梁穎紅 魏明 劉佳 龔艷杰 涂玲 張宜花

450052鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科

MiRNA-203在尋常性銀屑病皮損的表達(dá)及其對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響

梁穎紅 魏明 劉佳 龔艷杰 涂玲 張宜花

450052鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科

目的 研究微小核糖核酸（miRNA）-203在尋常性銀屑病患者皮損中的表達(dá)，并探討對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞株（HaCaT細(xì)胞）增殖的影響。方法 取2014—2016年23例尋常性銀屑病患者的皮損組織和相鄰非皮損組織。熒光定量PCR法檢測(cè)組織中miRNA-203的表達(dá)水平，并以5′端、3′端地高辛標(biāo)記的探針對(duì)皮膚組織切片中目的miRNA進(jìn)行原位雜交，觀察miRNA-203在皮膚組織中的定位情況。將miRNA-203模擬物（miRNA-203模擬物組）和miRNA-203模擬物陰性對(duì)照（陰性對(duì)照組）分別轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞，正常細(xì)胞培養(yǎng)組作為空白對(duì)照組，采用噻唑藍(lán)（MTT）法、流式細(xì)胞儀和Western印跡法分別對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期及相關(guān)周期蛋白（Cyclin D1、Cyclin B1）的變化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 miRNA-203特異性地表達(dá)在表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞中，除細(xì)胞核外，細(xì)胞質(zhì)亦有表達(dá)，且尋常性銀屑病患者皮損組織中miRNA-203表達(dá)水平（1.35±0.28）顯著高于非皮損組織（0.52±0.09），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.76，P=0.012）。轉(zhuǎn)染miRNA-203模擬物能抑制HaCaT細(xì)胞增殖（F=9.36，P=0.007），且空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miRNA-203模擬物組HaCaT細(xì)胞增殖率均隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加（F=18.68，P＜0.001）。與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，miRNA-203模擬物組HaCaT細(xì)胞被阻滯在G2/M期（G2/M期細(xì)胞比例：31.33%±4.56%比17.02%±3.53%、16.67%±3.32%，均P＜0.05），HaCaT細(xì)胞周期蛋白周期蛋白D1表達(dá)水平較高（1.15±0.13比0.52±0.05、0.56±0.07，均P＜0.05），而周期蛋白B1水平較低（0.43±0.08比0.93±0.16、0.91±0.0.15，均P＜0.05）。結(jié)論 miRNA-203可能參與了尋常性銀屑病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

銀屑病，尋常性；微小核糖核酸；角質(zhì)形成細(xì)胞；細(xì)胞增殖

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（micro-RNA，miRNA）在調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖分化、皮膚炎癥及免疫細(xì)胞之間的相互影響等方面發(fā)揮重要作用［1-2］。在銀屑病皮損中異常表達(dá)的各組成細(xì)胞中，只有角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)miRNA-203，具有高度皮膚特異性。通過(guò)限制表皮細(xì)胞增殖潛能、誘導(dǎo)其退出細(xì)胞周期，促進(jìn)表皮細(xì)胞分化［3-4］。但miRNA-203在銀屑病發(fā)生中的確切作用還不清楚。本研究用熒光定量PCR分析尋常性銀屑病患者皮損中miRNA-203的表達(dá)，同時(shí)以HaCaT細(xì)胞為研究模型，分析轉(zhuǎn)染miRNA-203模擬物對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及其相關(guān)蛋白的變化，探討miRNA-203在尋常性銀屑病中可能的作用，為開(kāi)展尋常性銀屑病的靶向治療提供部分依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.組織來(lái)源：2014—2016年鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院皮膚科23例尋常性銀屑病患者，其中男13例，女10例，年齡32.4±6.8（6～65）歲。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者術(shù)前均簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國(guó)臨床皮膚病學(xué)》［5］的尋常性銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)；排除標(biāo)準(zhǔn)：近2周內(nèi)局部外用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑；近1個(gè)月系統(tǒng)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、阿維A、補(bǔ)骨脂素等系統(tǒng)治療、紫外線治療及日光??；有心臟、肝腎疾病及精神疾病者；有感染、妊娠、分娩、外傷等應(yīng)激狀態(tài)；有各器官惡性腫瘤者。

