陳靜茹,夏海劍,張澤賓,曲魯江,劉 毅,李興民,*
PCR技術(shù)鑒別多趾北京油雞肉
陳靜茹1,夏海劍2,張澤賓2,曲魯江2,劉 毅1,李興民1,*
(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,北京 100094)
北京油雞是我國珍貴的地方品種,在自然群體中,部分個體表現(xiàn)出多趾性狀,該性狀是由于其LMBR1基因的246bp處發(fā)生突變,突變位點的堿基由C突變?yōu)锳時表現(xiàn)出多趾形狀。本實驗根據(jù)多趾北京油雞肉基因型與華都艾拔益加肉雞基因型的不同,通過聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)測序法和限制性酶切片段多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)技術(shù),確定突變位點的堿基為A或C,從而準確鑒定食品中多趾北京油雞肉與華都艾拔益加肉雞的區(qū)別。
北京油雞;艾拔益加肉雞;多趾;PCR測序;限制性酶切片段多態(tài)性(RFLP)
隨著我國食品工業(yè)的快速發(fā)展,市場上不斷出現(xiàn)各種各樣的肉類食品摻假方式。目前,國內(nèi)市場在肉及肉制品的生產(chǎn)銷售中,一些不良商家通過摻雜摻假、以次充好等手段欺騙消費者,以謀取暴利的事件經(jīng)常發(fā)生。這不僅僅涉及到經(jīng)濟、營養(yǎng)價值和食品安全等問題,甚至?xí)婕白诮绦叛鰡栴},如在清真食品中摻雜豬肉等[1-2]。因此,對食品原料肉進行摻假、摻雜的檢驗十分必要,鑒定肉制品的品種來源重點就是找到快速、準確的方法。
北京油雞又稱“中華宮廷黃雞”,以其外形獨特,肉味鮮美而著稱,是我國珍貴的優(yōu)良地方品種[3]。在自然群體中,北京油雞和絲羽烏骨雞部分個體均存在多趾性狀,具有多趾遺傳特征[4]。其中絲羽烏骨雞屠宰后可以通過骨頭顏色進行鑒別,而北京油雞卻無法進行有效的鑒別。為解決屠宰后的北京油雞肉與其他雞肉無法區(qū)別的問題,目前將多趾形狀在北京油雞群體中固定下來的育種工作正在進行,從而為商品雞提供屠體標識。但目前對切割加工后的多趾北京油雞肉還是無法進行快速有效鑒別。
原料肉檢測的傳統(tǒng)方法包括感官檢驗和免疫學(xué)方法[5-6],這2 種方法可以鑒別生鮮肉的種屬,但對于熱加工處理的肉類,因為其感官性狀、蛋白質(zhì)成分和其他的免疫原性物質(zhì)被損壞而難以鑒別。因此,在肉類種屬精確鑒定的研究領(lǐng)域,找到方便、快速、準確的方法對食品中動物源成分進行鑒別成為研究者關(guān)注的熱點[7-15]。聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)測序法原理是DNA的半保留復(fù)制以及通過溫度變化來控制DNA的變性和復(fù)性,其具體過程:首先DNA變性從雙鏈變?yōu)閱捂湥偻ㄟ^與引物結(jié)合互補變成部分雙鏈,之后在DNA聚合酶的作用下延伸從而得到完整的DNA雙鏈,使得DNA完成復(fù)制。通過PCR方法,可以擴增得到大量的DNA片段,結(jié)合凝膠電泳、測序等方法即可完成DNA鑒定,從而確定物種的類別[16]。隨著PCR檢測技術(shù)的不斷完善和發(fā)展,該技術(shù)已經(jīng)漸漸成為國內(nèi)外最成熟、最廣泛使用的肉類摻假檢測技術(shù)[17-22]。北京油雞的LMBR1基因,246bp處為突變位點,堿基為A或C,突變位點的堿基為A時表現(xiàn)出多趾性狀[23],如圖1所示。
圖1 多趾北京油雞Fig. 1 Multi-toed foot of Beijing-you chicken
本實驗取多趾北京油雞(實驗組)和市售華都艾拔益加肉雞(對照組)的雞胸肉為樣品,提取生肉、熱處理(煮制、烤制、炸制)熟肉的基因組DNA為模板,鑒定了食品中多趾北京油雞肉與艾拔益加肉雞的區(qū)別,為北京油雞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供一定理論依據(jù)。
1.1 材料與試劑
多趾北京油雞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料所南口試驗基地提供,華都艾拔益加肉雞購自美廉美超市。
