dá)的融合蛋白是豬IGF-1成熟肽且具抗原抗體反應(yīng)活性。

A.純化融合蛋白；M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量； 1.純化的融合蛋白洗脫液(含250 mmol/L 咪唑)；2～3.結(jié)合洗滌液(含10 mmol/L咪唑)；B.IGF-1重組蛋白的Western Blot鑒定；M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；1.誘導(dǎo)菌體裂解沉淀；2.未誘導(dǎo)菌體裂解沉淀；3誘導(dǎo)菌體裂解上清；4.未誘導(dǎo)菌體裂解上清；C.純化目標(biāo)蛋白。

通過目標(biāo)融合蛋白可溶性分析試驗(yàn)結(jié)果可知，蛋白主要以包涵體的形式存在，而在菌體破碎的上清液中仍有少量存在。破碎菌體上清液中的可溶蛋白的分離純化可操作性優(yōu)于包涵體蛋白，所以本試驗(yàn)的目標(biāo)蛋白純化是對(duì)重組菌菌體破碎的上清蛋白進(jìn)行純化。有關(guān)IGF-1重組蛋白表達(dá)后的活性問題，樊汶樵[20]研究發(fā)現(xiàn),原核表達(dá)出來的IGF-1重組蛋白能顯著刺激魚的腎臟傳代細(xì)胞CIK細(xì)胞增殖，具有較強(qiáng)的生物活性。孟星宇等[19]研究發(fā)現(xiàn)，原核表達(dá)出來的IGF-1重組蛋白能提升細(xì)胞的增殖速度。Zeng等[5]給豬注射牛或人的IGF-1，結(jié)果表明，IGF-1與豬的平均日增重有著較大相關(guān)性，豬的肌肉生長(zhǎng)加快，肌肉中總蛋白和總的IGF-1 mRNA豐度上升。本試驗(yàn)成功獲得了高純度的藏豬IGF-1成熟肽融合蛋白，為深入研究IGF-1融合蛋白生物學(xué)特性及其在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

通過RT-PCR成功擴(kuò)增出藏豬IGF-1成熟肽基因序列，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pET32α-IGF-1及獲得重組大腸桿菌BL21-IGF-1，成功表達(dá)了藏豬IGF-1成熟肽融合蛋白。