石秀清，周秀娟，施春雷，張 芬，史賢明*

沙門(mén)菌屬特異性檢測(cè)靶點(diǎn)堿基差異位點(diǎn)的識(shí)別及其血清型決定力

石秀清，周秀娟，施春雷，張 芬，史賢明*

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，中美食品安全聯(lián)合研究中心，微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

以美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）已公布的28 株沙門(mén)菌（14 個(gè)血清型）全基因組序列為研究對(duì)象，對(duì)前期研究獲得的7 個(gè)沙門(mén)菌屬特異性檢測(cè)靶點(diǎn)在不同血清型間的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，S9和S69為堿基差異位點(diǎn)最多的兩個(gè)靶點(diǎn)，具有沙門(mén)菌分子血清分型的潛在能力。隨后，通過(guò)分析S9和S69在沙門(mén)菌不同血清型菌株中的差異位點(diǎn)，分別繪制兩個(gè)血清分型靶點(diǎn)的差異位點(diǎn)表，從而獲得了這兩個(gè)靶點(diǎn)同時(shí)用于14 個(gè)沙門(mén)菌血清型的快速分子血清分型的差異位點(diǎn)組合。在這些組合中，同一血清型具有相同的差異位點(diǎn)，不同血清型可以通過(guò)差異位點(diǎn)得以區(qū)分。最后，采集食品樣品192 份，用國(guó)標(biāo)方法獲得疑似沙門(mén)菌21 株；利用血清分子分型靶點(diǎn)S9和S69進(jìn)行快速分型，并同時(shí)用傳統(tǒng)玻片凝集反應(yīng)鑒定方法進(jìn)行驗(yàn)證，兩種方法鑒定結(jié)果的符合率為100%。鑒定結(jié)果為：21 株沙門(mén)菌共包括4 個(gè)不同血清型，其中腸炎沙門(mén)菌10株、鼠傷寒沙門(mén)菌7 株、雞沙門(mén)菌2 株、紐波特沙門(mén)菌2 株?；蚪M序列分析結(jié)果和分離株分型結(jié)果均表明，沙門(mén)菌特異分子檢測(cè)靶點(diǎn)S9和S69相結(jié)合具備沙門(mén)菌的分子血清分型能力，以差異位點(diǎn)表為基礎(chǔ)建立的血清分型方法有望替代傳統(tǒng)的玻片凝集血清分型這一繁雜步驟，從而降低沙門(mén)菌血清鑒定的時(shí)間與成本，為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)應(yīng)用于沙門(mén)菌分子血清分型提供新思路。

沙門(mén)菌；分子血清分型；特異性檢測(cè)靶點(diǎn)；食品樣品；血清鑒定

沙門(mén)菌是引發(fā)食物中毒最主要的食源性致病菌之一，由其引發(fā)的食物中毒病例在世界范圍內(nèi)居首位，每年全球約有1 600萬(wàn)沙門(mén)菌感染病例出現(xiàn)，其中60萬(wàn) 例死亡[1-2]。近年來(lái)，我國(guó)細(xì)菌性食物中毒暴發(fā)事件中，由沙門(mén)菌引起的約占70%～80%[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年約有40 000 例沙門(mén)菌感染病例，但實(shí)際的感染人數(shù)可能要達(dá)20 倍以上[1]，食物傳播是導(dǎo)致人類(lèi)感染沙門(mén)菌的最主要途經(jīng)。沙門(mén)菌屬的菌株型別繁多，抗原復(fù)雜[4]，目前全世界已分離出沙門(mén)菌的血清型多達(dá)2 600 種，46 個(gè)血清組，而我國(guó)約有300 種血清型，37 個(gè)血清組[5]，這使得沙門(mén)菌溯源與污染特征的研究更加復(fù)雜。值得注意的是，沙門(mén)菌血清型存在明顯的宿主特異性[6]，特定的血清型常與食品類(lèi)型相關(guān)聯(lián)[7-9]。因此，建立快速、靈敏的分子血清分型技術(shù)對(duì)食品污染源的追蹤、溯源，暴發(fā)疫情的鑒定以及最終有效地控制疫情意義重大。

