張 靜,程 琳,林 琳,陸劍鋒,潘道東,陳 偉,*
基于谷胱甘肽識別系統(tǒng)的膠體金比色法快速檢測水中重金屬鉛離子
張 靜1,程 琳1,林 琳1,陸劍鋒1,潘道東2,陳 偉1,*
(1.合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,安徽 合肥 230041;2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江 寧波 315211)
基于谷胱甘肽的膠體金比色法建立簡單快速檢測水中重金屬鉛離子的方法。利用谷胱甘肽能夠抑制高濃度的鹽溶液聚集,同時在加入Pb2+的情況下,又能夠使膠體金發(fā)生聚集,從而使膠體金的顏色發(fā)生變化。在優(yōu)化條件下,比色法檢測鉛離子的線性范圍為10.36~1 036 ng/mL,檢出限為2.072 ng/mL,加標(biāo)回收率為99.1%~103.6%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4%。該方法檢測靈敏度高,穩(wěn)定性和重復(fù)性較好,可作為測定水中重金屬鉛離子含量的快速檢測方法。
谷胱甘肽;金納米粒子;比色檢測;鉛離子
鉛具有高代謝穩(wěn)定性,是自然界中已知的分布最廣、毒性最大的重金屬污染物之一。鉛通過飲食或呼吸等方式進入人體后,會對神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓造血機能、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)以及腎臟等造成傷害[1-4]。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展,大量含有的重金屬污染物的工業(yè)廢水和生活污水排入自然水域中,致使自然水域中重金屬含量升高,也造成農(nóng)(水)產(chǎn)品中重金屬的富集,會直接或間接危害人體健康。
近年來,由于自然水域的污染日益加劇,因此世界各國的學(xué)者專家研究了其中的各種重金屬,開展了大量的檢測和治理方法研究。目前獲得廣泛認(rèn)可的方法主要有原子吸收光譜法[5-6]、電感耦合等離子質(zhì)譜法[7-8]、原子熒光光譜法[9-10]等。其中電感耦合等離子質(zhì)譜法、原子吸收光譜法檢出限較優(yōu),部分檢出元素為ng/L級,但是儀器本身價格昂貴,對環(huán)境條件要求高、操作復(fù)雜、成本高,因此現(xiàn)在多被用作標(biāo)準(zhǔn)測量。原子熒光光譜法多用于環(huán)境及食品中汞、砷等元素的分析和測定,但操作繁瑣、費用較高。目前也有很多電化學(xué)[11-12]和比色法[13-14]檢測重金屬離子鉛,雖然操作已經(jīng)簡單很多,但是都要用到脫氧核酶[15-17],因此重復(fù)性和穩(wěn)定性較差,反應(yīng)條件也比較難控制。上述方法還存在一個共同嚴(yán)重的問題:由于需要大型儀器的操作,只能在實驗室內(nèi)進行,不能用于現(xiàn)場測試,因此不能滿足應(yīng)急監(jiān)測的要求。
基于谷胱甘肽[18-20]的膠體金比色法[21-25]已經(jīng)被用于檢測多種物質(zhì)(如鎘離子、汞離子、雌二醇等),該方法不但靈敏度高,而且所需樣品(特別是水樣)前處理步驟也較簡易,因而得到廣泛研究。谷胱甘肽能夠抑制高濃度鹽溶液下的膠體金溶液的聚集[26],當(dāng)加入重金屬離子鉛時,鉛離子能夠和谷胱甘肽進行螯合[27],因而使金納米粒子(gold nanoparticles,AuNPs)表面的谷胱甘肽減少,進而降低AuNPs的穩(wěn)定性,使AuNPs在高濃度鹽溶液下發(fā)生聚集,從而可以建立一種基于谷胱甘肽的膠體金比色法檢測重金屬Pb2+的方法。本實驗無需化學(xué)改性和復(fù)雜的操作,就能實現(xiàn)高的選擇性和好的靈敏度。因而此項檢測技術(shù)的建立,為水中重金屬鉛的檢測提供更加快速、靈敏的方法。
1.1 材料與試劑
氫氧化鈉、氯化鈉、硝酸鉛、氯化鎳六水化合物、氯化鐵六水化合物、氯化鋇、氯化鋅、氯化鋁、檸檬酸三鈉、濃硝酸、濃鹽酸 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;谷胱甘肽 生工生物工程(上海)股份有限公司;氯金酸三水化合物 百靈威科技有限公司;實驗室用水為超純水(>18 MΩ)。
1.2 儀器與設(shè)備
FC型酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher公司;AL104分析天平 美國Mettler Toledo公司;EOS600D單反相機佳能光學(xué)設(shè)備有限公司;加熱磁力攪拌器 德國IKA公司。
1.3 方法
1.3.1 15 nm和30 nm金納米粒子的制備
