新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004

維藥狹葉薰衣草抗炎活性部位篩選研究

譚為張?zhí)m蘭李晨陽孫玉華*

新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004

目的從薰衣草的不同提取部位中篩選出抗炎活性部位。方法采用二甲苯致小鼠耳腫脹模型和冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性模型進(jìn)行抗炎活性篩選，再將活性好的部位采用細(xì)胞炎癥模型進(jìn)行相關(guān)分子機(jī)制的初步研究。結(jié)果XYC-3、XYC-5對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)有明顯抑制作用(P<0.05)；XYC-3對(duì)小鼠毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)有顯著抑制作用(P<0.05)；XYC-3、XYC-5有明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生，且NO水平抑制率隨著提取物濃度成正比；還可抑制LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中TNF-α，IL-6的產(chǎn)生，可有效抑制炎癥因子的釋放。結(jié)論XYC-3和XYC-5具有明顯的抗炎作用，為薰衣草的抗炎活性部位。

薰衣草；抗炎；篩選；RAW264.7

維吾爾醫(yī)常用藥材薰衣草為唇形科植物狹葉薰衣草LavandulaaugustifoliaMill.的干燥地上部分，維語稱薰衣草為“烏斯提胡都斯”。薰衣草作為維醫(yī)常用藥材已有很長(zhǎng)歷史，并被《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)-維吾爾藥分冊(cè)》收載[1]。薰衣草性質(zhì)為二級(jí)濕熱，具有消散寒氣、補(bǔ)胃理腦、燥濕止痛之功效，用于胸腹脹滿、感冒咳喘、頭暈頭痛、心悸氣短、關(guān)節(jié)骨痛等疾病的治療[2]。

通過針對(duì)薰衣草的抗炎活性進(jìn)行研究，首先采用二甲苯致小鼠耳腫脹模型和冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性模型對(duì)薰衣草揮發(fā)油和各極性部位進(jìn)行抗炎活性篩選，再將篩選出的抗炎活性好的部位采用細(xì)胞炎癥模型對(duì)其進(jìn)行相關(guān)的抗炎分子機(jī)制的初步研究，以期為闡明薰衣草的抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和薰衣草的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料 薰衣草藥材(購自二道區(qū)市場(chǎng)，由新疆藥物研究所何江副研究員鑒定為狹葉薰衣草LavandulaangustifoliaMill.)；布洛芬片(西南藥業(yè)股份有限公司，H20013193)；RAW264.7細(xì)胞(小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞，ATCC，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所贈(zèng)送)。1640培養(yǎng)基(批號(hào)8114242，美國Gibco公司)；胎牛血清(批號(hào)1205331，美國Gibco公司)； MTS(批號(hào)0000125533，美國Promega公司)；雙抗(批號(hào)J140027，美國Hyclone公司)，Griess試劑盒(批號(hào)0000131725，美國Promega公司)；LPS(批號(hào)：Sigma L-2880，美國Biosharp公司)； TNF-αELISA試劑盒(批號(hào)E09479-1647，美國eBioscience公司)；二甲苯(批號(hào)20060815，西安化學(xué)試劑廠)；伊文思藍(lán)(批號(hào)：20120917，上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站分裝廠)；冰乙酸(批號(hào)：20120105，天津市福晨化學(xué)試劑廠)；羧甲基纖維素鈉(批號(hào)：20091224，上海山浦化工有限公司)。氯化鈉注射液(新疆制藥廠)，食用油(中糧食品營銷有限公司)。

1.2 儀器 BS124S電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；CO2培養(yǎng)箱、BPN-CH(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；DSY2000X倒置熒光顯微鏡(重慶澳浦光電技術(shù)有限公司)；RT-6100酶標(biāo)儀(深圳雷杜生命科學(xué)儀器有限公司)；SpectraMax M3型多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：No.65000200000677，許可證號(hào)：SCXK(新)2016-0001，雌雄分籠常規(guī)飼養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 薰衣草提取物制備

2.1.1 水提物和揮發(fā)油制備 取薰衣草5 kg，粉碎，加水10倍量浸泡1h后回流提取2遍，收集揮發(fā)油備用。將水提液過濾，濾液減壓濃縮成浸膏，將水提浸膏采用大孔樹脂進(jìn)行分離純化得到不同的洗脫部位：水部分、30%乙醇部分、50%乙醇部分、70%乙醇部分、95%乙醇部分。

