黃 卉,楊麗芝,楊賢慶*,李來好,郝淑賢,魏 涯,王錦旭
南海鳶烏賊墨汁多糖分離純化及組分分析
黃 卉,楊麗芝,楊賢慶*,李來好,郝淑賢,魏 涯,王錦旭
(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室,國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東 廣州 510300)
目的:從南海鳶烏賊墨汁中分離純化多糖,并分析其多糖組分。方法:利用水提醇沉法得粗多糖,通過固相萃取層析法除色素對多糖進(jìn)行純化,純化多糖依次經(jīng)DEAE-52離子交換柱、Sephacryl HR-300凝膠柱分級純化,按峰收集得單一組分,采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP)衍生化方法,通過超高效液相色譜分析多糖組分。結(jié)果:粗多糖經(jīng)DEAE-52離子交換柱、Sephacryl HR-300凝膠柱后收集得到3 個糖組分,分別為SIP1、SIP2、SIP3;通過PMP衍生化方法分析單糖組成,得:SIP1是由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖3 種單糖縮合而成;SIP2和SIP3分別是由D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖及L-(-)-巖藻糖5 種單糖按照不同比例縮合而成。
墨多糖;分離純化;組分分析
生物體內(nèi)的糖類物質(zhì)已被證明具有諸多生物活性,如抗菌[1]、抗氧化[2]、抗腫瘤[3]及提高機體免疫[4]等生物活性,隨著海洋生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展,對糖類物質(zhì)的研究逐漸深入,為探索糖類生物學(xué)功能及其抗性機理,對其結(jié)構(gòu)分析刻不容緩,但是由于糖類物質(zhì)極性強,結(jié)構(gòu)相近,缺乏光學(xué)吸收基團(tuán),所以一直制約整個糖類領(lǐng)域的發(fā)展[5]。為改變糖類物質(zhì)的光學(xué)靈敏度檢測,衍生化為糖類物質(zhì)的分析提供了新技術(shù),衍生化是使糖鏈帶上熒光或紫外基團(tuán),從而使糖類物質(zhì)滿足光學(xué)檢測的靈敏度。
1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP)在弱堿性條件下發(fā)生衍生化反應(yīng),糖鏈還原性末端與1、3取代基發(fā)生反應(yīng),1 個糖分子的還原端可與2 分子PMP形成穩(wěn)定的衍生物,與其他酸性條件的衍生化試劑相比,其條件溫和、紫外吸收強、衍生物較穩(wěn)定且無異構(gòu)體,被廣泛用于糖類物質(zhì)的分析[6]。PMP和其類似物1-(4-異丙基)苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮[7]、1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮[8-9]、1,3-二苯基-5-吡唑啉酮[10]等對分析痕量糖鏈也均有明顯優(yōu)勢。采用PMP衍生化方法對多糖組分分析時,可使糖類物質(zhì)在波長24 nm處產(chǎn)生強烈的紫外吸收,且操作方便,重現(xiàn)性好,廣泛應(yīng)用于糖類組分分析中[11-13]。PMP衍生法可對中性糖如甘露糖、木糖,堿性糖如氨基半乳糖、氨基葡萄糖,酸性糖如葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等11 種單糖同時測定,但除單糖中木糖和阿拉伯糖不能完全分離外,均可實現(xiàn)良好分離[11],從而為物質(zhì)多糖組分分析提供了可能。
1.1 材料與試劑
中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所“南鋒”號調(diào)查船于2014年7月,南海海域捕撈鳶烏賊,取墨囊,凍藏于-20 ℃,備用。
DEAE-52纖維素 上??柹锕荆籗ephacryl HR-300丙烯葡聚糖凝膠、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl,DPPH) 美國Sigma公司;PMP 成都西亞試劑有限公司;D-阿拉伯糖(D-(-)-arabinose,D-Ara)、鼠李糖(L-rhamnose monohydrate,Rha)、肌醇、L-(-)-巖藻糖(L-(-)-fucose,L-(-)-Fuc) 上海源葉生物科技有限公司;D-木糖(D-xylose,D-Xyl)、D-甘露糖(D-Mannose,D-Man)、D-葡萄糖(D-glucose,D-Glc)、D-半乳糖(D-galactose,D-Gal)、乳糖(lactose,Lac) 成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司;木瓜蛋白酶(6 000 U/mg) 上??柹锕荆蝗u甲基氨基甲烷(tri-hydroxymethyl aminomethane,Tris)、無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、氯仿、正丁醇、氯化鈉、無水乙醇、甲醇、三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、乙酸銨、溴化鉀、氫氧化鈉均為國產(chǎn)分析純;乙腈為國產(chǎn)色譜純。