瓊脂糖 西班牙Biowest公司;Mix 北京匯天東方科技有限公司;ddH2O由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽實驗室提供;引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成;TAE緩沖液、1 g/100 mL瓊脂糖凝膠、上樣緩沖液loading buffer、Marker、EB替代物 北京賽百盛基因技術(shù)有限公司;血液組織細胞基因組提取試劑盒和深加工食品DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
PTC-1000PCR擴增儀、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 美國Bio-Rad公司;5424R型離心機 德國Eppendorf公司;DGG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司;IMS-20型全自動雪花制冰機 常熟市雪科電器有限公司;ImageQuant300凝膠成像系統(tǒng) 美國GE公司;微波爐 韓國LG集團。
1.3 方法
1.3.1 實驗樣品的采集與處理
以多趾北京油雞為實驗組和華都艾拔益加肉雞為對照組,將生肉進行熱處理(不同溫度煮制、烤制、炸制)為熟肉進行下一步的實驗。每個樣品進行2次重復(fù)實驗。
熱處理方法為分別取雞胸肉100 g于75、85、95 ℃熱水中加熱30 min,為煮制樣品;取雞胸肉50 g進行微波烤制,先微波低火(700 W)烤制12 min,再高火(900 W)烤制8 min,得到烤制樣品;將雞胸肉切成大約1 cm×1cm×1 cm的小塊,待油鍋內(nèi)溫度為170 ℃左右時,將雞塊裹上淀粉糊放入鍋內(nèi)油炸,炸制2 min至表面金黃,得到炸制樣品。
1.3.2 模板DNA的制備
選用血液組織細胞基因組提取試劑盒(DP 304)和深加工食品DNA提取試劑盒(DP 326)分別提取生肉樣品的DNA和熟肉樣品的DNA,實驗操作均按照相應(yīng)說明書進行,DNA提取后置于4℃冰箱保存。
1.3.3 目的條帶的PCR擴增
根據(jù)樣品的數(shù)量,確定所需要擴增體系的個數(shù)。一般考慮到溶液損失,會適當增加擴增體系的個數(shù)。1個體系的試劑用量如表1所示,配比后混合均勻。
表1 PCR擴增體系Table 1 PCR amplification system
取消毒滅菌后的96 孔板,每個孔中加24 μL DNA擴增體系和1 μL DNA,3 000 r/min離心1 min,使整個體系沉降,減少氣泡,便于擴增。將96 孔板放入PCR儀中,循環(huán)程序為:95 ℃變性20 s,68 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35 個循環(huán)。擴增結(jié)束后,取出96 孔板,置于4 ℃冰箱保存。擴增片段長度為389 bp。
1.3.4 擴增產(chǎn)物的凝膠電泳檢測
參照夏海劍[24]的方法進行凝膠電泳。其中瓊脂糖質(zhì)量濃度為1.2 g/100 mL,電泳條件為120 V、30 min。
1.3.5 測序
由北京六合華大基因科技股份有限公司合成實驗組和對照組的DNA擴增產(chǎn)物,進行測序。
1.3.6 酶切
使用限制性內(nèi)切酶BsrDⅠ,酶切1.3.5節(jié)PCR擴增產(chǎn)物。酶切反應(yīng)體系見表2,按照表中的數(shù)據(jù),配制酶切體系,考慮到會有損失,配制的體系個數(shù)應(yīng)多于實際酶切數(shù)量。應(yīng)注意在配制過程中將BsrDⅠ、10×酶切緩沖液和ddH2O置于冰盒上。
表2 酶切體系Table 2 Enzymatic digestion system
將滅菌后的96 孔板置于冰上,每個孔加入18 μL配制好的酶切液。然后依次加入不同的PCR擴增產(chǎn)物2 μL,3 000 r/min離心1 min。立即放入PCR儀中,65 ℃恒溫4 h。酶切結(jié)束后,在每個含酶切產(chǎn)物的孔中加入3 μL沉降緩沖液,并使用移液槍抽吸幾次,使其混合均勻,以使點樣后的酶切產(chǎn)物能沉降。
2.1 PCR測序法對多趾北京油雞生肉和熟肉樣品的鑒定