金納米粒子合成采用文獻(xiàn)[28]報道的方法,取100 mL的錐形瓶先用水洗干凈,用王水浸泡過夜后洗凈烘干備用,然后在錐形瓶中加入50 mL超純水和850 μL氯金酸溶液(5 g/L),在加熱磁力攪拌器上加熱至沸騰。沸騰后打開磁力攪拌器為1 500 r/min,并迅速加入一定量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸鈉溶液(15 nm和30 nm金納米粒子加入的檸檬酸鈉溶液分別是1 000 μL和820 μL),溶液的顏色在2 min內(nèi)會發(fā)生明顯變化,至顏色不變后繼續(xù)加熱煮沸5 min使制得膠體金溶液更穩(wěn)定;冷卻后補水至原體積50 mL,在0~4 ℃條件下保存待用。將制備好的膠體金溶液分裝至1 mL離心管中,在9 700 r/min條件下離心7 min,棄去部分上清液后濃縮至原來體積的1/10(0.1 mL),在0~4 ℃條件下保存待用。
1.3.2 金納米粒子的表征
用紫外-可見分光光度計掃描制備的膠體金在波長400~800 nm的吸光度,根據(jù)最大吸收峰的位置估計膠體金的平均粒徑及均一性,并以此驗證AuNPs是否合成。
1.3.3 氯化鈉溶液濃度的優(yōu)化
在濃縮的膠體金溶液中加入濃度為0、5、10、20、30、40、50 mmol/L的氯化鈉溶液,測定AuNPs的聚集程度,聚集程度用吸光度表示,根據(jù)結(jié)果選出使其聚集的最佳的氯化鈉溶液濃度。
1.3.4 谷胱甘肽濃度的優(yōu)化
在高濃度的氯化鈉溶液中,谷胱甘肽能夠阻止金納米粒子的聚集,保持金納米粒子的穩(wěn)定,所以其濃度是一個必需優(yōu)化的條件。分別取濃縮好的15 nm和30 nm膠體金按體積比1∶1混合,然后取50 μL加入96 孔板中,每8 個孔板為一組,共6 組,再在每組孔板中加入10 μL不同濃度的谷胱甘肽(0、5、10、50、100、150 μmol/L),振蕩混勻,在室溫下放置30 min,然后每組孔板中加入10 μL不同濃度的Pb2+(0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 μmol/L),振蕩混勻,最后在每個孔板中都加入10 μL 30 mmol/L氯化鈉溶液,振蕩混勻,觀察顏色變化。掃描溶液400~800 nm的紫外-可見光譜,并以650 nm和526 nm波長處的吸光度比值(A650nm/A526nm)作為縱坐標(biāo),以Pb2+濃度為橫坐標(biāo)繪出變化曲線,對比不同濃度谷胱甘肽對實驗的影響。
1.3.5 檢測pH值優(yōu)化
本實驗會受到溶液pH值的影響,所以要對溶液pH值進行優(yōu)化。分別取濃縮好的15 nm和30 nm膠體金按體積比1∶1混合,用不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution,PBS)將膠體金的pH值分別調(diào)節(jié)到5、6、7和8,再各取膠體金50 μL加入96 孔板中,每8 個孔板為一組,共4 組,然后在每組孔板中加入10 μL 50 μmol/L的谷胱甘肽溶液,振蕩混勻,在室溫放置30 min,每組孔板中加入10 μL不同濃度的Pb2+(0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 μmol/L),振蕩混勻,最后每個孔板中都加入10 μL 30 mmol/L氯化鈉溶液,振蕩混勻,觀察顏色變化。掃描溶液400~800 nm的紫外-可見光譜,并以A650nm/A526nm作為縱坐標(biāo),以Pb2+濃度為橫坐標(biāo)繪出變化曲線,對比不同pH值對實驗的影響。
1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和樣品檢測
分別取濃縮好的15 nm和30 nm膠體金按體積比1∶1混合,用PBS將膠體金的pH值調(diào)節(jié)到6,各取膠體金50 μL分別加入8 個96 孔板中,然后在每個孔板中加入10 μL 50 μmol/L的谷胱甘肽,振蕩混勻,在室溫放置30 min,孔板中各加入10 μL不同濃度的Pb2+(0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 μmol/L),振蕩混勻,最后每個孔板中都加入10 μL 30 mmol/L氯化鈉溶液,振蕩混勻,觀察顏色變化。掃描溶液波長400~800 nm波長處的紫外-可見光譜,并以A650nm/A526nm作為縱坐標(biāo),以Pb2+濃度為橫坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.7 特異性實驗
通過比色法檢測重金屬Pb2+時,其他重金屬也可能會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響,所以本實驗也驗證了比色法檢測重金屬Pb2+的特異性。分別取濃縮好的15 nm和30 nm膠體金按體積比1∶1混合,用PBS將膠體金的pH值調(diào)節(jié)到6,再各取膠體金50 μL加入8 個96 孔板中,然后在每個孔板中加入10 μL 50 μmol/L的谷胱甘肽,振蕩混勻,在室溫下放置30 min,孔板中各加入10 μL不同的重金屬離子溶液(Pb2+濃度為0.1 μmol/L;Fe3+、Ni2+、Zn2+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Hg2+濃度均為1 μmol/L),振蕩混勻,最后在每個孔板中加入10 μL 30 mmol/L氯化鈉溶液,振蕩混勻,觀察顏色的變化。掃描溶液400~800 nm波長范圍的紫外-可見光譜,并以A650nm/A526nm作為縱坐標(biāo),以不同重金屬離子為橫坐標(biāo)繪出柱狀圖,對比不同金屬離子對實驗的影響。