當(dāng)前世界各國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和ISO標(biāo)準(zhǔn)均采用傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)方法從食品中分離檢測(cè)沙門(mén)菌[10]，并根據(jù)抗原-抗體反應(yīng)免疫學(xué)原理（血清玻片凝集）鑒定其血清型。但此方法對(duì)于血清型的判讀流程繁瑣，操作人員的主觀判斷所占比例較大，誤差較大，重復(fù)性較差[11-12]。為了克服傳統(tǒng)血清玻片凝集分型技術(shù)的缺點(diǎn)，許多現(xiàn)代的分子生物學(xué)方法被應(yīng)用于開(kāi)發(fā)新型的分子血清分型技術(shù)中[13-17]，如：脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）、多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）和CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）等。而且隨著測(cè)序技術(shù)的不斷革新與進(jìn)步，越來(lái)越多的沙門(mén)菌基因組序列已經(jīng)測(cè)定完成并收錄在GenBank、Sanger等數(shù)據(jù)庫(kù)中[18]。它們與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)相結(jié)合極大地促進(jìn)了沙門(mén)菌的快速檢測(cè)與分子血清分型方法的發(fā)展[19-24]。

到目前為止，還沒(méi)有PCR技術(shù)同時(shí)用于沙門(mén)菌屬的檢測(cè)和血清分型的實(shí)例。2016年，Zhou Xiujuan等[25]基于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）公布的26 株沙門(mén)菌和2 180 株非沙門(mén)菌的全基因組序列，采用比較基因組的方法，從生物信息學(xué)和生物再驗(yàn)證兩個(gè)角度，最終獲得15 個(gè)性能優(yōu)異的沙門(mén)菌屬特異性檢測(cè)靶點(diǎn)。在對(duì)這些檢測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)一步分析中，Zhou Xiujuan等[25]還發(fā)現(xiàn)其中7 個(gè)沙門(mén)菌檢測(cè)靶點(diǎn)與MLST中看家基因具有相似的保守性和血清型差異性，推測(cè)這些特異檢測(cè)靶點(diǎn)將在沙門(mén)菌的檢測(cè)和血清分型上具備巨大潛力。因此，這7 個(gè)沙門(mén)菌屬特異性檢測(cè)靶點(diǎn)不僅可以鑒定出未知菌株中的沙門(mén)菌，同時(shí)還具有進(jìn)一步判定其血清型的潛力。

本實(shí)驗(yàn)比較Zhou Xiujuan等[25]發(fā)現(xiàn)的7 個(gè)沙門(mén)菌屬特異性檢測(cè)靶點(diǎn)在不同血清型間存在的堿基差異位點(diǎn)，并評(píng)價(jià)這些差異位點(diǎn)對(duì)血清型的決定力。通過(guò)整理靶點(diǎn)在沙門(mén)菌不同血清型菌株中的差異位點(diǎn)，繪制出血清分型靶點(diǎn)的差異位點(diǎn)表，并將此表格應(yīng)用于食品樣品中沙門(mén)菌的快速血清分型。最后將分子血清分型結(jié)果再與傳統(tǒng)玻片凝集反應(yīng)實(shí)驗(yàn)相比較，從而驗(yàn)證靶點(diǎn)在實(shí)際應(yīng)用中的血清分型效果。

1 材料與方法

1.1 菌株基因組序列

從NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上獲取并篩選得到2016年6月12日已公布的常見(jiàn)沙門(mén)菌菌株的全基因組，總共14 種血清型的28 株沙門(mén)菌菌株基因組，見(jiàn)表1。1.2 試劑與儀器

表1 用于血清分子分型靶點(diǎn)篩選的沙門(mén)菌基因組Table 1 Genome sequences of Salmonella strains used as molecular targets for serotyping

Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、Mg2＋（MBI Fermentas）、dNTPs、DNA Marker 北京天根生化科技有限公司。

PCR擴(kuò)增儀、5415D臺(tái)式微量離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；PS2A200核酸電泳儀 美國(guó)Hoefer公司；GIS2020凝膠成像儀 上海天能公司；NanoDrop 2000c超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Forma公司；EQR/GL-41超凈工作臺(tái) 新加坡Esco公司；血清鑒定試劑盒（20160101）寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 食品樣品采集

分別從上海市閔行區(qū)東川路A超市，春申路B超市，滄源路C菜市場(chǎng)，滄源路D超市和吳涇E超市5 個(gè)地點(diǎn)采集食品樣品192 份，用于沙門(mén)菌菌株的分離。樣品類(lèi)型分別為肉制品類(lèi)（55 份）、果蔬類(lèi)（45 份）、速凍食品類(lèi)（45 份）、即食食品類(lèi)（47 份）。

1.3.2 MEGA 6.0軟件與分子血清分型靶點(diǎn)SNP差異位點(diǎn)表的構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已完成測(cè)序的沙門(mén)菌全基因組序列。將NCBI中下載的序列，以相同靶點(diǎn)為單位，按照不同血清型排列并合為一個(gè)*.txt文本。將*.txt文本轉(zhuǎn)化為fasta格式后，使用MEGA 6.0軟件打開(kāi)，以S. Typhi CT18對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)序列為參比序列（從5’到3’依次編號(hào)）進(jìn)行對(duì)齊處理，查找不同血清型中對(duì)照參比序列的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）差異位點(diǎn)。將所有SNP差異位點(diǎn)按照血清型的順序歸入Excel表格中。

1.3.3 沙門(mén)菌疑似菌株分離

采用GB 4789.4—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則》[11]分離獲得沙門(mén)菌疑似菌株。具體步驟包括：1）每份樣品取25 g或25 mL，移入225 mL緩沖蛋白胨水液體培養(yǎng)基中，在37 ℃的搖床（150 r/min）上增菌培養(yǎng)10 h；2）取1 mL增菌液轉(zhuǎn)種與10 mL四硫磺酸鈉煌綠增菌內(nèi)，于42 ℃培養(yǎng)18～24 h，同時(shí)另取1 mL增菌液轉(zhuǎn)種與10 mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于37 ℃培養(yǎng)18～24 h；3）分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)亞硫酸鉍瓊脂平板（于37 ℃培養(yǎng)40～48 h）和一個(gè)沙門(mén)菌屬顯色培養(yǎng)基平板（于37 ℃培養(yǎng)18～24 h），觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落，若菌落為黑色有金屬光澤，棕褐色或灰色，則初步判定為沙門(mén)菌。

1.3.4 DNA的提取

參見(jiàn)文獻(xiàn)[15]，使用CTAB法提取沙門(mén)菌基因組DNA，取1 μL提取好的基因組DNA溶液，用超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000c在波長(zhǎng)260 nm和280 nm條件下測(cè)定其純度與濃度，剩余DNA原液置于-20 ℃保存[3]。

1.3.5 PCR反應(yīng)體系與參數(shù)

1.3.5.1 PCR反應(yīng)體系

本實(shí)驗(yàn)中PCR反應(yīng)體系參照體系如下：(NH4)2SO4緩沖液（10×）2.5 μL、MgCl2溶液（50 mmol/L）1.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）1.5 μL、上、下游引物（各10 μmol/L）（0.5＋0.5）μL；TaqDNA聚合酶（1 U/μL）1.0 μL、模板2.5 μL；無(wú)菌去離子水15 μL總體積25 μL[3,25]。

1.3.5.2 PCR反應(yīng)參數(shù)

檢測(cè)S9所用PCR的擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；接著進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min；降溫至12 ℃，反應(yīng)結(jié)束[25]。

檢測(cè)S69所用PCR的擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；接著進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min；降溫至12 ℃，反應(yīng)結(jié)束[3]。

