姚軼俊，王立峰，鞠興榮

纖維素載體固定化β-葡萄糖苷酶及其在大豆異黃酮水解中的應(yīng)用

姚軼俊1,2，王立峰1，鞠興榮1,2

（1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

建立纖維素載體固定化β-葡萄糖苷酶系統(tǒng)，用于黑豆?jié){中大豆異黃酮去糖基化反應(yīng)，并對(duì)該催化系統(tǒng)進(jìn)行了可行性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，在40 cm3纖維素顆粒上可結(jié)合超過(guò)40 mg β-葡萄糖苷酶，并且能有效將4-硝基苯-β-D-葡糖苷酸水解成對(duì)硝基苯酚，其反應(yīng)最適溫度為50 ℃。經(jīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)試后可得其米氏常數(shù)Km值為（1.38±0.20）mmol/L。將該固定化酶系統(tǒng)用于黑豆?jié){中大豆異黃酮去糖基化，通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)其轉(zhuǎn)化效率，表明該系統(tǒng)可以在30 min內(nèi)利用40 cm3含酶載體將50 mL黑豆?jié){中的異黃酮全部轉(zhuǎn)化為去糖基化形式。該固定化酶催化系統(tǒng)連續(xù)化催化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，在經(jīng)過(guò)15 次反應(yīng)以及15 d之后，該固定化酶系統(tǒng)仍然可維持其60%的催化活性。

β-葡萄糖苷酶；固定化；纖維素顆粒；黑豆?jié){；異黃酮去糖基化

大豆異黃酮是存在于大豆中的天然非固醇類物質(zhì)，在干燥大豆中的含量約為1～5 mg/g[1]。由于其被攝入體內(nèi)后能與雌激素受體結(jié)合，調(diào)節(jié)人體內(nèi)的激素表現(xiàn)，因此又被稱為植物雌激素。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，攝入足量的大豆異黃酮可以有效降低罹患骨質(zhì)疏松癥及婦女更年期綜合癥的風(fēng)險(xiǎn)[2]，在抗癌防癌[3]、預(yù)防心血管疾病[4]等方面也有重要的作用。另有文獻(xiàn)指出，在人體內(nèi)帶有糖基形式的異黃酮不能直接被吸收，而是經(jīng)腸道微生物產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶水解去糖基后進(jìn)入血液，才能發(fā)揮各種生理作用[5-6]。但是人體腸道中的菌群由于個(gè)體因素會(huì)有較大差異，所以如果直接攝入不帶糖基的苷元型異黃酮，則可以有效提高其利用效率[7]。

目前糖基水解方式主要有酸水解和酶水解2 種。由于酸水解存在不安全因素，在一定程度上也會(huì)破壞異黃酮的結(jié)構(gòu)，而酶作用條件溫和，所以后者越來(lái)越受到關(guān)注[8]。微生物生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶是目前主要應(yīng)用于大豆異黃酮去糖基的酶。然而由于酶相對(duì)成本較高，反應(yīng)過(guò)程中易失活，而且不能被回收利用，因此應(yīng)用上存在局限性。所以，如果將酶固定到化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的不溶性載體上，則可以有效解決上述問(wèn)題[9]。

本實(shí)驗(yàn)探究了一種用纖維素顆粒作為載體固定β-葡萄糖苷酶的方法，用于黑豆?jié){中大豆異黃酮去糖基作用，以期建立可用于穩(wěn)定、高效生產(chǎn)具有高生理活性黑豆?jié){的反應(yīng)系統(tǒng)。其固定方法包括纖維素載體的合成與修飾，纖維素載體與酶的共價(jià)結(jié)合；利用固定化酶技術(shù)在黑豆?jié){的加工過(guò)程中實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)利用以及方便產(chǎn)物的分離，在生產(chǎn)應(yīng)用中具有較高的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)；同時(shí)，由于纖維素是大多數(shù)農(nóng)業(yè)廢棄物的主要成分，因此該研究也為今后開(kāi)發(fā)直接以農(nóng)業(yè)廢棄物為載體的固定化酶系統(tǒng)提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所使用市售黑豆購(gòu)自南京雨花路農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)，并貯存在干燥環(huán)境下；纖維素載體為本實(shí)驗(yàn)室合成，將醋酸纖維素粉末溶于丙酮和二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）以體積比3∶2所組成的有機(jī)溶劑中，并逐滴滴入冷水中形成纖維素小球[10]。