1.3.8 加標(biāo)回收率及精密度實驗
選用自來水為研究對象,對樣品1、2、3分別添加適量的0.05、0.10、0.5 μg/mL鉛離子標(biāo)準(zhǔn)溶液,依照1.3.6節(jié)進行檢測,計算加標(biāo)回收率,分別對樣品2、3平行測定5 次,計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。
2.1 金納米粒子表征結(jié)果
圖1表示15 nm和30 nm不同粒徑膠體金的顏色及波長400~800 nm的紫外-可見光譜圖。用檸檬酸鈉還原法制備的膠體金由于表面等離子共振而呈現(xiàn)透亮的紅色,從圖1插圖可以看出,膠體金的粒徑越大,使其表面等離子共振發(fā)生變化,使得膠體金的顏色有橙紅變?yōu)榫萍t,并且導(dǎo)致紫外-可見光譜圖中特征吸收峰向右移動,AuNPs的這種特征符合文獻(xiàn)[29]的報道。從圖1可以看出膠體金在520 nm左右波長處有明顯的吸收峰,為膠體金的特征吸收峰,說明AuNPs基本合成成功。
圖1 AuNPs的紫外-可見吸收光譜Fig. 1 UV-visible absorption spectrum of synthesized gold nanoparticles
2.2 檢測條件優(yōu)化結(jié)果
2.2.1 氯化鈉溶液濃度優(yōu)化結(jié)果
要獲得最佳的優(yōu)化條件,首先進行氯化鈉溶液濃度的優(yōu)化。當(dāng)氯化鈉溶液加入到膠體金溶液中,從圖2可以看出,隨著氯化鈉濃度的增加,在650 nm波長處的吸光度逐漸增大,這個新峰的出現(xiàn)就是由于膠體金發(fā)生聚集而產(chǎn)生的等離子共振變化而引起的[30],且AuNPs的特征峰向右偏移,因而選擇A650nm/A526nm衡量AuNPs的聚集程度。低的A650nm/A526nm表明AuNPs在溶液中是分散的,高的A650nm/A526nm表明AuNPs已聚集。從圖3可以看出,當(dāng)氯化鈉濃度為30 mmol/L時,A650nm/A526nm已達(dá)到較大的值,氯化鈉濃度再增加時,其趨于平穩(wěn),因此選擇氯化鈉濃度為30 mmol/L,表明此時AuNPs已完全聚集。
圖2 在不同NaCl濃度條件下AuNPs紫外-可見吸收光譜Fig. 2 UV-visible absorption spectra of synthesized AuNPs in the presence of different concentrations of NaCl
圖3 對于不同NaCl濃度條件下AuNPs的A650nm/A526nm值Fig. 3 Plot of A650nm/A526nm ratio of AuNPs versus NaCl concentration
2.2.2 谷胱甘肽濃度優(yōu)化結(jié)果
圖4 在不同Pb2+濃度條件下對應(yīng)的不同谷胱甘肽濃度的AuNPs的照片F(xiàn)ig. 4 Photographs of AuNPs in the presence of different concentrations of Pb2+ and GSH
由圖4可見,在谷胱甘肽存在的條件下,當(dāng)其濃度為10 μmol/L和50 μmol/L時,空白時AuNPs沒有發(fā)生聚集,說明谷胱甘肽能夠在高濃度鹽溶液中抑制AuNPs的聚集。另外隨著Pb2+濃度的增加,AuNPs的顏色逐漸發(fā)生了變化,并且在谷胱甘肽濃度為50 μmol/L的條件下,0.05 μmol/L的Pb2+即可被檢測出來,而其他濃度的谷胱甘肽都沒有達(dá)到如此高的靈敏度,因此選擇50 μmol/L的谷胱甘肽作為下一步實驗。圖5是掃描圖4中各孔400~800 nm的紫外-可見光譜圖,以A650nm/A526nm作為縱坐標(biāo),以Pb2+濃度為橫坐標(biāo)做出的相關(guān)折線圖。從圖5可以看出,谷胱甘肽濃度為50 μmol/L時檢測靈敏度最高,折線圖變化范圍最大。
圖5 在不同Pb2+濃度條件下對應(yīng)的不同谷胱甘肽濃度的AuNPs的A650 nm/A526 nm值Fig. 5 Olot of A650nm/A526nm ratio of AuNPs in the presence of different concentrations of Pb2+ and GSH
2.2.3 檢測pH值優(yōu)化結(jié)果
AuNPs測定的靈敏度和穩(wěn)定性與反應(yīng)溶液的pH值有關(guān),因此,為了最大程度地保持AuNPs反應(yīng)速度和活性,必須確定測定的最佳pH值。從圖6可以看出,在不同pH值的條件下,隨著Pb2+濃度的增加,膠體金的顏色會發(fā)生變化。而且在pH 6時,可以檢測出0.1 μmol/L的Pb2+,檢測靈敏度比其他幾組都要高,檢測范圍也高于其他組。因此,選擇溶液pH 6作為接下來的試驗條件。圖7是掃描圖6中各孔400~800 nm的紫外-可見光譜圖后,以A650nm/A526nm作為縱坐標(biāo),以Pb2+濃度為橫坐標(biāo)做出的相關(guān)折線圖。從圖7可以看出,溶液pH 6時檢測靈敏度最高。