2.細(xì)胞與主要試劑：人HaCaT細(xì)胞由上海復(fù)祥生物科技有限公司提供。miRCURYTM原位雜交探針（丹麥Exiqon公司）；Anti-DIG-AP抗體、四唑硝基藍(lán)（NBT）/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（BCIP）顯色試劑盒（瑞士Roche公司）。RNAiso試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光染料試劑SYBR Green I Master（日本TaKaRa公司）；Lipofectamine 2000 Reagent（德國(guó)Invitrogen公司）；二喹啉甲酸蛋白（BCA）試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒（美國(guó)Sigma公司）。鼠單克隆抗體、兔二抗、鼠二抗（英國(guó)Abcam公司）；周期蛋白B1、周期蛋白D1兔單克隆抗體（德國(guó)CST公司）。

二、方法

1.標(biāo)本獲取：局麻下行手術(shù)取材，術(shù)后立即將手術(shù)標(biāo)本的皮損區(qū)與相鄰非皮損區(qū)分離，一部分以4%甲醛固定、石蠟包埋，用于原位雜交，一部分于-196℃液氮中凍存，用于熒光定量PCR檢測(cè)miRNA-203。

2.原位雜交：將蠟塊制成4 μm組織切片，以5′端、3′端地高辛（DIG）標(biāo)記的目的探針行原位雜交，miRNA-203探針序列為5′-TAGTGGTCCTAAACATT TCA-3′。U6 snRNA探針為陽(yáng)性對(duì)照，序列為5′-CACGAATTTGCGTGTCATCCTT-3′，無(wú)義微小 RNA探針為陰性對(duì)照，序列為5′-GTGTAACACGTCTATA CGCCCA-3′。脫蠟后蛋白酶K消化10 min，54℃雜交儀中雜交2 h，堿性磷酸酶結(jié)合的抗地高辛抗體孵育1 h，NBT/BCIP（含2 mmol/L左旋咪唑）進(jìn)行顯色。各步驟均嚴(yán)格按照試劑操作說(shuō)明進(jìn)行，NIKON光學(xué)顯微鏡下觀察顯色情況，對(duì)miRNA-203的表達(dá)進(jìn)行定位。

3.熒光定量PCR檢測(cè)miRNA-203的表達(dá)：按照RNAiso RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取冷凍組織總RNA。以紫外分光光度計(jì)測(cè)總RNA純度及濃度。cDNA的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，以U6作為內(nèi)參照，引物序列分別為miRNA-203反轉(zhuǎn)錄：5′-CTCAACTGGT GTCGTGGA-3′，正向引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGG AG-3′，反向引物：5′-GGGTCAGTGCATCACAGAA-3′；U6 反轉(zhuǎn)錄：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′，正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)體系的配制及反應(yīng)條件的設(shè)置均按照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。用2-ΔΔCt計(jì)算miRNA-203相對(duì)表達(dá)量。

4.細(xì)胞培養(yǎng)：HaCaT細(xì)胞在含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的改良DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞單層鋪滿培養(yǎng)瓶后，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗1次，加0.25%胰蛋白酶消化液，待鏡下細(xì)胞圓縮時(shí)，DMEM培養(yǎng)液終止消化，細(xì)胞收集于離心管中，1 000×g離心5 min，棄上清，將細(xì)胞懸液分別移至冷凍管中，每管1.5 ml，將凍存管先置于4℃冰箱2 h，再移至-80℃低溫冰箱24 h，然后投入-196℃液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

5.miRNA-203模擬物的設(shè)計(jì)、合成、轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組：針對(duì)靶點(diǎn)miRNA-203設(shè)計(jì)其模擬物，其正向引物為 5′-UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU-3′，反向引物為5′-AAAGUUCUGUGAUGCACUGAUU-3′。按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書的要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合度時(shí)，按實(shí)驗(yàn)要求分組如下：空白對(duì)照組（僅加含Lipofectamine 2000的DMEM高糖培養(yǎng)基）、miRNA-203模擬物陰性對(duì)照組（加入含Lipofectamine 2000的DMEM高糖培養(yǎng)基和miRNA-203模擬物陰性對(duì)照物）、miRNA-203模擬物組（加入含Lipofectamine 2000的DMEM高糖培養(yǎng)基和miRNA-203模擬物）。孵育6 h后，置換為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