β-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-β-D-葡糖苷酸（p-nitrophenyl-β-D-glucuronide，p-NPG）、乙腈（色譜級(jí)）、大豆苷元、大豆苷、染料木素、染料木苷標(biāo)準(zhǔn)品美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本Jasco公司；Free Dry System/Freezone?4.5冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司；Model JSM-6300掃描式電子顯微鏡 日本JEOL公司；酶聯(lián)免疫測(cè)試儀 美國(guó)Molecular Devices公司；CP213型電子天平 美國(guó)Ohaus公司；KW-1000DC型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 纖維素載體的合成與修飾

取6.25 g市售纖維素粉末溶于50 mL丙酮與DMSO組成的有機(jī)溶劑中，將所得溶液用針筒逐滴滴入冷水中，形成纖維素顆粒并將其置于室溫下干燥待用。量取體積大約為40 cm3所述纖維素顆粒置于100 mL濃度為0.2 mol/L的NaOH溶液中，40 ℃保溫90 min，以增加其表面的羥基數(shù)目[11-12]。

1.3.2 纖維素載體與酶的共價(jià)結(jié)合

將經(jīng)上述步驟加熱處理過(guò)的40 cm3纖維素載體置于50 mL 100 ℃體積分?jǐn)?shù)為3%的戊二醛溶液中1 h后，在室溫下用蒸餾水沖洗。將β-葡萄糖苷酶溶于濃度為0.1 mol/L、pH 6的磷酸緩沖液中形成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的酶溶液50 mL，并與經(jīng)上述步驟處理過(guò)的纖維素載體在4 ℃條件下混合靜置16 h。最后，用紗布將酶溶液濾去并保留濾液待測(cè)，用0.1 mol/L、pH 6的磷酸緩沖液沖洗纖維素載體，得到所述固定化酶，4 ℃貯存。

1.3.3 固定化酶含量測(cè)定

將1 mg/mL的β-葡萄糖苷酶溶液稀釋，分別加入10 μL與200 μL 10%的染色劑考馬斯亮藍(lán)，30 min后測(cè)定其在595 nm波長(zhǎng)處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在制備固定化酶所得的濾液中加入10 μL 10%的染色劑考馬斯亮藍(lán)，30 min后測(cè)定其在595 nm波長(zhǎng)處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出濾液中殘留的蛋白含量，從而得到固定于載體上的酶含量[13]。

1.3.4 載體表面共價(jià)鍵及形態(tài)學(xué)描述

用于化學(xué)分析的電子能譜（electron spectroscopy for chemical analysis，ESCA）屬于表面分析法，可偵測(cè)固體樣品表面所含的元素種類、化學(xué)組成以及有關(guān)的電子結(jié)構(gòu)等重要信息，在各種固體材料的基礎(chǔ)研究中具有重要應(yīng)用價(jià)值[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，ESCA被用于檢測(cè)并驗(yàn)證酶蛋白分子以共價(jià)鍵成功固定化于纖維素載體上。

利用掃描式電子顯微鏡能夠快速、有效地獲得固體樣品表面的微小區(qū)域形貌和成分信息。其應(yīng)用于固定化酶的分析檢測(cè)中可以用以觀察晶體形態(tài)，酶表面結(jié)構(gòu)，以及載體上活性成分的分散狀態(tài)以便鑒定酶的固定化情況[15]。在本實(shí)驗(yàn)中，將固定化前后的載體樣品冷凍干燥并在真空條件下鍍金60 s兩次后用掃描式電子顯微鏡在10 kV的電子強(qiáng)度下觀察其表面結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.5 固定化酶最適作用溫度及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)測(cè)定

在pH值為6的磷酸緩沖液中加入5 mg p-NPG，依次以所述固定化酶在30、40、50、60 ℃和70 ℃，100 r/min反應(yīng)1 h。取反應(yīng)后的底物900 μL加入到1 mL濃度為1 mol/L Na2CO3溶液中，在425 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值。

配制濃度為0.1～20 mmol/L的p-NPG溶液作為底物，分別用固定化酶在其最適反應(yīng)溫度下作用5 min后，取900 μL加入到1 mL濃度為1 mol/L的Na2CO3溶液中，在425 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其OD值并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出產(chǎn)物濃度，酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值計(jì)算見(jiàn)公式（1）：

式中：Km為米氏常數(shù)/（mmol/L）；v為反應(yīng)初速率/（mmol/（L·min））；vmax為最大反應(yīng)速率/（mmol/（L·min））；[S]為底物濃度/（mmol/L）。