2.1.2 醇提物的制備 取薰衣草5 kg，粉碎，加入95%乙醇回流提取，醇提液過濾，濃縮成浸膏。將醇提浸膏加水混懸后，依次采用氯仿、石油醚、乙酸乙酯和飽和正丁醇依次萃取，得到石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。

2.2 薰衣草各部位的抗炎篩選試驗(yàn)

2.2.1 分組 取昆明種小鼠140只，按體重、性別隨機(jī)分為2個(gè)空白對(duì)照組(CMC-Na組、食用油組)、11個(gè)給藥組(XYC-1至XYC-11)、陽性藥組(見表1)，共14組，每組10只。

2.2.2 給藥劑量 薰衣草提取物，參考《維藥分冊(cè)》，臨床生藥用量為3～9 g/人·d[1]。本實(shí)驗(yàn)取6 g生藥作為臨床用量，根據(jù)出膏率的不同將不同極性或萃取部位統(tǒng)一折算成小鼠等效用量。薰衣草精油部分，臨用前加食用油稀釋；其它極性部位或萃取部位，臨用時(shí)加0.5%CMC-Na配成混懸液灌胃給藥。具體給藥劑量見表1。

2.2.3 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn) 按照“2.2.1”分組，各組按設(shè)定劑量灌胃給藥，空白對(duì)照1組灌胃給予等量0.5%CMC-Na混懸液，空白對(duì)照2組灌胃給予等量的食用油，1次/d，給藥3 d，末次給藥后1 h，將二甲苯20 μL均勻涂抹于各組小鼠右耳廓兩面致炎，以左耳作對(duì)照不做任何處理。30 min后處死小鼠，分別在左右耳對(duì)稱部位用直徑8 mm打孔器打下圓形耳片，精密稱重，計(jì)算腫脹度和腫脹抑制率。每組小鼠耳廓腫脹度以每鼠左右耳重量之差的均值來表示。腫脹抑制率(%)=(對(duì)照組腫脹度均值-給藥組腫脹度均值)/對(duì)照組腫脹度均值×100%

2.2.4 對(duì)冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性 實(shí)驗(yàn)按照“2.2.1”分組，各組按設(shè)定劑量灌胃給藥，空白對(duì)照1組灌胃給予等量0.5%CMC-Na混懸液，空白對(duì)照2組灌胃給予等量的食用油，1d/1次，連續(xù)3d，末次給藥后1 h，各組小鼠尾靜脈注射0.5%伊文思藍(lán)生理鹽水溶液10 mL/kg，并立即腹腔注射0.6%冰醋酸生理鹽水溶液0.2 mL/只。50 min后脫頸椎處死小鼠，用6 mL生理鹽水注射洗滌腹腔，剪開腹部，吸出沖洗液，3000 r/min離心10 min，取上清液于波長(zhǎng)590 nm處測(cè)定其吸光度(OD)值，計(jì)算藥物對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的抑制率。(抑制率(%)=(模型對(duì)照組OD590 -給藥組OD590)/模型對(duì)照組OD590×100%)

2.3 薰衣草有效部位抗炎分子機(jī)制初步研究

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW 264.7細(xì)胞于37 ℃、5% CO2及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)于含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，于96孔培養(yǎng)板內(nèi)以180 μL(3×104個(gè)/孔)接種孵育，孵育18～24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 細(xì)胞分組與加藥 將RAW 264.7細(xì)胞隨機(jī)分組：正常對(duì)照組：以含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，終體積補(bǔ)充至200 μL(補(bǔ)充液與樣品溶液相同)；LPS對(duì)照組：該對(duì)照組(1 μg/mL)加10 μL，終體積補(bǔ)充至200 μL；空白對(duì)照組：加無細(xì)胞的培養(yǎng)基200 μL；樣品組：每孔加入薰衣草提取物10 μL，LPS 10 μL終體積達(dá)200 μL，設(shè)提取物濃度梯度為50 μg/mL，10 μg/mL，2 μg/mL樣品與細(xì)胞共同孵育24 h進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