6.Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白：在HaCaT細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-203模擬物或陰性對(duì)照物后72 h，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。制備十二烷基磺酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量為12.5 μg，進(jìn)行常規(guī)電泳后，凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。取出轉(zhuǎn)移膜，用5%脫脂牛奶封閉。分別用兔抗人周期蛋白D1（1∶3 000）、周期蛋白 B1一抗（1∶1 500）、GAPDH一抗（1∶3 000）于4℃冰箱中孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，分別加入1∶3 000稀釋的兔、鼠二抗，室溫孵育1 h。TBST洗滌3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）液處理并發(fā)光顯像。

7.MTT法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染miRNA-203模擬物后的HaCaT細(xì)胞濃度調(diào)整為2×104/ml，96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入200 μl培養(yǎng)液。分別在轉(zhuǎn)染后的24、48、72和96 h，在各組孔內(nèi)加入5 g/L MTT工作液20 μl，繼續(xù)37 ℃孵育4 h。吸去上清液，每孔加入200 μl二甲基亞砜（DMSO），置平板搖床振蕩至結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處各孔的吸收度（A）值。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組同樣處理，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值，并繪制細(xì)胞增殖曲線。

8.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期：將HaCaT細(xì)胞鋪于6孔板并轉(zhuǎn)染。48 h后收集細(xì)胞，按照說(shuō)明書用RNA酶處理細(xì)胞后加入碘化丙錠（PI），避光孵育30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。尋常性銀屑病患者皮損與非皮損區(qū)miRNA-203表達(dá)的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；多組間細(xì)胞周期蛋白表達(dá)表達(dá)量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；分析轉(zhuǎn)染miRNA-203模擬物不同時(shí)間對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，調(diào)用多元方差分析中的LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、尋常性銀屑病患者皮損中miRNA-203的定位及表達(dá)

光學(xué)顯微鏡下觀察原位雜交切片，miRNA-203特異性地在角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)，除細(xì)胞核外，細(xì)胞質(zhì)亦有表達(dá)，在基底層表達(dá)較高，真皮中沒(méi)有明顯著色，見(jiàn)圖1。miRNA-203在尋常性銀屑病皮損區(qū)的表達(dá)（1.35±0.28）高于非皮損區(qū)（0.52±0.09），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.76，P=0.012）。

圖1 尋常性銀屑病患者皮損與非皮損中miRNA-203的定位（×100） 1A：非皮損區(qū)miRNA-203；1B：皮損區(qū)miRNA-203；1C：U6陽(yáng)性對(duì)照；miRNA-203特異性在角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)，除細(xì)胞核外，細(xì)胞質(zhì)亦有表達(dá)，呈藍(lán)紫色；尋常性銀屑病皮損區(qū)miRNA-203表達(dá)明顯高于非皮損區(qū)

二、miRNA-203與細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的關(guān)系

miRNA-203模擬物轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞72 h后，miRNA-203模擬物組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間細(xì)胞周期蛋白周期蛋白D1和周期蛋白B1的相對(duì)表達(dá)量均各不相同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=31.29、25.83，P ＜ 0.001）。miRNA-203模擬物組周期蛋白D1蛋白（1.15±0.13）顯著高于陰性對(duì)照組（0.52±0.05）和空白對(duì)照組（0.56±0.07），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t=11.26、10.45，P=0.012、0.015），而周期蛋白B1蛋白（0.43±0.08）顯著低于陰性對(duì)照組（0.93±0.16）和空白對(duì)照組（0.91±0.0.15），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t=15.33、15.16，P=0.009、0.009），見(jiàn)圖2。

圖2 Western印跡法分析轉(zhuǎn)染miRNA-203模擬物72 h后HaCaT細(xì)胞周期蛋白表達(dá) 1：空白對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：miRNA-203模擬物組