北京油雞的LMBR1基因,246 bp處為突變位點,堿基為A或C,突變位點的堿基為A時表現(xiàn)出多趾形狀。其中野生型純合體的基因型為CC,性狀為4趾;突變型雜合體的基因型為AC,性狀為多趾;突變型純合體的基因型為AA,性狀為多趾。根據(jù)GenBank(ID:NC-006089)設(shè)計引物,使得擴增得到的目的片段包括GenBank(ID:NC-006089)的第5個內(nèi)含子的第4 645位脫氧核苷酸,引物序列如下:U(上游引物):5’-GCGATTTCCTCTCACCCACA-3’;D(下游引物):5’-AGCTGAGCAACATGACAGCA-3’。
將不同處理條件下對照組(市售華都艾拔益加肉雞)和實驗組(多趾北京油雞)進行PCR擴增后,凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物,如圖2所示。然后將擴增產(chǎn)物進行測序,使用DNAstar軟件將測序結(jié)果進行對比,如圖3所示。由圖2可知,提取樣品的基因組DNA進行PCR擴增之后的條帶大小為400 bp左右,與曲魯江等[23]的研究結(jié)果一致。樣品在經(jīng)過不同溫度的煮制、烤制以及炸制后,PCR擴增結(jié)果一致,瓊脂糖凝膠電泳檢測之后條帶大小均為389 bp,說明不同的熱處理(煮制、烤制、炸制)對實驗組和對照組樣品DNA的提取效果影響不大,不同溫度的煮制條件(75~95 ℃)對PCR的測序結(jié)果基本沒有影響。另外,多趾北京油雞樣品在突變位點發(fā)生了由C到A的突變,其中野生型純合體的基因型為CC,突變型雜合體的基因型為AC,突變型純合體的基因型為AA。測序之后在該堿基位點處,不同基因型和左右堿基的峰值的相對高度各不相同,CC型峰值較高,AC型為兩個雜峰混在一起,峰值較矮(圖3),因為此次實驗所用多趾北京油雞均為雜合子,所以測序之后并沒有突變型純合體AA型的峰值結(jié)果。以上分析表明,通過測序的方法可以有效鑒別出不同條件下(生雞肉和煮制、烤制、炸制熟雞肉)的多趾北京油雞肉和市售華都艾拔益加肉雞肉。
圖2 實驗組和對照組PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 2 Electrophoresis of PCR amplified products from raw and cooked meat samples from Beijing-you chicken and AA broiler
圖3 實驗組和對照組測序結(jié)果Fig. 3 Sequencing results of PCR amplified products from raw and cooked meat samples from Beijing-you chicken and AA broiler
PCR測序法簡單快捷,可直接根據(jù)物種特異性序列進行PCR擴增然后進行測序鑒定[25]。Bottero等[16]通過設(shè)計線粒體12S rRNA基因的特異性引物進行PCR擴增得到234 bp和265 bp,鑒別熱處理樣品中豬肉、牛肉、綿羊肉、山羊肉、馬肉、雞肉、兔肉、鮭鱒魚和歐洲的沙丁魚。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序驗證,其檢測限達到0.0625%。測序鑒定是最直接最有效的PCR擴增產(chǎn)物的分析方法,它通常被用于對凝膠電泳和熒光定量PCR結(jié)果的確切分析。
2.2 PCR測序法和限制性酶切片段多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析法對生肉和熟肉樣品的鑒定
圖4 BsrDⅠ酶切位點Fig. 4 BsrDⅠrestriction sites
多趾北京油雞在LMBR1基因(GenBank ID:NC_006089)的第5位內(nèi)含子的第4645位發(fā)生了由C到A的突變,經(jīng)過使用特定引物對實驗組和對照組不同處理樣品DNA進行擴增,得到含有該突變位點的擴增產(chǎn)物片段。本實驗選用的是BsrDⅠ酶切擴增產(chǎn)物,其酶切序列如圖4所示,其中箭頭所指的位置是酶切位點,N代表任何堿基。根據(jù)圖4可知,在突變位點的堿基為C時,BsrDⅠ能切斷DNA,當該位點堿基為A時,BsrDⅠ不能切斷DNA。酶切后將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,若電泳顯示為2 條條帶,則待測雞只的基因型為CC型;若電泳顯示為1 條條帶,則待測雞只的基因型為AA型;若電泳顯示為3 條條帶,則待測雞只的基因型為AC型。基因型為CC的個體趾性狀表現(xiàn)為4趾,檢測結(jié)果為普通雞肉;基因型為AA和AC的個體趾性狀表現(xiàn)為多趾,檢測結(jié)果為多趾北京油雞肉。從而有效完成多趾北京油雞肉的鑒別。本次實驗提取實驗組和對照組基因組DNA后,進行PCR擴增,用BsrDⅠ對擴增產(chǎn)物進行酶切后,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖5所示。