1.3.5.3 所用引物序列

本實(shí)驗(yàn)S9對(duì)應(yīng)的引物為：S9-F：5’-GAGGTCACGCACCATCACAAT-3’和S9-R：5’-ATACGGCACCACCGCATAG-3?[25]。

S69對(duì)應(yīng)的引物為：S69-F：5’-CACAGGAGGAGCAGGATAA-3’和S69-R：5’-CCAGTACAGCAAGGGACAT-3’[3]。

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR產(chǎn)物序列測(cè)定由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3.6 凝膠電泳

本實(shí)驗(yàn)?zāi)z電泳步驟中，取5 μL PCR產(chǎn)物，與1 μL 6×加樣緩沖液混勻，混合物加到含有稀釋10 000 倍的核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，同時(shí)在第1個(gè)點(diǎn)樣孔中加入5 μL 100 bp DNA ladder Marker，接通電源，凝膠電泳電壓控制為160～170 V，時(shí)間20～30 min。

1.3.7 沙門(mén)菌血清玻片凝集

依據(jù)抗原-抗體凝集原理，同時(shí)參照血清鑒定試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，根據(jù)不同的抗體凝集反應(yīng)區(qū)分或分類(lèi)鑒定沙門(mén)菌的血清型[26-27]。其中：H抗血清直接滴于干凈的載玻片上，加入等體積的菌懸液混合，若凝集即為陽(yáng)性，反之為陰性；而O抗血清需要與高溫處理（100 ℃加熱15 min）的菌懸液混合，短時(shí)間內(nèi)凝集為陽(yáng)性，否則為陰性。根據(jù)凝集結(jié)果，對(duì)照血清型的抗原式表[26]來(lái)判斷沙門(mén)菌的血清型。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門(mén)菌屬特異性檢測(cè)靶點(diǎn)中SNP的識(shí)別

通過(guò)靶點(diǎn)引物，從NCBI上獲取的14 個(gè)血清型的28 株腸道沙門(mén)菌菌株基因組上尋找到該靶點(diǎn)的堿基序列。通過(guò)各個(gè)靶點(diǎn)片段序列之間的比對(duì)發(fā)現(xiàn)：同一血清型菌株對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)序列完全一致，而不同血清型沙門(mén)菌株間存在堿基差異，因此，這些特異性檢測(cè)靶點(diǎn)具備區(qū)分沙門(mén)菌血清型的潛力。

通過(guò)各靶點(diǎn)在不同血清型代表性菌株上對(duì)應(yīng)基因片段的比較，以S. Typhi CT18對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)序列為參比序列（從5’到3’依次編號(hào)），找出各靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)血清型之間的SNP位點(diǎn)個(gè)數(shù)，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，在7 對(duì)沙門(mén)菌特異性靶點(diǎn)中，靶點(diǎn)S9對(duì)應(yīng)片段在各血清型之間存在的SNP位點(diǎn)個(gè)數(shù)最多，其次是S69。王中強(qiáng)等[28]研究表明，在基因分型方法建立時(shí)，如果選擇很少位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定便增加了由于等位基因聯(lián)合作用而造成混淆的概率，選擇位點(diǎn)數(shù)量的增加可以提高分辨率，但是當(dāng)選擇的位點(diǎn)達(dá)到一定的數(shù)目，便只會(huì)增加人力、物力的消耗，而不能夠獲取更多的信息。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：S9能區(qū)分14 個(gè)血清型中的11 個(gè)，S69能區(qū)分14 個(gè)血清型中的9 個(gè)。所以本實(shí)驗(yàn)如果僅以S9或者S69單個(gè)靶點(diǎn)對(duì)沙門(mén)菌進(jìn)行血清分型，能夠區(qū)分的血清型種類(lèi)比較有限。但如果將二者組合起來(lái)，能夠完全區(qū)分14 種沙門(mén)菌血清型。所以最終在7 個(gè)沙門(mén)菌屬特異性靶點(diǎn)中篩選出2 個(gè)沙門(mén)菌血清分型的靶點(diǎn)：S9和S69，作為沙門(mén)菌分子血清分型候選靶點(diǎn)。