1.2 儀器與設(shè)備
AvantiJ26XP高速離心機 德國Sigma公司;Synergy全功能酶標(biāo)儀 美國BioTek公司;UV2550紫外-可見分光光度計、IRAffinity-1紅外光譜儀 津島企業(yè)管理中國有限公司;EYELAN-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本京理化器械株式會社;AKTApurifierUPC100蛋白純化儀美國GE公司;CBS-B多功能分部收集器 上海青浦滬西公司;ACQUITY超高效液相色譜 美國Waters公司;Alphal-4冷凍干燥器 德國Christ公司;N-EVAP24氮吹儀 美國Organomation Associate Inc公司。1.3 方法
1.3.1 南海鳶烏賊墨汁粗多糖提取工藝流程
取500 g鳶烏賊墨汁,加入1 kg蒸餾水,調(diào)節(jié)pH值為5.5,40 ℃熱水浸提4 h,4 ℃浸提12 h,10 000 r/min離心40 min(重復(fù)2 次),取上清液加2 倍體積Tris-HCl溶液,加1.0%(5 g)木瓜蛋白酶,酶解12 h(pH 6.8,60 ℃水浴振蕩),煮沸10 min,滅酶,10 000 r/min離心20 min除去蛋白,取上清液加入1/4體積的氯仿-正丁醇溶液(4∶1,V/V),攪拌器劇烈攪拌30 min,重復(fù)操作,直至除去雜質(zhì)蛋白,離心,取上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至50 mL加4 倍無水乙醇醇沉過夜。10 000 r/min離心10 min,取沉淀抽濾,無水乙醇、丙酮洗沉淀,得粗多糖,冷凍干燥,備用。
1.3.2 鳶烏賊墨多糖的分離純化
1.3.2.1 固相萃取小柱層析
取鳶烏賊墨粗多糖1 g,加入超純水5 mL,80 ℃水浴加熱溶解25 min,5 000 r/min離心5 min,不溶物重復(fù)上述操作,合并2 次上清液,上已活化的C18固相萃取小柱,以除去部分色素,用超純水洗柱至3 個柱體積,收集濃縮液,備用,利用苯酚-硫酸法測定多糖含量[14],并根據(jù)上柱前后總的糖含量之和,按下式計算損失率:
1.3.2.2 離子交換柱層析
取1 g經(jīng)過固相萃取小柱的粗多糖濃縮液上DEAE-52纖維素離子交換柱(2.6 cm×50 cm),上樣后,依次用0~2 mol/L NaCl溶液分段梯度洗脫,自動部分收集器收集,直至無糖檢出,流速1 mL/min,每管5 mL,苯酚-硫酸法檢測洗脫液中多糖含量,隔管檢測,并繪制洗脫曲線,根據(jù)洗脫曲線按峰收集,濃縮各峰收集液,經(jīng)8 000 D透析袋透析48 h,冷凍干燥[15-22],備用并測量。
1.3.2.3 分子篩層析
分別將經(jīng)離子交換柱的各個峰值多糖溶于超純水,再上樣于Sephacryl HR-300丙烯葡聚糖凝膠分子篩柱(1.6 cm×100 cm),超純水洗脫,自動部分收集器收集,流速1 mL/min,苯酚-硫酸法檢測洗脫液多糖含量,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)洗脫曲線按峰收集洗脫液,濃縮,冷凍干燥得精品墨多糖[23-24]。
1.3.2.4 紅外光譜分析
取約1 mg墨多糖SIP1組分,加入適量干燥KBr粉末,在暖燈加熱條件下,放入瑪瑙研缽中均勻研細(xì),放入壓片機中壓成均勻透明薄片。將此透明薄片放入傅里葉變換紅外光譜儀內(nèi),在400~4 000 cm-1區(qū)間進(jìn)行掃描,采集紅外光譜圖。
1.3.2.5 單糖組分的分析方法-PMP衍生高效液相法[24-27]
混合單糖標(biāo)樣的衍生:將乳糖及7 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成0.5 mg/mL,分別取50 μL加入具塞試管中,然后在具塞試管中加入400 μL PMP(甲醇配制0.5 mol/L)和400 μL NaOH(0.3 mol/L)溶液,70 ℃水浴反應(yīng)100 min,取出10 min冷卻至室溫,加入400 μL HCl(0.3 mol/L)溶液調(diào)節(jié)至中性,加入1 mL氯仿充分振蕩萃取,靜置,吸棄下層,重復(fù)此操作3 次,取上清液水相用0.45 μm微孔膜過濾,稀釋10 倍,上樣分析。
樣品制備:取鳶烏賊墨多糖樣品2 mg于可耐高溫具塞試管中,加入2 mL 2 mol/L TFA,充氮氣封管,110 ℃水解8 h,冷卻至室溫,50 ℃于氮吹儀中揮干TFA,加入1 mL甲醇溶液重復(fù)操作,以NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性,取100 μL進(jìn)行PMP衍生,PMP、NaOH和HCl量均改為100 μL,其他操作相同,以100 μL甲醇代替樣品作PMP衍生空白。