1.3.6 HPLC分析

1.3.6.1 樣品制備

將100 g黑豆浸泡于1 L 4 ℃水中過(guò)夜。將浸泡過(guò)的黑豆及水一起磨成豆?jié){，并用雙層豆?jié){布過(guò)濾，濾去豆渣。將磨好的豆?jié){在殺菌釜中121 ℃滅菌20 min后于4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

將50 mL黑豆?jié){與50 cm3纖維素固定化酶混合，50 ℃反應(yīng)2 h。取反應(yīng)后的黑豆?jié){0.5 mL，與0.5 mL溶有0.2%苯甲酸（內(nèi)標(biāo)）的甲醇溶液混合，離心3 min取上清液0.5 mL，與體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇溶液混合，用0.45 nm濾膜過(guò)濾后離心3 min，用于HPLC分析其中異黃酮組成及含量。

1.3.6.2 色譜條件

HPLC是在氣相層級(jí)色譜和傳統(tǒng)液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的分析分離技術(shù)，是利用物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間具有不同的平衡分配系數(shù)來(lái)進(jìn)行分離的方法。當(dāng)兩相做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，被測(cè)樣品在兩相之間進(jìn)行反復(fù)多次的物質(zhì)交換，這樣使原來(lái)微小的性質(zhì)差異產(chǎn)生了很大的效果，進(jìn)而達(dá)到分析、分離及測(cè)定一些物理化學(xué)常數(shù)的目的[16]。

依據(jù)Wang Huiju等[17]的方法加以修飾。使用YMCPack ODS-AMC C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），在室溫下以梯度流洗的方式進(jìn)行分析，梯度條件如下：A為體積分?jǐn)?shù)0.1%冰醋酸溶液，pH 3.4，B為含體積分?jǐn)?shù)0.1%冰醋酸-乙腈。進(jìn)樣量20 μL，洗脫程序：0～20 min，15%～30% B；20～30 min，30%～45% B；30～35 min，45%～60% B；35～45 min，60%～70% B。平衡時(shí)間10 min，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

1.4 數(shù)據(jù)計(jì)算

大豆異黃酮含量、去糖基化效率、總異黃酮中苷元比例的計(jì)算見(jiàn)公式（2）～（4）：

式中：As為異黃酮組分所對(duì)應(yīng)HPLC圖譜的積分面積；AIS為苯甲酸的HPLC圖譜積分面積；CIS為內(nèi)標(biāo)濃度/（mmol/L）；RRF為相對(duì)反應(yīng)因子（大豆苷4.23，染料木苷7.50，大豆苷元9.91，染料木素9.09）；mw為大豆異黃酮相對(duì)分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化酶含量

據(jù)文獻(xiàn)[18-20]，在固體顆粒表面固定化β-葡萄糖苷酶時(shí)，載體體積為40 cm3其固定化效果最佳。因此在本實(shí)驗(yàn)中纖維素載體量采用40 cm3。在pH 6、4 ℃條件下，每40 cm3的固體載體上可固定（40.27±1.42）mg酶，其蛋白結(jié)合率可達(dá)到（80.53±2.85）%。

2.2 β-葡萄糖苷酶與纖維素載體的電子能圖譜

ESCA技術(shù)又稱為X射線光電子能譜，當(dāng)X射線與樣品相互作用后，激發(fā)出某個(gè)能量上的電子，測(cè)量這一電子的動(dòng)能，可以得到樣品中有關(guān)的電子結(jié)構(gòu)信息[21]。在本實(shí)驗(yàn)中，利用該方法可以驗(yàn)證固定化β-葡萄糖苷酶前后，纖維素載體表面的鍵結(jié)變化情況。由圖1可知，纖維素經(jīng)NaOH修飾處理后表面羥基數(shù)目增加，并與戊二醛發(fā)生縮醛反應(yīng)。

圖1 以碳、氮元素為基準(zhǔn)的纖維素載體固定化酶前后表面鍵結(jié)ESCA結(jié)果Fig. 1 C1s and N1s ESCA spectra of free and immobilized β-glucosidase

圖1 A2與圖1A1相比，可以發(fā)現(xiàn)285.8 eV處新增加了表示—C＝N—鍵結(jié)的尖峰，在287.35 eV處的峰值降低；圖1B2與圖1B1相比可發(fā)現(xiàn)在399.8 eV處新增了表示—C＝N—官能基的尖峰。綜上可得，酶蛋白分子的游離氨基端通過(guò)戊二醛的作用連接到了纖維素載體表面的游離羥基上，并與纖維素分子形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)。