圖6 在不同Pb2+濃度條件下對應(yīng)的不同pH值的AuNPs的照片F(xiàn)ig. 6 Photographs of AuNPs in the presence of different concentrations of Pb2+ at different pH values
圖7 在不同Pb2+濃度條件下對應(yīng)的不同pH值的AuNPs的A650nm/A526nm值Fig. 7 Plot of A650nm/A526nm ratio of AuNPs in the presence of different concentrations of Pb2+ at different pH values
2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立和樣品檢測結(jié)果
圖8 在不同Pb2+濃度條件下AuNPs的照片F(xiàn)ig. 8 Photographs of AuNPs in the presence of different concentrations of Pb2+
圖9 在不同Pb2+濃度條件下AuNPs紫外-可見吸收光譜Fig. 9 UV-visible absorption spectra of AuNPs in the presence of different concentrations of Pb2+
從圖8可以看出,膠體金的顏色隨著Pb2+的增加,顏色從紅色逐漸變?yōu)樗{(lán)色,甚至在0.1 μmol/L(2.072 ng/mL)的Pb2+存在時從紅色變成暗紫色。因此,0.1 μmol/L(2.072 ng/mL)即為可視檢測下限。應(yīng)用紫外-可見光譜對檢測結(jié)果進行半定量分析,結(jié)果見圖9,隨著Pb2+濃度的增加,膠體金的特征峰強度會逐漸減低,同時在650 nm左右位置出現(xiàn)的峰并越來越高。因此,用這兩個峰的吸光度比值(A650nm/A526nm)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來檢測重金屬Pb2+,并且隨著Pb2+質(zhì)量濃度從10.36~1 036 ng/mL變化而呈線性的關(guān)系(R2=0.997 4),其線性回歸方程為y=0.291 52x+1.017 83,如圖10所示。
圖10 Pb2+濃度與吸光度的線性相關(guān)性Fig. 10 Linear relationship between lead ion concentration and absorbance
2.4 特異性實驗的結(jié)果
圖11 特異性實驗AuNPs照片F(xiàn)ig. 11 Photographs of AuNPs showing the specificity of the method
圖12 特異性實驗AuNPs紫外-可見吸收光譜Fig. 12 UV-visible absorption spectra showing the specificity of the method
從圖11可以看出,1 μmol/L的其他金屬離子都不會使膠體金顏色發(fā)生變化,而0.1 μmol/L的Pb2+即可使膠體金由紅色變?yōu)榘底仙?。從圖12可以看出,其他離子的紫外-可見光譜幾乎不變,而Pb2+的紫外-可見光譜圖發(fā)生明顯變化,可見只有Pb2+存在的情況下才會使得膠體金變色。圖13是由圖12紫外-可見光譜中A650nm/A526nm作為縱坐標(biāo),其他離子和Pb2+作為橫坐標(biāo)所做柱狀圖,可以看出只有Pb2+產(chǎn)生的信號特別大而其他離子的信號特別小,同樣可以看出本實驗具有較好的特異性。
2.5 加標(biāo)回收率及精密度實驗結(jié)果
表1 加標(biāo)回收率Table 1 Recoveries of lead ion from spiked samples
計算樣品1、2、3的加標(biāo)回收率結(jié)果如表1所示,回收率在99.1%~103.6%之間,分別對樣品1、2、3平行測定5 次,計算方法的精密度。由表2可知,測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%,分析方法準(zhǔn)確可靠,精密度良好。
表2 精密度實驗結(jié)果(n=5)Table 2 Precision of the method (n= 5)
實驗建立了一種基于谷胱甘肽的膠體金比色法檢測重金屬離子鉛,在實驗優(yōu)化出谷胱甘肽濃度為50 μmol/L,溶液pH 6的最佳條件下,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.291 52x+1.017 83,在10.36~1 036 ng/mL范圍內(nèi)線性良好,檢出限可達(dá)2.072 ng/mL,重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率較好,可以初步實現(xiàn)對水中重金屬離子鉛的檢測。該方法應(yīng)用在實際樣品(自來水)的檢測中,也可以得到預(yù)期的效果。此外,該方法操作簡單,價格便宜,無需大型儀器,非常適宜作為簡單快速的一步、現(xiàn)場檢測重金屬離子Pb2+。