色譜條件:Waters ACQUITY超高效液相色譜;ACQUITY UPLC C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);紫外檢測器波長250 nm;流動相:A相為乙腈,B相為5 mmol/L的甲酸銨溶液,C相為乙腈-水(1∶9,V/V);梯度洗脫程序:0~6 min,23.0% A、77.0% B、0% C;6~9.5 min,50.0% A、50.0% B、0% C;9.5~10 min,23.0% A、77.0% B、0% C;流速0.30 mL/min;柱溫25 ℃。
2.1 固相萃取小柱層析結(jié)果
表1 粗多糖經(jīng)固相萃取小柱后多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)前后對比Table 1 Recovery and loss of polysaccharide during solid phase extraction
由于鳶烏賊墨多糖粗提物中含有較多色素雜質(zhì),如果直接上色譜柱容易堵塞填料,很難繼續(xù)上樣,增加了分離純化的難度,將墨汁粗多糖先經(jīng)固相萃取小柱簡單分離后可以除去大部分色素,利于后續(xù)實驗的順利進(jìn)行,由表1可得,鳶烏賊墨汁粗多糖經(jīng)固相萃取小柱后,多糖損失為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.4%,多糖損失較小,損失率為5.4%。
2.2 離子交換柱層析結(jié)果
圖1 墨汁粗多糖在DEAE-52離子交換柱中的洗脫曲線Fig. 1 Elution curves of crude polysaccharides on DEAE-52 ion exchange column
取1 g經(jīng)過固相萃取小柱的粗多糖濃縮液上DEAE-52纖維素離子交換柱,上樣后,依次用0~2 mol/L NaCl溶液分段梯度洗脫,自動部分收集器收集,如圖1所示。鳶烏賊墨多糖經(jīng)DEAE-52纖維素離子交換柱后出現(xiàn)3 個糖峰,分別在第17、51管及第87管開始出現(xiàn)糖峰,并且可以看出峰1含量較高,峰2次之,峰3含量最少(已通過檢測冷凍干燥產(chǎn)品證實),依次稱之為:SIP1、SIP2、SIP3,分別收集3 個糖峰,冷凍干燥,備用。
2.3 分子篩層析結(jié)果
圖2 SIP1(A)、SIP2(B)和SIP3(C)在Sephacryl HR-300凝膠柱中的洗脫曲線Fig. 2 Elution curves of SIP1 (A), SIP2 (B), and SIP3 (C) on Sephacryl HR-300 gel column
分別取樣品SIP1、SIP2、SIP3組分上樣于Sephacryl HR-300丙烯葡聚糖凝膠分子篩柱,超純水洗脫,自動部分收集器收集,苯酚-硫酸法檢測洗脫液多糖含量,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中樣品SIP1收集液第15~25管分別用超純水稀釋5 倍;SIP2收集液第15~17管稀釋2 倍,SIP3未進(jìn)行稀釋。由圖2可知,SIP1、SIP2、SIP3三組分經(jīng)Sephacryl HR-300凝膠柱后,各自只有一個糖峰,說明SIP1、SIP2、SIP3是單一組分。由圖2A可知,樣品SIP1組分經(jīng)Sephacryl HR-300丙烯葡聚糖凝膠分子篩柱,從第7管開始出現(xiàn)糖峰,且隨著管號的增大吸光度增加,多糖含量增加,在第15~23管達(dá)到最大,隨后降低;而由圖2B、C可知,樣品SIP2、SIP3分別在第7、9管開始出現(xiàn)糖峰,但與SIP1相比,盡管樣品SIP1第15~25管分別用超純水稀釋5 倍,但是吸光度依舊很大,糖含量很高;SIP2與SIP3相比,SIP2吸光度高于SIP3,糖含量高于SIP3,分別按峰收集SIP1、SIP2和SIP3,冷凍干燥,備用。
2.4 紅外光譜結(jié)果
取經(jīng)Sephacryl HR-300凝膠柱純化多糖SIP1,采用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000~400 cm-1區(qū)間進(jìn)行掃描,采集紅外光譜圖,如圖3所示。
圖3 鳶烏賊墨多糖分離組分SIP1的紅外吸收光譜圖Fig. 3 FTIR spectrum of SIP1
紅外吸收光譜中,4 000~1 333 cm-1區(qū)域被稱為特征譜帶區(qū),該區(qū)域吸收峰比較稀疏,容易辨認(rèn),有機化合物的分子中一些主要的官能團(tuán)的特征吸收多發(fā)生在此區(qū)域。由圖3可知,在SIP1的紅外吸收光譜圖中3 500~3 200 cm-1之間出現(xiàn)一個極強的峰,主要由于—OH基在形成氫鍵締合后,O—H鍵拉長,電偶極矩增大而形成的。此外,2 935.7、1 609.8 cm-1有較強吸收峰,前者是C—H鍵的伸縮振動,是糖的特征峰,表明多糖中含有—CH2—,后者為—COO—中C=O非對稱伸縮振動或為C=C或C=N或結(jié)晶水的吸收峰,紅外吸收光譜上1 333~400 cm-1區(qū)域中的譜帶特別密集,通常稱為指紋區(qū),反映了化合物在結(jié)構(gòu)上的微小差別,1 400~1 200 cm-1的一些峰是C—H的變角振動[28]。