2.3 固定β-葡萄糖苷酶前后纖維素載體的表面微觀結(jié)構(gòu)

圖2 纖維素載體固定化酶前后表面微觀結(jié)構(gòu)Fig. 2 Microstructure of cellulose particles without and with β-glucosidase immobilization

由圖2A可知，該纖維素載體直徑約為1.5 mm，在高倍率檢測(cè)下其表面均勻光滑。由圖2B可知，在相同條件下測(cè)得固定化β-葡萄糖苷酶后的纖維素載體，可以發(fā)現(xiàn)其表面布滿了蛋白顆粒，將其放大至3 000 倍，可清晰觀察到其蛋白質(zhì)分子的顆粒。

2.4 不同溫度下固定化酶與游離酶的相對(duì)活性對(duì)比

不同溫度會(huì)影響酶的活性，且與其固定化的材料、方法密切相關(guān)。固定化酶與其游離酶相比，在不同溫度下的相對(duì)酶活性會(huì)發(fā)生改變[22]?？赡艿脑蚴禽d體改變了反應(yīng)過(guò)程中的傳質(zhì)速率，以及在高溫下載體上會(huì)有用于修飾的化學(xué)物質(zhì)釋出，影響酶活性。用p-NPG作為反應(yīng)底物，通過(guò)測(cè)定相同反應(yīng)時(shí)間后的產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚的量以表示該條件下的相對(duì)酶活性。首先將不同濃度（1 mmol/L對(duì)硝基苯酚稀釋5 次）的對(duì)硝基苯酚置于適量1 mol/L NaCO3溶液中，測(cè)定425 nm波長(zhǎng)處的吸光度，并據(jù)此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其R2為0.997 5，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=2.911 5x＋0.083 2。由于1 mol p-NPG被水解后產(chǎn)生1 mol對(duì)硝基苯酚，因此溶液中p-NPG被完全催化產(chǎn)生0.33 mol對(duì)硝基苯酚，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到對(duì)應(yīng)吸光度為1.04。將反應(yīng)測(cè)得吸光度與該值相比可得到相對(duì)酶活性。

圖3 不同溫度條件下固定化酶與游離酶的相對(duì)活性Fig. 3 Relative activity of free and immobilized β-glucosidase at different temperatures

由圖3可知，纖維素固定化酶的最適作用溫度是50 ℃，與游離酶相比降低了10 ℃，并且在最適溫度處的酶活性顯著大于游離酶活性，從而有利于降低反應(yīng)成本。

2.5 固定化酶系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)分析

利用不同濃度的底物在相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)生成產(chǎn)物的量，對(duì)纖維素固定化酶系統(tǒng)進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)測(cè)試。當(dāng)系統(tǒng)的最大反應(yīng)速率越大，酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值越小，表明此系統(tǒng)催化反應(yīng)時(shí)最大反應(yīng)速率越大，同時(shí)達(dá)到最大反應(yīng)速率所需底物濃度越小，該系統(tǒng)越有優(yōu)勢(shì)[23]。根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)方程（R2=0.98）可得纖維素固定化酶的最大反應(yīng)速率為（0.073 3±0.003 4）mmol/（L·min），表示當(dāng)其反應(yīng)速率達(dá)到（0.073 3±0.003 4）mmol/（L·min）時(shí)，增加底物濃度其反應(yīng)速率不會(huì)增加。酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值為（1.382 6±0.204 3）mmol/L，表示該系統(tǒng)達(dá)到最大反應(yīng)速率一半時(shí)所需要的底物濃度為（1.382 6±0.204 3）mmol/L。

2.6 纖維素固定化酶系統(tǒng)對(duì)黑豆?jié){中大豆異黃酮的水解效率

纖維素固定化酶系統(tǒng)在與黑豆?jié){反應(yīng)0～45 min時(shí)豆?jié){中4 種異黃酮的含量以及去糖基化效率見(jiàn)表1。該系統(tǒng)完全水解轉(zhuǎn)化50 mL黑豆?jié){中的大豆苷和染料木苷分別需要20 min和30 min。此結(jié)果與文獻(xiàn)中利用咖啡渣[18]以及納米玻璃粉末[19]作為載體的固定化酶系統(tǒng)相比大致相同。反應(yīng)結(jié)束后豆?jié){中苷元形式的異黃酮占原來(lái)豆?jié){中總異黃酮含量的70.6%，相同時(shí)間內(nèi)染料木苷的轉(zhuǎn)化率高于大豆苷。