2.3.3 RAW 264.7細(xì)胞活力和細(xì)胞釋放NO的影響 孵育24 h后，分別在每孔中加入10 μL MTS混合液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h顯色，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光吸收值。細(xì)胞存活率=(ODsample-OD blank)/( ODcontrol-OD blank) ×100%(OD sample：樣品處理組吸光值；OD control：正常組吸光值；OD blank：培養(yǎng)板空白孔(無細(xì)胞)吸光值。)

采用試劑盒測(cè)NO含量，設(shè)定濃度梯度為100、50、25、2.5、6.25、3.13和1.56 μM制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，每孔分別吸取細(xì)胞上清液100 μL于新的細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔依次分別放入50 μL磺胺溶液和50μL N-萘乙二胺鹽酸，放置15 min后，于酶標(biāo)儀540 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度值。

2.3.4 ELISA法檢測(cè)TNF-α含量 孵育24h后，每孔取細(xì)胞吸取上清液20 μL，稀釋150倍，按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別于酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光吸收值。

2.3.5 薰衣草提取物IL-6的測(cè)定 孵育24 h后，每孔取細(xì)胞上清液50 μL，稀釋10倍后按試劑盒說明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度值。

3 結(jié)果與分析

3.1 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 薰衣草提取物XYC-1、XYC-3、XYC-4、XYC-5、XYC-6、XYC-7、XYC-8、XYC-9、XYC-11組對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹與空白對(duì)照組相比較有明顯的抑制作用(P<0.05)；XYC-3、XYC-5有及其明顯抑制作用(P<0.01)。見表1。

編號(hào)組別給藥劑量/mg/kg·d給藥前體重/g給藥后體重/g腫脹度/mg抑制率/%空白對(duì)照1CMC-NA———20.2±1.426.1±2.546±20———空白對(duì)照2食用油———20.6±1.724.2±3.642±10———陽性藥布洛芬12420.5±1.424.4±2.022±1050.98XYC-1水提部分317.420.1±0.826.3±2.327±1040.48*XYC-295%乙醇洗脫物6.320.9±1.625.4±4.133±1028.45XYC-350%乙醇洗脫物44.620.5±1.325.0±1.724±1046.61*XYC-430%乙醇洗脫物17.920.9±2.325.8±2.627±1040.48*XYC-5薰衣草精油5.020.9±1.321.8±3.223±1044.98ΔXYC-6醇提部分275.821.5±2.223.4±3.227±1041.14*XYC-7石油醚部位7.720.3±1.126.2±3.326±1042.45*XYC-8氯仿部位13.320.4±1.824.4±2.326±1042.89*XYC-9乙酸乙酯部位19.421.0±1.925.6±2.728±1038.95*XYC-10正丁醇部位15.721.0±2.225.5±1.733±1028.88XYC-11水部位9.620.4±1.825.9±2.126±1043.54*

注：XYC-5與空白對(duì)照2組比較，ΔP<0.05；其余與空白對(duì)照1組比較，*P<0.05。

3.2 對(duì)冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響 薰衣草提取物XYC-1、XYC-3、XYC-4、XYC-9、XYC-10、XYC-11組與空白對(duì)照組相比較可以抑制冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加(P<0.05)；其中XYC-3組有及其明顯抑制作用(P<0.01)。

編號(hào)組別給藥劑量/mg/kg·d給藥前體重/g給藥后體重/g吸光度抑制率/%空白1CMC-NA———18.6±1.424.2±1.60.5374±0.1558———空白2食用油———18.8±1.324.9±0.90.4093±0.1667———陽性藥布洛芬12418.8±1.424.4±1.80.3752±0.100630.19XYC-1水提部分317.418.7±1.523.5±2.10.3094±0.070842.43*XYC-295%乙醇洗脫物6.318.8±1.424.2±1.30.4096±0.103523.77XYC-350%乙醇洗脫物44.619.2±1.225.0±1.60.2696±0.064749.83*XYC-430%乙醇洗脫物17.918.8±1.623.7±1.20.3145±0.081441.49*XYC-5薰衣草精油5.019.3±1.224.9±1.30.3379±0.097317.45XYC-6醇提部分275.818.9±1.224.2±1.40.4046±0.139524.71XYC-7石油醚部位7.719.1±1.324.3±1.20.4311±0.057019.78XYC-8氯仿部位13.319.0±1.325.2±2.10.4481±0.158716.61XYC-9乙酸乙酯部位19.418.9±1.223.4±1.60.3568±0.148533.61*XYC-10正丁醇部位15.718.9±1.224.6±1.60.3521±0.072934.48*XYC-11水部位9.618.4±1.324.1±1.50.3482±0.146142.43*