三、miRNA-203對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染miRNA-203模擬物后24、48、72、96 h對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3和表1。重復(fù)測(cè)量方差分析顯示，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miRNA-203模擬物組間HaCaT細(xì)胞增殖率不同（F=9.36，P=0.007），兩兩多重比較結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后48、72、96 h，miRNA-203模擬物組細(xì)胞增殖A值顯著低于空白對(duì)照組（LSD-t=3.24、4.56、8.67，均P ＜ 0.05）和陰性對(duì)照組（LSD-t=3.24、4.68、7.35，均P＜0.05），提示轉(zhuǎn)染miRNA-203模擬物能抑制HaCaT細(xì)胞的增殖；時(shí)間因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.68，P＜0.001），說(shuō)明HaCaT細(xì)胞增殖率有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)，如圖3所示，HaCaT細(xì)胞增殖A值隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加；時(shí)間和分組的交互作用沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.37，P=0.21），說(shuō)明各組HaCaT細(xì)胞增殖率隨時(shí)間變化的趨勢(shì)沒(méi)有明顯差異。

圖3 miRNA-203模擬物對(duì)HaCaT細(xì)胞株增殖的影響（490 nm熒光A值） 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miRNA-203模擬物組HaCaT細(xì)胞增殖A值均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，但48～96 h miRNA-203模擬物組

表1 轉(zhuǎn)染miRNA-203模擬物后對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響（A490，±s）

表1 轉(zhuǎn)染miRNA-203模擬物后對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響（A490，±s）

注：空白對(duì)照組為僅加入DMEM高糖培養(yǎng)基；陰性對(duì)照組為加入DMEM高糖培養(yǎng)基和miRNA-203模擬物陰性對(duì)照物；miRNA-203模擬物組：加入DMEM高糖培養(yǎng)基和miRNA-203模擬物；a每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)分組間的比較；bLSD-t檢驗(yàn)顯示，與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；cLSD-t檢驗(yàn)顯示，與陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

四、miRNA-203對(duì)HaCaT細(xì)胞G2/M期的影響

miRNA-203模擬物轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞48 h后，miRNA-203模擬物組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組G2/M期HaCaT細(xì)胞比例各不相同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.67，P ＜0.001），且miRNA-203模擬物組G2/M期HaCaT細(xì)胞比例（31.33%±4.56%）顯著高于陰性對(duì)照組（17.02%±3.53%）和空白對(duì)照組（16.67%±3.32%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t=10.68、11.02，P=0.018、0.016），見(jiàn)圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染miRNA-203模擬物48 h后對(duì)HaCaT細(xì)胞G2/M期的影響 4A：空白對(duì)照組；4B：陰性對(duì)照組；4C：miRNA-203模擬物組

討 論

研究表明，miRNA是一種普遍存在于真核生物中的小分子，已發(fā)現(xiàn)的上千條miRNAs基因中，絕大多數(shù)在不同組織及發(fā)育階段中的表達(dá)水平有差異，即miRNA的表達(dá)模式具有時(shí)間及空間特異性。Yi等［6］在對(duì)小鼠表皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，在小鼠發(fā)育的不同時(shí)期，miRNA-203的表達(dá)是不一樣的。隨后，Wei等［7］對(duì)人胚胎的研究也發(fā)現(xiàn)，miRNA-203在胚胎17周時(shí)才顯著表達(dá)，在14周前基本檢測(cè)不出；在沒(méi)有鈣離子、對(duì)苯二甲酸（TPA）等誘導(dǎo)分化因素存在時(shí)，miRNA-203也可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞的分化。提示miRNA-203在皮膚的增殖和分化中發(fā)揮了作用［8］。