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Gold Nanoparticles-Based Glutathione Recognition for Rapid Colorimetric Detection of Lead Ion in Water
ZHANG Jing1, CHENG Lin1, LIN Lin1, LU Jianfeng1, PAN Daodong2, CHEN Wei1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230041, China;2. School of Marin Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)
Herein a novel colorimetric method based upon gold nanoparticles (AuNPs) was developed for the detection of lead in water. The method was based on the fact that the presence of glutathione (GSH) can prevent the aggregation of AuNPs at a high concentration of NaCl solution, while addition of Pb2+to the solution will cause the aggregation of AuNPs, leading to changes in the color of AuNPs. Under the optimum conditions, the absorbance was found to be linearly proportional to the concentration of lead ion within the range of 10.36-1 036 ng/mL, with a limit of detection (LOD) of 2.072 ng/mL. The recoveries of Pb2+from spiked samples were 99.1%-103.6%, and the precision expressed as relative standard deviation was less than 4%. Moreover, this assay showed good sensitivity, stability and reproducibility and thus could be used for rapid detection of lead ion in water.
glutathione; gold nanoparticles; colorimetric detection; lead ion
DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724032
O661.1
A
1002-6630(2017)24-0202-06
張靜, 程琳, 林琳, 等. 基于谷胱甘肽識別系統(tǒng)的膠體金比色法快速檢測水中重金屬鉛離子[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(24):202-207.
10.7506/spkx1002-6630-201724032. http://www.spkx.net.cn
ZHANG Jing, CHENG Lin, LIN Lin, et al. Gold nanoparticles-based glutathione recognition for rapid colorimetric detection of lead ion in water[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 202-207. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724032. http∶//www.spkx.net.cn
2016-11-30
“十二五”國家科技支撐計劃項目(2015BAD17B02-3);安徽省水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(皖農(nóng)科【2016】84號);
國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-48)
張靜(1991—),女,碩士,主要從事水產(chǎn)品質(zhì)量與安全監(jiān)測研究。E-mail:1031832600@qq.com
*通信作者:陳偉(1982—),男,教授,博士,主要從事食品安全快速檢測新方法研究。E-mail:chenweishnu@163.com