圖1 沙門(mén)菌屬特異性檢測(cè)靶點(diǎn)在不同血清型沙門(mén)菌株上對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)個(gè)數(shù)Fig. 1 Analysis of the serotyping ability of different Salmonella-specific targets by the number of SNPs

2.2 S9和S69堿基差異位點(diǎn)表的構(gòu)建

采用S9和S69引物，對(duì)14 個(gè)血清型代表菌株基因組進(jìn)行擴(kuò)增，獲取兩靶點(diǎn)的基因片段序列。以S. Typhi CT18對(duì)應(yīng)的S9序列為參比序列（從5’到3’依次編號(hào)），分析S9對(duì)應(yīng)的14 個(gè)片段之間的堿基差異，對(duì)各位點(diǎn)進(jìn)行編號(hào)和堿基變化統(tǒng)計(jì)，如表2所示。結(jié)果表明，靶點(diǎn)S9對(duì)應(yīng)的14 個(gè)血清型菌株基因片段中，Newport、Gallinarum和Dublin這3 個(gè)血清型菌株對(duì)應(yīng)的基因片段之間不存在堿基間的差異，即靶點(diǎn)S9無(wú)法區(qū)分這3 個(gè)血清型菌株。但是選取靶點(diǎn)S69，按照相同方法，對(duì)這3 個(gè)血清型菌株對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)堿基序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，靶點(diǎn)S69對(duì)應(yīng)此3 個(gè)血清型菌株基因片段存在明顯堿基差異（差異位點(diǎn)如表2所示），能夠?qū)⑦@3 個(gè)血清型菌株完全區(qū)分。最終得到如表2所示的靶點(diǎn)S9和S69對(duì)14 個(gè)沙門(mén)血清型堿基差異位點(diǎn)表。

表2 靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)不同血清型的差異位點(diǎn)Table 2 Distinct mutation sites of different serotypes of Salmonella strains

2.3 堿基差異位點(diǎn)表應(yīng)用于沙門(mén)菌食品分離株的血清分型

采集192 份食品樣品，按照GB 4789.4—2010[11]分離鑒定出21 份陽(yáng)性樣本，從每份陽(yáng)性樣本中選取分離株1 株，總共得到21 株疑似沙門(mén)菌菌株。經(jīng)靶點(diǎn)S9 PCR擴(kuò)增并進(jìn)行凝膠電泳，此21 株菌均產(chǎn)生相應(yīng)的明亮條帶，如圖2所示。結(jié)果表明，此21 株可疑沙門(mén)菌菌株全部為沙門(mén)菌。將S9擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果對(duì)照表2，鑒定出這21 株沙門(mén)菌菌株中的17 株菌株的血清型：其中腸炎沙門(mén)菌10 株，鼠傷寒沙門(mén)菌7 株。余下4 株經(jīng)S9擴(kuò)增得到的序列完全一致，相互之間沒(méi)有堿基差異，無(wú)法用靶點(diǎn)S9區(qū)分。然后，再使用S69對(duì)這4 株菌進(jìn)行DNA的PCR擴(kuò)增并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與表2進(jìn)行比對(duì)，鑒定出其中2 株為雞沙門(mén)菌，2 株為紐波特沙門(mén)菌，結(jié)果如表3所示。

圖2 沙門(mén)菌特異性靶點(diǎn)S9 PCR擴(kuò)增Fig. 2 PCR amplification of Salmonella specific targets S9