注：XYC-5與空白對(duì)照2組比較，ΔP<0.05；其余與空白對(duì)照1組比較，*P<0.05。

3.3 抗炎細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 結(jié)果實(shí)驗(yàn)以LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7炎癥活化細(xì)胞為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)薰衣草不同提取部位對(duì)細(xì)胞活力的影響，以及對(duì)NO和TNF-α、IL-6的抑制作用。

3.3.1 對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響 細(xì)胞的生長(zhǎng)無抑制作用時(shí)薰衣草提取物梯度濃度為50 μg/mL，10 μg/mL，2 μg/mL，細(xì)胞活力均正常，細(xì)胞存活率趨近于100%。與模型組相比較，XYC-3、XYC-5具有不同程度抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO的釋放，NO含量隨著XYC-3、XYC-5濃度的增大而減小。見表3。

樣品編號(hào)樣品濃度/μg/mL細(xì)胞存活率/%NO濃度/μg/mLLPS———1006.49±0.63△對(duì)照———1001.13±0.20XYC-350.0099.133.43±0.16*10.001004.68±0.262.001006.23±0.22XYC-550.0099.214.13±0.18*10.001005.22±0.162.001005.53±0.13

注：與對(duì)照組比較比較,△P<0.05；與LPS組比較,*P<0.05。

3.3.2 TNF-α的測(cè)定 不同濃度的XYC-3和XYC-5作用于RAW264.7細(xì)胞后能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α的表達(dá)，并且具有濃度依賴性。

3.3.3 IL-6的測(cè)定 不同濃度的XYC-3和XYC-5作用于RAW264.7細(xì)胞后能夠抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6的表達(dá)，并且具有濃度依賴性。見表4。

樣品編號(hào)樣品濃度/μg/mLTNF-α濃度/ng/mLIL-6濃度/pg/mLLPS———1900.27±34.70#74.60±1.67#對(duì)照———112.78±17.7421.75±3.17XYC-350.00452.76±14.33*116.39±1.77*10.00741.28±19.08*467.53±2.012.00800.57±20.12*516.00±3.22XYC-550.00193.49±13.22*102.92±1.03*10.00200.19±14.65*316.70±2.232.001181.10±22.56*401.89±3.32

注：與對(duì)照組比較比較,#P<0.05；與LPS組比較,*P<0.05。

4 討論

薰衣草的抗炎作用從藥效上分析并尋找薰衣草抗炎的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)薰衣草揮發(fā)性部位、薰衣草水提取物、以及用大孔樹脂分離出不同的極性成分、薰衣草醇提取物、薰衣草各萃取部位使用二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)和毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)初步考察比較這些成分的抗炎作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，XYC-3(50%乙醇洗脫部分)、XYC-5(薰衣草精油部分)有及其明顯的抗炎作用。

實(shí)驗(yàn)以巨噬細(xì)胞RAW264.7為研究對(duì)象，通過MTS比色法檢測(cè)薰衣草提取物體外抗炎活性。MTS是新一代四氮唑藍(lán)鹽化合物，采用比色法檢測(cè)能夠考察細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)。檢測(cè)原理為：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTS還原為有色的甲臜(Formazan)[31]，該產(chǎn)物水溶性好、穩(wěn)定性高、顯色快，且顏色深淺與敏感細(xì)胞株的活細(xì)胞數(shù)在一定范圍內(nèi)呈高度相關(guān)。實(shí)驗(yàn)以酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，通過吸光值的變化反應(yīng)薰衣草提取物對(duì)RAW 264.7存活和生長(zhǎng)的影響。