2.5 單糖組分分析
單糖結(jié)構(gòu)相近,極性較強,且缺乏光學(xué)活性,給多糖的分離檢測增加了難度,研究者常將多糖水解后采用柱前或柱后衍生化色譜法進(jìn)行分離和檢測,以改善其分離選擇性和提高檢測靈敏度,其中PMP柱前衍生化高效液相色譜法應(yīng)用較為廣泛,其具有反應(yīng)條件較溫和、分析效率高、分析時間短、檢測靈敏度較高等優(yōu)點。
圖4 PMP衍生物空白對照(A)和8 種單糖-PMP衍生物(B)色譜圖Fig. 4 Chromatograms of PMP derivatives of eight monosaccharides
圖5 SIP1(A)、SIP2(B)、SIP3(C)水解樣品的PMP衍生化產(chǎn)物色譜圖Fig. 5 Chromatograms of PMP derivatives of acid hydrolysates of SIP1 (A), SIP2 (B) and SIP3 (C)
根據(jù)上述單糖組分分析方法進(jìn)行PMP衍生化檢測單糖組分,結(jié)果如圖4A所示,在保留時間0.6~2.8 min之間有一些PMP峰,以此作為空白對照,由圖4B可得出,D-Man的保留時間為2.54 min;Rha的保留時間為3.50 min;Lac的保留時間為4.05 min;D-Glc的保留時間為4.92 min;D-Gal的保留時間為5.35 min;D-Ara的保留時間為5.85min;D-Xyl的保留時間為6.00;L-(-)-Fuc的保留時間為6.93 min。
從圖5A可得,樣品SIP1出峰時間分別為2.54、4.92、5.35 min,分別為D-Man、D-Glc、D-Gal 3種單糖,說明樣品SIP1是由D-Man、D-Glc、D-Gal 3 種單糖組成,其中D-Gal是主要組成部分;由圖5B可知,樣品SIP2單糖組成較為復(fù)雜,主要包括:D-Man、Rha、D-Gal、D-Glc及L-(-)-Fuc 5種單糖,出峰時間為別為2.54、3.50、5.35、4.92、6.93 min,其中L-(-)-Fuc含量較高,是主要組成部分,D-Gal、D-Glc含量甚微,猜測應(yīng)是SIP1中沒有收集完全的糖組分,可以忽略不計;而由圖5C可得,樣品SIP3含有D-Man、Rha、D-Gal、D-Glc及L-(-)-Fuc 5種單糖,說明樣品SIP2和SIP3單糖組成相似,但是組成比例不等,其中L-(-)-Fuc也是主要組成成分,而Rha所占比例有所下降,由此可得,SIP1、SIP2、SIP3分別是由不同種類單糖按照不同比例縮合而成。
南海鳶烏賊墨汁粗多糖經(jīng)分離提取、酶法結(jié)合上清液加入1/4氯仿-正丁醇溶液(4∶1,V/V)兩步去除雜質(zhì)蛋白、固相萃取小柱層析除色素后,依次經(jīng)過DEAE-52離子交換柱、Sephacryl HR-300凝膠柱,苯酚-硫酸法測多糖含量,按峰收集,經(jīng)DEAE-52柱收集得到3 個峰組分,分別為SIP1、SIP2、SIP3,將SIP1、SIP2、SIP3分別過Sephacryl HR-300凝膠柱,分別得到單一峰組分。然后分別將SIP1、SIP2、SIP3組分進(jìn)行PMP衍生,上樣于超高效液相色譜,通過與混標(biāo)的色譜圖對比,分析單糖組分,得到:SIP1是由D-Man、D-Glc、D-Gal 3 種單糖按照一定比例縮合而成;SIP2和SIP3分別是由D-Man、Rha、D-Gal、D-Glc及L-(-)-Fuc 5 種單糖按照不同比例縮合而成,南海鳶烏賊墨多糖是由D-Man、D-Glc、D-Gal、Rha、L-(-)-Fuc 5 種單糖組成,PMP衍生化方法,除單糖中D-Xyl和D-Ara不能完全分離外,均可實現(xiàn)良好分離。
鳶烏賊生命周期短、繁殖率強、生長率高,廣泛分布于印度洋和太平洋的熱帶、亞熱帶海域,其中以南海海域數(shù)量較大,是一種具有潛力的生物資源[29-34]。隨著對鳶烏賊資源的開發(fā)利用,其加工副產(chǎn)物墨汁也逐步受到重視,墨汁中富含多糖等活性物質(zhì),多糖具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等生物活性,隨著海洋生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展,對糖類物質(zhì)的研究逐漸深入,為探索糖類生物學(xué)功能及其抗性機理,對其結(jié)構(gòu)分析刻不容緩,本實驗對鳶烏賊墨多糖進(jìn)行了分離純化,得到其單糖組成,但因產(chǎn)品純度問題未能得到單糖組成的比例,今后應(yīng)在此方向進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
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Separation, Purification and Monosaccharide Composition of Polysaccharides from the Ink of Sthenoteuthis oualaniensis in South China Sea