表1 纖維素固定化酶系統(tǒng)催化反應(yīng)不同時(shí)間后黑豆?jié){中異黃酮含量以及轉(zhuǎn)化率Table 1 Isoflavone contents of black soymilk treated for different time by immobilized β-glucosidase

圖4 固定化酶系統(tǒng)催化條件下黑豆?jié){中大豆苷與大豆苷元的轉(zhuǎn)化Fig. 4 Conversion of daidzin to daidzein in black soymilk by the immobilized enzyme

圖5 固定化酶系統(tǒng)催化條件下黑豆?jié){中染料木苷與染料木素的轉(zhuǎn)化Fig. 5 Conversion of genistin to genistein in black soymilk by the immobilized enzyme

由圖4和圖5可得，大豆苷及染料木苷水解中所有糖苷型異黃酮完全轉(zhuǎn)化為所對(duì)應(yīng)苷元所需時(shí)間分別為20 min和30 mim。50%糖苷型異黃酮轉(zhuǎn)化為所對(duì)應(yīng)苷元所需時(shí)間分別為8 min和9 min。與使用霉菌發(fā)酵最少需要4～8 h相比[24-25]，該固定化酶系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)勢(shì)，能夠在短時(shí)間內(nèi)將黑豆?jié){中的異黃酮轉(zhuǎn)化為具有高價(jià)值的苷元形式。

2.7 纖維素固定化酶系統(tǒng)的穩(wěn)定性

使用該固定化酶系統(tǒng)進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)富含去糖基化形式大豆異黃酮的黑豆?jié){，系統(tǒng)的穩(wěn)定性顯得尤為重要。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)連續(xù)催化20 個(gè)重復(fù)周期以及催化30 d以測(cè)試其反應(yīng)穩(wěn)定性。

圖6 纖維素固定化酶系統(tǒng)水解黑豆?jié){中異黃酮重復(fù)使用穩(wěn)定性Fig. 6 Reusable stability of immobilized β-glucosidase for isoflavone deglycosylation in black soymilk

圖7 纖維素固定化酶系統(tǒng)水解黑豆?jié){中異黃酮貯存穩(wěn)定性Fig. 7 Storage stability of immobilized β-glucosidase for isoflavone deglycosylation in black soymilk

圖6 為連續(xù)20 次反應(yīng)中異黃酮糖苷的轉(zhuǎn)化率。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，在40 cm3固定化酶系統(tǒng)中加入50 mL新鮮黑豆?jié){，在50 ℃條件下催化30 min后以其中苷元態(tài)的異黃酮占總異黃酮比例作為指標(biāo)。之后移除黑豆?jié){用蒸餾水沖洗系統(tǒng)后重新加入新鮮黑豆?jié){再次反應(yīng)，如此重復(fù)10 次。由圖6可知，10 次催化反應(yīng)后其轉(zhuǎn)化率可保持初始效率的70%以上。連續(xù)15 次反應(yīng)后系統(tǒng)催化活性為初始值的50%～60%。因此該系統(tǒng)可被認(rèn)為具有較高的重復(fù)利用穩(wěn)定性。由圖7可知，實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了30 d中該系統(tǒng)對(duì)異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化率的變化，將新制得的固定化酶系統(tǒng)從第1天起每隔2～5 d進(jìn)行催化，其余時(shí)間貯存于4 ℃條件下。15 d之后該系統(tǒng)仍可維持初始轉(zhuǎn)化率的60%，因此在工業(yè)生產(chǎn)中可以維持約兩周的生產(chǎn)，符合生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。

比較以上兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，在進(jìn)行連續(xù)催化過(guò)程中重復(fù)使用對(duì)固定化酶系統(tǒng)活性的影響比較大，在貯存5 d之內(nèi)再次測(cè)試該系統(tǒng)酶活性無(wú)顯著差異。因此，如果將其應(yīng)用在工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中5 d之內(nèi)只需考慮其因重復(fù)使用而降低的活性，因此該系統(tǒng)適合進(jìn)行密集式的生產(chǎn)。之前微生物系統(tǒng)經(jīng)常用于對(duì)豆?jié){中異黃酮進(jìn)行水解去糖基化，利用霉菌所產(chǎn)生的酶對(duì)其進(jìn)行不同條件的發(fā)酵，以達(dá)到目的。但是該方法設(shè)備昂貴（如發(fā)酵槽）、操作復(fù)雜以及需要花費(fèi)大量成本用來(lái)防治雜菌污染[26]。此外，與固定化酶系統(tǒng)相比，微生物系統(tǒng)最大的劣勢(shì)是所需時(shí)間較長(zhǎng)，由于霉菌自身生長(zhǎng)以及將酶分泌到胞外均需要一定時(shí)間，所以在微生物系統(tǒng)時(shí)首先需要對(duì)菌種進(jìn)行活化，在催化異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化過(guò)程中也需要比較長(zhǎng)的時(shí)間[27-28]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，如利用根霉菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，首先需要8 d進(jìn)行菌的活化及菌絲生長(zhǎng)；該系統(tǒng)至少需要8 h可將黑豆?jié){中的異黃酮完全轉(zhuǎn)化為苷元形式[29-30]。