2.4 傳統(tǒng)血清鑒定方法對(duì)食品分離菌株血清型的驗(yàn)證

通過(guò)沙門(mén)菌H抗血清和O抗血清，對(duì)S9和S69鑒定的沙門(mén)菌菌株的血清型，即2.3節(jié)中21 株疑似沙門(mén)菌菌株對(duì)應(yīng)的血清型進(jìn)行驗(yàn)證。傳統(tǒng)血清鑒定過(guò)程中，血清型菌株與對(duì)應(yīng)血清型的H抗血清和O抗血清均發(fā)生陽(yáng)性的凝集反應(yīng)，其中腸炎沙門(mén)菌（9,12:g,m:－）10 株，鼠傷寒沙門(mén)菌（4,5,12:i:1,2）7 株，雞沙門(mén)菌（9,12:-:-）2 株，紐波特沙門(mén)菌（6,8:e,h:1,2）2 株。驗(yàn)證結(jié)果表明：用靶點(diǎn)S9和S69所確定的沙門(mén)菌血清型與傳統(tǒng)血清鑒定方法驗(yàn)證的結(jié)果符合率達(dá)到100%。證明沙門(mén)菌特異性分子檢測(cè)靶點(diǎn)S9和S69能夠快速準(zhǔn)確地判定沙門(mén)菌血清型。最終統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示。

表3 食品樣品分菌與血清分型結(jié)果Table 3 Iolation, identification and serotyping of Salmonella isolates from food samples

3 結(jié)論與討論

對(duì)沙門(mén)菌進(jìn)行分子血清分型時(shí)，選擇分散于基因組內(nèi)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，大大增加了血清區(qū)分能力，而且能夠建立起密切相關(guān)菌株的進(jìn)化途徑。但是當(dāng)選擇的位點(diǎn)達(dá)到一定的數(shù)目，便只會(huì)增加人力、物力的消耗，而不能夠獲取更多的信息[28]。因此，本實(shí)驗(yàn)從7 個(gè)沙門(mén)菌屬特異性靶點(diǎn)中篩選得到堿基差異位點(diǎn)最多的兩個(gè)靶點(diǎn)——S9和S69。然后通過(guò)比較和整理S9與S69在沙門(mén)菌不同血清型菌株中的差異位點(diǎn)，繪制了血清分型靶點(diǎn)的差異位點(diǎn)表，從而獲得這兩個(gè)靶點(diǎn)同時(shí)用于14 個(gè)沙門(mén)菌血清型的快速分子血清分型的差異位點(diǎn)組合，最后將此組合應(yīng)用于食品樣品分離株的血清分型。血清分型結(jié)果與傳統(tǒng)血清玻片凝集方法得到的結(jié)果進(jìn)行比較，相符率達(dá)到100%。

在對(duì)比優(yōu)勢(shì)上，傳統(tǒng)方法對(duì)食品中分離的疑似沙門(mén)菌進(jìn)行鑒定時(shí)，需要經(jīng)過(guò)生物化學(xué)鑒定和血清學(xué)分型驗(yàn)證[29-30]。生物化學(xué)鑒定程序繁瑣，且需要用到生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)[11]。傳統(tǒng)血清分型則更需要經(jīng)過(guò)多重的反復(fù)驗(yàn)證才能確定沙門(mén)菌血清型，其重復(fù)確認(rèn)操作加重了鑒定工作量，增加了時(shí)間和成本。且檢測(cè)過(guò)程中，操作人員的主觀判斷所占比例較大，誤差較大，重復(fù)性也差[29]。而用分子靶點(diǎn)對(duì)疑似沙門(mén)菌進(jìn)行鑒定，只需要經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和凝膠電泳就可以判斷疑似菌株是否為沙門(mén)菌，然后將PCR產(chǎn)物測(cè)序，得到的序列與構(gòu)建的靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)不同血清型差異位點(diǎn)組合進(jìn)行比對(duì)，24 h內(nèi)就能確定沙門(mén)菌的血清型。這一程序相對(duì)簡(jiǎn)單，工作量少，成本低廉，操作人員的主觀判斷所占比例很小，重復(fù)性好。且比對(duì)現(xiàn)有的分子分型方法，如PFGE、MLST和CRISPR等，本研究開(kāi)發(fā)的方法也具備兩大優(yōu)點(diǎn)：其一，由于選用獨(dú)特的沙門(mén)菌屬特異性檢測(cè)靶點(diǎn)，所以它不僅能判斷疑似菌株是否為沙門(mén)菌，還能同步判斷該沙門(mén)菌的血清型。涵括了疑似菌株的生化鑒定和血清分型兩個(gè)過(guò)程；其二，分型靶點(diǎn)個(gè)數(shù)少，在成本和時(shí)間上比其他分子分型方法更具時(shí)間和成本優(yōu)勢(shì)。