圖5 實驗組和對照組酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 5 Electrophoresis of digestion products of PCR amplified genomic DNA from raw and cooked meat samples from Beijing-you chicken and AA broiler
由圖5可知,實驗組和對照組在經(jīng)過65 ℃酶切4 h后,瓊脂凝膠電泳的結(jié)果有很大的差別。其中多趾北京油雞基因組DNA在LMBR1基因(GenBank ID:NC_006089)的第5內(nèi)含子的第4645位發(fā)生了由C到A的突變,經(jīng)過BsrDⅠ酶切后,其400 bp左右的擴增產(chǎn)物,被酶切為2 個片段,片段長度分別為200多個堿基對和100多個堿基對。根據(jù)電泳結(jié)果可知,本次實驗所取的多趾北京油雞均為突變型雜合體,其基因型為AC,酶切電泳結(jié)果為3 條條帶;市售華都艾拔益加肉雞基因型為野生型純合體CC,酶切電泳結(jié)果為2 條條帶,片段長度分別為200多個堿基對和100多個堿基對。通過實驗組和對照組的酶切結(jié)果可以明顯鑒別出多趾北京油雞,且在不同熱處理(煮制、烤制、炸制)下,酶切之后的電泳結(jié)果一致,說明PCR-RFLP分析法同PCR測序法一樣,在鑒別檢測過程中不受煮制、烤制或炸制處理的影響。
RFLP是根據(jù)是否存在特定限制性內(nèi)切酶所識別的堿基位點而確定的。對于某一個內(nèi)切酶來說,識別位點上堿基的突變、DNA片段上一個或者多個堿基對的插入、缺失或重組等,都可導(dǎo)致限制性片段的多態(tài)性[26]。限制性內(nèi)切酶對特定序列的選擇和擴增片段的長短影響PCR-RFLP分析法對物種的鑒別。目前PCR-RFLP技術(shù)在肉類鑒別中廣泛應(yīng)用,如馮海永等[27]在線粒體基因細胞色素b的DNA上設(shè)計出了羊(山羊、綿羊)和鴨的通用引物,然后分別用限制性內(nèi)切酶SpeⅠ和Bsu36Ⅰ酶切鴨和羊的PCR產(chǎn)物,進行限制性片段長度多態(tài)性分析,該方法可作為一種對羊肉和鴨肉快速檢測的簡便易行的方法。Girish等[28]利用一對通用引物對禽類12S rRNA基因擴增后酶切,可以鑒別出雞、鴨、火雞、雉和鵪鶉。Wang qi等[29]把熒光標記引物檢測和多種酶的酶切進行結(jié)合,成功鑒定了豬、狗、牛、山羊、綿羊、馬、雞、鼠、三文魚和鹿等12 種常見物種。PCR-RFLP技術(shù)是一種可靠性高、重復(fù)性好且簡便易行的物種鑒定技術(shù),但其受到當前已知內(nèi)切酶的種類和識別位點的限制,有時需要2 種或以上的內(nèi)切酶進行酶切才能進行鑒別[30]。
PCR技術(shù)作為一種快速、精確的檢測方法,在肉類鑒別中的應(yīng)用越來越廣泛。本實驗通過應(yīng)用PCR測序法和PCR-RFLP法,提取不同溫度煮制、烤制以及炸制處理條件下多趾北京油雞和市售華都艾拔益加肉雞的DNA進行檢測。其中PCR測序法通過使用軟件DNAstar將測序結(jié)果進行對比,從而直接分析突變位點的基因完成鑒別;PCR-PFLP法通過實驗組和對照組的酶切結(jié)果分析條帶數(shù)間接確定突變位點的堿基,從而完成鑒別。這2 種方法在鑒別檢測過程中不受煮制、烤制或炸制處理的影響,均可以有效完成對多趾北京油雞肉的鑒別,為市售多趾北京油雞肉的檢測提供了理論依據(jù)。
本實驗只能鑒別出多趾北京油雞,無法鑒別全部的北京油雞,只選擇了華都艾拔益加肉雞作為對照組,具有局限性。在該方法結(jié)果的基礎(chǔ)上探索普通北京油雞與其他雞品種的區(qū)別,從而完成進一步的鑒別。另外酶切條件在實驗中特別重要,之后應(yīng)再補充實驗進一步優(yōu)化酶切條件,在縮短實驗時間達到快速檢測的同時,保證對照組可以被充分酶切。