通過Griess試劑對(duì)細(xì)胞上清中的NO進(jìn)行檢測(cè)，從而判斷薰衣草提取物對(duì)炎癥因子的抑制作用。NO在體內(nèi)或水溶液中極易氧化成NO2，在酸性條件下，NO與重氮鹽磺胺發(fā)生重氮反應(yīng)，并生成重氮化合物，后者進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺發(fā)生耦合反應(yīng)，該反應(yīng)生成的產(chǎn)物濃度與NO濃度具有線性關(guān)系，在540nm處有極大吸收峰[32]。實(shí)驗(yàn)以酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，通過吸光值的變化反應(yīng)NO釋放量，來判斷薰衣草提取物對(duì)炎癥因子的抑制作用。

用ELISA法對(duì)細(xì)胞上清液中TNF-α，IL-6進(jìn)行分析。由于TNF-α在炎癥過程中是由多種免疫和非免疫細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，有很強(qiáng)的炎癥損傷作用，是主要的炎性介質(zhì)之一，是巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生的主要促炎因子，能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增值和分化，具有很重要的生物功能[33]。IL-6是促炎細(xì)胞因子，通常是在免疫激活后第一個(gè)產(chǎn)生的，可加重炎癥疾病的病理過程，在先天性免疫和獲得性免疫中扮演者重要的角色，可以調(diào)控T淋巴細(xì)胞，使其分化和激活，誘導(dǎo)輔助T細(xì)胞的活化，使調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞和輔助性T淋巴細(xì)胞之間保持平衡，并且在慢性炎癥性疾病中發(fā)揮了重要的作用[34]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可知XYC-3(50%乙醇洗脫部分)、XYC-5(薰衣草精油部分)可抑制TNF-α和IL-6的分泌，從而達(dá)到抑制炎癥介質(zhì)的釋放，減輕炎癥反應(yīng)的目的。

通過小鼠急性炎癥實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)反應(yīng)了XYC-3(50%乙醇洗脫部分)、XYC-5(薰衣草精油部分)，在動(dòng)物水平和分子生物學(xué)水平均能夠有效的抑制炎癥因子的釋放，說明薰衣草該有效部位對(duì)炎癥疾病的治療具有潛在的作用，為薰衣草的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

[1]國家藥典委員會(huì)編．中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(維吾爾藥分冊(cè))[M]．烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：112．

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StudyontheAnti-inflammatoryActiveFractionofLavandulaaugustifoliaMill.

TAN Wei ZHANG Lanlan LI Chenyang SUN Yuhua*

Xinjiang Institute of Materia Medica,Urumqi 830004，China

ObjectiveTo search anti-inflammatory active fraction ofLavandulaaugustifoliaMill.MethodsThe inflammatory models of xylene-induced ear edema in mice and acetic acid-induced celiac capillary permeability increase were applied to evaluate their anti-inflammatory effect and the active sites were studied by the cell inflammatory model.ResultsThe XYC-3 and XYC-5 have evident inhibitory effects on swelling of auricle in mice(P<0.05); The XYC-3 have evident inhibitory effects on capillary permeability of mice(P<0.05);XYC-3 and XYC-5 have obvious inhibition of LPS induced NO production, and NO horizontal inhibition rate is proportional to the concentration of the extract. It can also inhibit the production of TNF-α and IL-6 in the RAW 264.7 cells of LPS stimulation, which can effectively inhibit the release of inflammatory factors.ConclusionTheLavandulaaugustifoliaMill. extraction sites as XYC-3 and XYC-5 have significant anti-inflammatory effects.

LavandulaaugustifoliaMill;Anti-inflammatory; Screen; RAW264.7

新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生計(jì)生委青年科技人才專項(xiàng)科研項(xiàng)目(2015Y37)。

譚為(1983-)，女，漢族，碩士研究生，副研究員，研究方向?yàn)槊褡遽t(yī)藥研發(fā)。E-mail:tw21cn@163.com

孫玉華(1983-)，女，漢族，碩士研究生，副研究員，研究方向?yàn)槊褡遽t(yī)藥研發(fā)。E-mail:Applechi0505@163.com

R965.1

A

1007-8517(2017)22-0030-05

2017-10-13 編輯：梁志慶)