本研究結(jié)果顯示，尋常性銀屑病患者皮損區(qū)miRNA-203的表達(dá)高于非皮損區(qū)，與Sonkoly等［9］研究結(jié)果一致。原位雜交結(jié)果顯示，miRNA-203幾乎特異性地表達(dá)在表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞，除細(xì)胞核外，細(xì)胞質(zhì)亦有表達(dá)，在基底層表達(dá)較高，真皮中沒(méi)有明顯著色。據(jù)此推測(cè)，尋常性銀屑病中miRNA-203的異常表達(dá)可能參與了銀屑病的發(fā)病過(guò)程，并可導(dǎo)致表皮細(xì)胞和浸潤(rùn)細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)功能障礙［10-11］。研究發(fā)現(xiàn)［12-13］，miRNA-203在人角質(zhì)形成細(xì)胞中可通過(guò)調(diào)控腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素24（IL-24）的編碼基因、直接結(jié)合IL-8 3′UTR等途徑，參與炎癥過(guò)程。

周期蛋白D1是G1到S期細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，是成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞增殖所必需的，如降低周期蛋白D1的表達(dá)，控制細(xì)胞周期G1期到S期的過(guò)度，可強(qiáng)有力地抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖。周期蛋白B1蛋白在整個(gè)細(xì)胞周期中的表達(dá)呈時(shí)相性變化，周期蛋白B1蛋白在G1期表達(dá)量極低，S期明顯增加，在G2期達(dá)到最高［14］。我們用HaCaT細(xì)胞作為研究模型，探討miRNA-203生物學(xué)功能。在HaCaT細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-203模擬物后，miRNA-203模擬物組HaCaT細(xì)胞增殖能力下降、細(xì)胞周期阻滯、周期蛋白下調(diào)，提示miRNA-203可能通過(guò)JAK/STAT信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化和周期改變［15］。

綜上所述，miRNA-203在尋常性銀屑病皮損區(qū)的表達(dá)顯著高于非皮損區(qū)，其表達(dá)定位在角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。miRNA-203與SOCS3、JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路有密切聯(lián)系，故有必要針對(duì)miRNA-203及其靶點(diǎn)進(jìn)行深入研究，揭示其在尋常性銀屑病中的作用機(jī)制。

［1］Labbaye C,Testa U.The emerging role of MIR-146A in the control of hematopoiesis,immune function and cancer［J］.J Hematol Oncol,2012,5:13.DOI:10.1186/1756-8722-5-13.

［2］禹歡歡,王曉華,蔡碧珊,等.銀屑病相關(guān)miRNAs表達(dá)的研究進(jìn)展［J］.皮膚性病診療學(xué)雜志,2015,（3）:258-260.DOI:10.3969/j.issn.1674-8468.2015.03.032.

［3］Sonkoly E,Lovén J,Xu N,et al.MicroRNA-203 functions as a tumor suppressor in basal cell carcinoma［J］.Oncogenesis,2012,1:e3.DOI:10.1038/oncsis.2012.3.

［4］Ralfkiaer U,Hagedorn PH,Bangsgaard N,et al.Diagnostic microRNA profiling in cutaneous T-cell lymphoma（CTCL）［J］.Blood,2011,118（22）:5891-5900.DOI:10.1182/blood-2011-06-358382.

［5］趙辨.中國(guó)臨床皮膚病學(xué)（下冊(cè)）［M］.南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,2010:1008-1025.

［6］Yi R,Poy MN,Stoffel M,et al.A skin microRNA promotes differentiation by repressing ′stemness′［J］.Nature,2008,452（7184）:225-229.DOI:10.1038/nature06642.

［7］Wei T,Orfanidis K,Xu N,et al.The expression of microRNA-203 during human skin morphogenesis［J］.Exp Dermatol,2010,19（9）:854-856.DOI:10.1111/j.1600-0625.2010.01118.x.

［8］Yang Y,Zeng ZY,Liu XH,et al.MicroRNA-203 inhibits cell proliferation by repressing ΔNp63 expression in human esophageal squamous cell carcinoma［J］.BMC Cancer,2011,11:57.DOI:10.1186/1471-2407-11-57.

［9］Sonkoly E,Wei T,Janson PC,et al.MicroRNAs:novel regulators involved in the pathogenesis of psoriasis?［J］.PLoS One,2007,2（7）:e610.DOI:10.1371/journal.pone.0000610.

［10］Rácz E,Prens EP.Molecular pathophysiology of psoriasis and molecular targets of antipsoriatic therapy［J］.Expert Rev Mol Med,2009,11:e38.DOI:10.1017/S146239940900129X.