PCR檢測方法具有精確、快速、操作簡單、節(jié)省費用等優(yōu)點,已經(jīng)逐漸成為肉類產(chǎn)品檢測的主要方法。目前還有很多以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)對肉的品種進行鑒別的研究,更加快速、簡便的物種鑒別新方法也會陸續(xù)出現(xiàn),肉制品的安全性也會大大提高。
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Identification of Multi-Toed Beijing-You Chicken by PCR
CHEN Jingru1, XIA Haijian2, ZHANG Zebin2, QU Lujiang2, LIU Yi1, LI Xingmin1,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China;2. College of Animal Science & Technology, China Agricultural University, Beijing 100094, China)
Beijing-you chicken is one of the precious local breeds in China. In the natural population, there are some multitoed individuals because of the mutation of C-G base pair to an A-U pair at the 246 bp site in the LMBR1 gene. In this study,the genotype of multi-toed Beijing-you chicken was found to be different from that of Huadu Arbor Acres (AA) broiler, and the mutated base pair (A-U or C-G) was determined by PCR sequencing and restriction fragment polymorphism (RFLP) so that the breeds could be accurately discriminated from each other.
Beijing-you chicken; Huadu Arbor Acres broiler; polydactly; PCR sequencing; restriction fragment polymorphism
DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724037
TS253.1
A
1002-6630(2017)24-0229-06
陳靜茹, 夏海劍, 張澤賓, 等. PCR技術(shù)鑒別多趾北京油雞肉[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(24): 229-234.
10.7506/spkx1002-6630-201724037. http://www.spkx.net.cn
CHEN Jingru, XIA Haijian, ZHANG Zebin, et al. Identification of multi-toed Beijing-you chicken by PCR[J]. Food Science,2017, 38(24)∶ 229-234. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724037. http∶//www.spkx.net.cn
2017-02-27
北京市家禽產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目(BAIC04-2017)
陳靜茹(1994—),女,碩士研究生,研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。E-mail:chenjingru@cau.edu.cn
*通信作者:李興民(1964—),男,副教授,本科,研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。E-mail:lixingmin@cau.edu.cn