楊輝

【摘 要】目的探究基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀在臨床微生物鑒定中的應(yīng)用，為真菌微生物的鑒定提供臨床技術(shù)支持。方法選取于2015年3月到2017年2月我院臨床采集的真菌作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，利用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)菌種進(jìn)行鑒定，分析基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)菌種鑒定的檢查效果。結(jié)果300株真菌中有290株（96.67%）經(jīng)鑒定后可以正確歸類到種水平，6株（2%）未能給出鑒定成果，4株（1.33%）鑒定結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤，且正確率與傳統(tǒng)方法相比差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀穩(wěn)定性高，可重復(fù)性好，并且具有快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，是臨床鑒定微生物種類的一種快速可靠的高通量方法，可以為臨床的微生物鑒定提供一定的技術(shù)支持。

【關(guān)鍵詞】基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀；微生物鑒定；臨床應(yīng)用

真菌感染是指由于機(jī)體感染真菌而引起的一系列疾病，感染類型大致包括表面感染，皮膚感染，皮下組織感染，深部感染以及條件性感染[1-4]。發(fā)生真菌感染的原因有很多，主要包括以下五個(gè)方面：（1）濫用抗生素：隨著光譜抗生素的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的人們選擇利用抗生素來(lái)治療細(xì)菌感染，這些抗生素在治療感染的同時(shí)也會(huì)減少有益菌的數(shù)量，從而破壞機(jī)體菌種平衡。（2）糖皮質(zhì)激素的過量使用：針對(duì)炎癥患者以及皮膚病患者糖皮質(zhì)激素的使用是必不可少的，然而這些藥物的使用卻會(huì)導(dǎo)致人體的免疫系統(tǒng)功能下降，為真菌感染創(chuàng)造了有利條件。（3）遺傳因素：遺傳因素也是機(jī)體產(chǎn)生真菌感染的一個(gè)重要原因，相對(duì)于正常人，這類人群由于遺傳物質(zhì)的差異性導(dǎo)致他們更容易受到真菌的侵襲。（4）免疫系統(tǒng)功能障礙：由于化療或者免疫系統(tǒng)缺陷癥等因素導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)功能發(fā)生障礙，從而給真菌染感染創(chuàng)造了一個(gè)適宜生長(zhǎng)的環(huán)境[5-9]。因此真菌感染在臨床上也越來(lái)越多見。常見的實(shí)驗(yàn)室真菌鑒定方法是常規(guī)傳統(tǒng)真菌鑒定方法，這種方法操作復(fù)雜，鑒定周期較長(zhǎng)，對(duì)于設(shè)備以及技術(shù)水平的要求較高，因此往往會(huì)造成臨床診斷以及治療的滯后性，會(huì)廣大醫(yī)患人員帶來(lái)較大的困擾，然而隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)出現(xiàn)在人們視野之中。基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)是一種快速鑒定微生物種類的新技術(shù)，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物等多個(gè)領(lǐng)域[10]。因此本次研究通過比較傳統(tǒng)真菌鑒定方法與基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)菌種鑒定的準(zhǔn)確率，探究基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀在臨床微生物鑒定上的應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 菌種來(lái)源

本次研究一共選取300株真菌作為研究對(duì)象，全部菌株均來(lái)自于2015年3月到2017年2月我院臨床采集的真菌，質(zhì)控菌種為白念珠菌ATCC14053和大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

法國(guó)梅里埃公司的基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀以及配套的數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)，電子顯微鏡，水浴鍋，無(wú)菌注射器，基質(zhì)液，一次性無(wú)菌試管，全自動(dòng)微生物鑒定儀，真菌培養(yǎng)箱，離心機(jī)，移液槍等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)采集來(lái)的真菌標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)，標(biāo)本接種在平板上在36℃的真菌培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，直到肉眼可見菌落時(shí)進(jìn)行細(xì)菌種類鑒定。對(duì)所有菌種同時(shí)采用兩種方法進(jìn)行鑒定，分別為常規(guī)傳統(tǒng)真菌鑒定方法以及基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)比兩種結(jié)果準(zhǔn)確率。常規(guī)真菌鑒定方法是將菌落進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)對(duì)菌落進(jìn)行鏡檢，通過對(duì)菌落的形態(tài)以及革蘭氏染色結(jié)果進(jìn)行分析。基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜法是將真菌接種到靶板上，然后再菌膜沒有完全干燥之前加入α-腈基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)，等待基質(zhì)和菌株混合物完全干燥后將樣本放入儀器中進(jìn)行分析掃描，利用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定，判斷菌株種類。結(jié)果結(jié)果可信程度在60.0%-99.9%之間且結(jié)果為一個(gè)是認(rèn)為該結(jié)果可以接受。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用百分比表示，進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 真菌鑒定種類分布

經(jīng)過鑒定，300株真菌種類分別為：熱帶念珠菌、白色念珠菌、阿薩斯酵母菌、煙曲霉米曲霉、宛氏擬青霉、煙草赤星病菌，詳細(xì)數(shù)據(jù)見下表。

2.2 兩種方法鑒定真菌的正確率比較

本次研究采用了兩種真菌鑒定方法，常規(guī)鑒定組共檢查300株真菌，其中正確的有156株，正確率為52.00%，100例檢查錯(cuò)誤，44例未檢出；基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)共檢查300株真菌，其中290株檢查正確，正確率為96.67%， 6株（2%）未能給出鑒定成果，4株（1.33%）鑒定結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤。兩組檢查方法正確率存在差異，基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢查正確率遠(yuǎn)高于常規(guī)鑒定組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。詳細(xì)數(shù)據(jù)見表2