3 結(jié) 論

將β-葡萄糖苷酶固定化到纖維素載體上可建立高效、經(jīng)濟(jì)與穩(wěn)定的催化反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)用于黑豆?jié){中大豆異黃酮去糖基作用，以得到具有高生理活性的黑豆?jié){。該系統(tǒng)最適作用溫度為50 ℃，并可在30 min內(nèi)用40 cm3固定化之后的載體將50 mL黑豆?jié){中的異黃酮全部水解成苷元形式。該系統(tǒng)具有較高反應(yīng)穩(wěn)定性。在重復(fù)使用15 次以及催化15 d之后仍可維持60%的初始酶活性。

在未來(lái)的工作中，需要進(jìn)一步研究突破的有兩點(diǎn)。其一是尋找更為廉價(jià)易得酶固定化載體以降低成本。在這方面，農(nóng)業(yè)廢棄物擁有重要地位。由于農(nóng)業(yè)廢棄物絕大多數(shù)含有大量纖維素成分，因此被開(kāi)發(fā)作為酶固定化載體被認(rèn)為是可行的。目前已經(jīng)利用咖啡渣作為載體的研究，將來(lái)可進(jìn)一步延伸擴(kuò)展至茶葉渣、秸稈等多種材料。其二，目前在成本方面最大的限制是酶本身，商業(yè)化的酶由于其來(lái)源及制備提純工藝往往成本較高，所以在未來(lái)如能利用基因工程等分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行菌種改良，將表達(dá)該酶的基因轉(zhuǎn)入如大腸桿菌等細(xì)菌中，實(shí)現(xiàn)酶的大量表達(dá)，可以從根本上降低生產(chǎn)的成本。

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Immobilization of β-Glucosidase onto Cellulose Particles for Application in Hydrolysis of Soybean Isoflavones

YAO Yijun1,2, WANG Lifeng1, JU Xingrong1,2
(1. Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, College of Food Science and Engineering,Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China;2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

This study was conducted to evaluate the feasibility of conversion of isoflavones in soymilk using celluloseimmobilized β-glucosidase. β-glucosidase was immobilized onto cellulose particles with a loading capacity of over 40 mg of enzyme/40 cm3carrier. The immobilized enzyme exhibited a significant efficiency for the conversion of 4-nitrophenylβ-D-glucuronide (p-NPG) to p-nitrophenol. The optimal temperature for the enzyme was 50 ℃ and the Michaelis constant(Km) value was determined to be (1.38 ± 0.20) mmol/L. All isoflavones in black soymilk were completely converted to deglycosylated derivatives within 30 min using 40 cm3of the immobilized enzyme as analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC). Experimental evaluation of the stability showed that immobilized β-glucosidase retained 60% of its original activity after 15 times repeated use and after 15 days of storage.

β-glucosidase; immobilization; cellulose particles; black soymilk; isoflavone deglycosylation

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724028

Q814.2

A

1002-6630（2017）24-0177-06

姚軼俊, 王立峰, 鞠興榮. 纖維素載體固定化β-葡萄糖苷酶及其在大豆異黃酮水解中的應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(24)∶177-182. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724028. http∶//www.spkx.net.cn

YAO Yijun, WANG Lifeng, JU Xingrong. Immobilization of β-glucosidase onto cellulose particles for application in hydrolysis of soybean isoflavones[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 177-182. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724028. http∶//www.spkx.net.cn

2017-01-22

江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（15KJB550006）；“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)（2016YFD0400201-1）；

江蘇省產(chǎn)學(xué)研前瞻性聯(lián)合研究項(xiàng)目（BY2016009-01）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）

姚軼?。?989—），女，助理研究員，博士研究生，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：yyj@njue.edu.cn