［11］Sonkoly E,Wei T,Janson PC,et al.MicroRNAs:novel regulators involved in the pathogenesis of psoriasis?［J］.2007,2（7）:e610.DOI:10.1371/journal.pone.0000610.

［12］Primo MN,Bak RO,Schibler B,et al.Regulation of proinflammatory cytokines TNFα and IL24 by microRNA-203 in primary keratinocytes［J］.Cytokine,2012,60（3）:741-748.DOI:10.1016/j.cyto.2012.07.031.

［13］Wei T,Xu N,Meisgen F,et al.Interleukin-8 is regulated by miR-203 at the posttranscriptional level in primary human keratinocytes［J］.Eur J Dermatol,2013.DOI:10.1684/ejd.2013.1997.

［14］張三泉,高歆婧,丘文苑,等.TGM1基因表達(dá)沉默對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞周期及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志,2014,（44）:3478-3482.DOI:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2014.44.007.

［15］王健,鄒仲敏,趙吉清.MiR-203及其調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代生物學(xué)進(jìn)展,2012,14（12）:2743-2747.DOI:10.13241/j.cnki.pmb.2012.14.014.

Expression of miRNA-203 in psoriasis vulgaris skin lesions and its effect on the proliferation of HaCaT cells

Liang Yinghong,Wei Ming,Liu Jia,Gong Yanjie,Tu Ling,Zhang Yihua
Clinical Laboratory,Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

Wei Ming,Email:gushiweiming@126.com

Objective To investigate the expression of miRNA-203 in skin lesions of patients with psoriasis vulgaris,and to explore its effect on the proliferation of a human keratinocyte cell line HaCaT.Methods Lesional skin and adjacent non-lesional skin tissues were obtained from 23 patients with psoriasis vulgaris from 2014 to 2016.Fluorescence-based quantitative PCR was performed to determine the expression of miRNA-203 in these skin tissues.Targeted miRNA in skin tissues was in situ hybridized by using 5′and 3′digoxigenin-labelled probes,so as to localize the expression of miRNA-203 in skin tissues.Cultured HaCaT cells were divided into 3 groups:miRNA-203 mimic group and negative control group transfected with miRNA-203 mimics and negative control miRNA-203 respectively,and blank control group receiving no treatment.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay,flow cytometry and Western blot analysis were performed to investigate changes in cellular proliferative activity,cell cycle and its related proteins Cyclin D1 and Cyclin B1 in HaCaT cells respectively.Results MiRNA-203 was specifically expressed in epidermal keratinocytes.Besides the cell nuclei,it could be expressed in the cytoplasm.In the patients with psoriasis vulgaris,the expression of miRNA-203 was significantly higher in lesional skin tissues than in nonlesional skin tissues（1.35 ± 0.28 vs.0.52 ± 0.09,t=6.76,P=0.012）.The transfection with miRNA-203 mimics could significantly inhibit the proliferation of HaCaT cells（F=9.36,P=0.007）.Additionally,the blank control group,negative control group and miRNA-203 mimic group all showed a gradual increase in proliferative activity of HaCaT cells over time（F=18.68,P ＜ 0.001）.HaCaT cells were arrested in G2/M phase in the miRNA-203 mimic group with the percentage of cells in G2/M phase being 31.33%±4.56%,compared to 17.02% ±3.53%in the negative control group（P＜0.05）and 16.67% ±3.32%in the blank control group（P ＜ 0.05）.Moreover,the miRNA-203 mimic group showed significantly higher protein expression of Cyclin D1（1.15 ± 0.13）,but significantly lower protein expression of Cyclin B1（0.43 ±0.08）,compared with the negative control group（0.52±0.05,0.93±0.16,respectively,both P ＜0.05）and blank control group（0.56±0.07,0.91±0.0.15,respectively,both P＜0.05）.Conclusion MiRNA-203 may participate in the occurrence and development of psoriasis vulgaris.

Vulgaris,psoriasis;MicroRNA;Keratinocyte cells;Cell proliferation

魏明，Email：gushiweiming@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.006

2017-01-16）

（本文編輯：周良佳 顏艷）