3 討論

基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)是近年來(lái)出現(xiàn)的一種軟電離新型有機(jī)質(zhì)譜，這種新的技術(shù)手段已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)行業(yè)，是檢測(cè)和鑒定多肽大分子物質(zhì)以及蛋白質(zhì)的有效手段，具有十分高的靈敏度，并且檢測(cè)的準(zhǔn)確率高，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)周期短，穩(wěn)定性高，是十分方便快捷的技術(shù)[11-13]?；|(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)可應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，其中基于細(xì)菌表面蛋白分子量進(jìn)行細(xì)菌鑒定的技術(shù)尤為引人注意。通過將微生物和等量的基質(zhì)分別點(diǎn)加在加樣板上形成混合物，然后利用激光的能量使樣品解離，通過計(jì)算不同物質(zhì)飛行時(shí)間不同來(lái)檢測(cè)離子分子量，然后應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理，生成特異性的蛋白質(zhì)組指紋圖，從而進(jìn)行對(duì)比分析，鑒定微生物種類[14-16]。由于這種檢測(cè)方法是利用蛋白質(zhì)圖譜來(lái)進(jìn)行的，而每種微生物的蛋白組成受遺傳因素的影響，不受外界環(huán)境等因素的制約，因此相對(duì)于其他的檢測(cè)手法，這種蛋白質(zhì)圖譜法能更為直觀準(zhǔn)確的進(jìn)行微生物的鑒定。endprint

在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)新的基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢查的正確率為96.67%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的檢查手法，說(shuō)明基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)具有準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)，并且在進(jìn)行實(shí)際的操作實(shí)驗(yàn)中，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法是基于形態(tài)學(xué)或生理生化特性進(jìn)行鑒定，需要的時(shí)間較長(zhǎng)，且操作繁瑣，而且對(duì)于一些相似的菌種鑒別過程仍然存在一定的困難；但是利用這種新型技術(shù)操作的時(shí)間就大大減少，首先進(jìn)行2-3天的菌株培養(yǎng)，等待菌株生長(zhǎng)完成后進(jìn)行樣本的制備，該過程僅需花費(fèi)不到半個(gè)小時(shí)，因此時(shí)間大大的減少。曾有研究表明[17]，基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)常見的人畜病原菌檢測(cè)中具有較好的準(zhǔn)確率，對(duì)于單增李斯特菌、沙門氏菌、肺炎鏈球菌等病原菌都有十分高的準(zhǔn)確率。Phillips等曾經(jīng)對(duì)對(duì)來(lái)自病人的437個(gè)菌株進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)試，差異結(jié)果用16S 基因進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法鑒定菌株的正確率高達(dá)95.1%[18]。同時(shí)對(duì)980 株來(lái)自臨床的細(xì)菌和酵母菌株進(jìn)行確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)鑒定種的正確率（95.34%）明顯高于傳統(tǒng)的生化鑒定系統(tǒng)（83.1%）。并且，這種新型技術(shù)可以直接檢測(cè)來(lái)自醫(yī)院臨床病人的樣本，不需要經(jīng)過純培養(yǎng)，因此檢測(cè)時(shí)間短，對(duì)于患者的臨床診斷以及治療有很大的幫助作用，在急性病原菌感染患者的檢測(cè)和治療上均有十分廣闊的應(yīng)用前景[19，20]。

綜上所述，基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在微生物鑒定上具有高正確率、高敏感性以及高穩(wěn)定性，并且操作簡(jiǎn)單，鑒定周期短，價(jià)格低廉，適合在臨床上進(jìn)行推廣應(yīng)用。

【參考文獻(xiàn)】

[1]邱炳峰，張曉飛，顧丹霞，等.VITEK MS基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在病原菌鑒定中的應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2016，26（10）：2199-2202.

[2]李媛睿，俞靜，劉瑛.基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在革蘭陰性桿菌對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)感染與化療雜志，2016，16（2）：229-234.

[3]李媛睿，劉婧嫻，俞靜，等.應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌對(duì)厄他培南的水解能力[J].中國(guó)感染與化療雜志，2016，16（5）：608-613.

[4]黃永祿，李佳萍，顧丹霞，等.采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜快速檢測(cè)產(chǎn)KPC大腸埃希菌ST131和ST405分型的研究[J].中國(guó)感染與化療雜志，2016，16（4）：460-464.

[5]李曉紅，丁進(jìn)亞，劉杰，等.基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜用于產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌ST11分型的研究[J].東南國(guó)防醫(yī)藥，2016，18（3）：240-243.

[6]梁達(dá)煒，梁權(quán)輝，方艷平，等.基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜快速鑒定沙門菌臨床分離株[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2016，32（7）：600-603.

[7]謝小芳，周惠琴，鄭毅，等.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)直接鑒定血流感染病原菌的效果評(píng)價(jià)[J].中華臨床感染病雜志，2016，9（2）：152-155.

[8]葉阿里，張海燕，竇亞玲，等.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)藥物代謝酶基因多態(tài)性平臺(tái)的建立[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，31（5）：30-33.

[9]王瑩宇，康海全，鄧麗華，等.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)鑒定臨床非發(fā)酵革蘭陰性桿菌[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2016，34（11）：833-834.

[10]任淑華，金慧，趙洪峰，等.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在醫(yī)院感染暴發(fā)期間環(huán)境污染調(diào)查中的應(yīng)用與評(píng)價(jià)[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2016，26（11）：2459-2461.

[11]江連洲，曹飛揚(yáng)，陳穎，等.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜快速鑒定蠟樣芽胞桿菌研究與應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，47（12）：56-64.endprint