基于本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，S9和S69兩個(gè)靶點(diǎn)能夠解決一定范圍內(nèi)沙門(mén)菌血清型的判別，將特異性靶點(diǎn)不僅用于沙門(mén)菌的檢測(cè)更同步用于其血清分型，開(kāi)創(chuàng)了沙門(mén)菌檢測(cè)和分型同步的先例，且能夠從分子層面上為沙門(mén)菌血清分型提供新思路。其快速有效的方式，對(duì)于及時(shí)有效控制沙門(mén)菌流行病學(xué)疾病的傳播與暴發(fā)起到至關(guān)重要的決定性作用。

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Identification of Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) in Different Serotypes of Salmonella-Specific Targets and Their Potential for Molecular Serotyping

SHI Xiuqing, ZHOU Xiujuan, SHI Chunlei, ZHANG Fen, SHI Xianming*
(MOST-USDA Joint Research Center for Food Safety, State Key Laboratory of Microbial Metabolism,School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

The single nucleotide polymorphisms (SNPs) in different serotypes of 7 specific targets for Salmonella detection were analyzed based on the whole genome sequences of 28 Salmonella strains (14 serotypes) published on NCBI. The results showed that S9 and S69 had more SNPs than any other target, making them a potential tool for Salmonella serotyping.Subsequently, the distinct nucleotide mutation sites of the two candidate molecular serotyping targets in different serotypes of Salmonella were analyzed. As a result, various combinations of the mutation sites were obtained for rapid molecular serotyping of 14 Salmonella serotypes, and the results showed that identical mutation sites existed in the same serovar,while different mutation sites were found in diverse serovars. Finally, 21 suspected Salmonella isolates were obtained by the national standard method from 192 food samples collected from supermarkets and open-air markets in Shanghai. The results of molecular serotyping by targets S9 and S69 were 100% consistent with the results of the traditional slide agglutination test; the Salmonella isolates were assigned to 4 different serovars, 10 strains of Salmonella Enteritidis, 7 strains of Salmonella Typhimurium, 2 strains of Salmonella Gallinarum and 2 strains of Salmonella Newport. The results of genome sequence analysis and strain serotyping showed that the combination of Salmonella-specific targets S9 and S69 had the potential for molecular serotyping of Salmonella, which is expected to be a time-saving and cheaper alternative to the traditional slide agglutination test and can provide a new idea for the application of PCR technology in Salmonella molecular serotyping.

Salmonella; molecular serotyping; Salmonella-specific targets; food samples; serum identification

2016-12-20

政府間國(guó)際科技創(chuàng)新合作重點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)（2016YFE0106100）

石秀清（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c微生物。E-mail：249597976@qq.com

*通信作者：史賢明（1961—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c微生物。E-mail：xmshi@sjtu.edu.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724008

Q781

A

1002-6630（2017）24-0047-06

石秀清, 周秀娟, 施春雷, 等. 沙門(mén)菌屬特異性檢測(cè)靶點(diǎn)堿基差異位點(diǎn)的識(shí)別及其血清型決定力[J]. 食品科學(xué), 2017,38(24): 47-52.

10.7506/spkx1002-6630-201724008. http://www.spkx.net.cn

SHI Xiuqing, ZHOU Xiujuan, SHI Chunlei, et al. Identification of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in different serotypes of Salmonella-specific targets and their potential for molecular serotyping[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 47-52.(in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724008. http∶//www.spkx.net.cn