HUANG Hui, YANG Lizhi, YANG Xianqing*, LI Laihao, HAO Shuxian, WEI Ya, WANG Jinxu
(Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, National R&D Center for Aquatic Product Processing,South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China)
Objective∶ To isolate and purify polysaccharides from the ink of Sthenoteuthis oualaniensis in the South China Sea, and to analyze the monosaccharide composition of the purified polysaccharides. Methods∶ Crude polysaccharides were isolated through water extraction followed by alcohol precipitation and passed through a solid phase extraction column to remove the pigment. The polysaccharides were fractionated and further purified into homogeneity by sequential chromatographies on DEAE-52 ion exchange and Sephacryl HR-300 columns. The monosaccharide composition was analyzed by ultra performance liquid chromatography (UPLC) after 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) derivatization.Results∶ Three purified polysaccharides designated as SIP1, SIP2, and SIP3 were obtained. SIP1 was composed of D-mannose,D-glucose, and D-galactose while SIP2 and SIP3 were composed of D-mannose, rat sugar, D-glucose, D-galactose and L-(-)-fucose in different ratios.
sepia ink polysaccharides; separation and purification; monosaccharide analysis
DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724019
TS254.4
A
1002-6630(2017)24-0118-06
黃卉, 楊麗芝, 楊賢慶, 等. 南海鳶烏賊墨多糖分離純化及組分分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(24): 118-123.
10.7506/spkx1002-6630-201724019. http://www.spkx.net.cn
HUANG Hui, YANG Lizhi, YANG Xianqing, et al. Separation, purification and monosaccharide composition of polysaccharides from the ink of Sthenoteuthis oualaniensis in South China Sea[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 118-123. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724019. http∶//www.spkx.net.cn
2016-11-12
農(nóng)業(yè)部財政重大專項(NFZX2013);國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(2014CB441500)
黃卉(1980—),女,副研究員,博士,主要從事水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究。E-mail:huanghuigd@aliyun.com
*通信作者:楊賢慶(1963—),男,研究員,學(xué)士,主要從事水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究。E-mail:yxqgd@163.com