喬維維，黃明明，王佳媚，嚴文靜，章建浩,*，楊龍平

（1.國家肉品質(zhì)量與安全控制工程技術研究中心，農(nóng)業(yè)部畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點開放實驗室，江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.海南大學食品學院，海南 海口 570228）

低溫等離子體對生鮮牛肉殺菌效果及色澤的影響

喬維維1，黃明明1，王佳媚2，嚴文靜1，章建浩1,*，楊龍平1

（1.國家肉品質(zhì)量與安全控制工程技術研究中心，農(nóng)業(yè)部畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點開放實驗室，江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.海南大學食品學院，海南 ?？?570228）

為探討低溫等離子體在不顯著影響牛肉色澤的條件下對牛肉殺菌的最優(yōu)工藝，在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken響應面法研究了電壓、處理時間與O2比例對殺菌率及紅度a*值的影響，模擬得到了二次多項式回歸方程的預測模型。結果表明低溫等離子體能有效降低牛肉細菌殘留量，最佳殺菌工藝為：電壓72 kV，處理時間86 s，O2、CO2和N2比例分別為35%、35%和30%。在此條件下，牛肉仍保持較好的顏色，殺菌率為93.75%，與模型預測值94.04%吻合良好，說明優(yōu)化出的回歸方程對于生產(chǎn)實際有一定的理論指導意義。

低溫等離子體；牛肉；殺菌；a*值；響應面法

生鮮牛肉由于口感良好、營養(yǎng)豐富而日益受到消費者的青睞。目前，我國各大中超市生鮮牛肉仍以裸露或覆蓋保鮮膜置于冷柜銷售為主。微生物污染及肉色異常往往是造成腐敗浪費和銷售滯緩的主要原因，限制了生鮮肉工業(yè)的發(fā)展。為保障品質(zhì)并延長產(chǎn)品的貨架期，目前廣泛研究的適用于生鮮類產(chǎn)品的冷殺菌技術包括電離輻射、超高壓、脈沖電場、振蕩磁場及高功率超聲波等[1]，但普遍存在效果有限及操作條件嚴格等問題。介質(zhì)阻擋放電（dielectric barrier discharge，DBD）低溫等離子體是一種新興的殺菌技術，設備操作簡單[2]；不會使鮮肉產(chǎn)生明顯升溫[3]，在特定處理條件下感官變化不顯著[4]，具有廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)的前景。

DBD低溫等離子體是在放電空間內(nèi)插入絕緣介質(zhì)的一種非平衡態(tài)氣體。將密封包裝食品置于電極之間，當施加足夠高的交流電壓時，包裝內(nèi)氣體被激發(fā)而形成均勻彌散的微放電。通過激發(fā)包裝內(nèi)部的氣體形成等離子體對包裝牛肉進行殺菌，有效避免了先殺菌后包裝造成的二次污染[5]。惰性氣體、O2和空氣等都可以激發(fā)產(chǎn)生不同成分的等離子體[6-7]。等離子體的化學性質(zhì)非?；顫?，可作用于細胞表面，破壞細胞外結構的完整性[8]；也能氧化損傷生物大分子，包括DNA、蛋白質(zhì)和脂類等物質(zhì)[9-10]，從而引起細菌失活。但是，這些活性成分的壽命很短，半衰期較長的臭氧及其他成分在24 h內(nèi)都會逐漸轉變?yōu)榛鶓B(tài)[11]。研究報道等離子體能完全殺滅聚合物、玻璃和金屬等多種材料表面的酵母菌、細菌和芽孢，甚至病毒[12-13]，對果蔬等營養(yǎng)基質(zhì)表面的細菌具有良好的殺菌效果[14-16]。

低溫等離子體對包裝牛肉的殺菌效果研究相對較少。Kim等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與純He相比，O2與He混合激發(fā)形成的等離子體對培根表面接種的致病菌的殺菌效果普遍提高了約1 lg（CFU/g）；但有研究認為，N2能比惰性氣體形成種類更多的活性成分[18]，且混合氣體的殺菌效果比單一氣體好[19]。R?d等[20]在牛肉干表面接種單核增生性李斯特菌后用等離子體處理，發(fā)現(xiàn)隨著等離子體激發(fā)功率和時間延長，菌落總數(shù)能夠降低1.6 lg（CFU/g），牛肉干的a*值有一定下降。本研究以2 cm厚牛肉塊為研究對象，采用較為廉價的常用氣體：N2固定為30%，防止包裝塌陷及降低電負性氣體含量，配以不同配比O2及CO2，研究電壓、處理時間和O2比例對殺菌率及牛肉a*值的影響；在不顯著影響牛肉色澤基礎上，優(yōu)化殺菌工藝，為DBD低溫等離子體在生鮮牛肉冷殺菌領域的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛背最長肌 南京蘇果超市衛(wèi)崗店。

氯化鈉、平板計數(shù)瓊脂 青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

低溫等離子體設備 江蘇蘇美達儀器設備有限公司；MAP-H360復合氣調(diào)保鮮包裝機、包裝盒、包裝膜蘇州森瑞保鮮設備有限公司；CR-400型全自動測色色差儀 日本柯尼卡美能達控股公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科學儀器有限公司；XC07-Ⅱ無菌拍打式均質(zhì)器南京寧凱儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉加工及處理

將與牛肉接觸的刀具、包裝盒用75%酒精消毒，超凈臺內(nèi)紫外滅菌30 min。將原料肉剔除筋、膜及其他雜質(zhì)后，換刀具，再次削除表面肌肉，分割成長方塊（5 cm×5 cm×2 cm），互相摩擦充分接觸后置于聚丙烯包裝盒（17 cm×12 cm×3.2 cm）內(nèi)。從中隨機抽取4 盒，充空氣包裝作為對照組。其余分別按不同因素水平氣調(diào)包裝并進行低溫等離子體處理，每個處理重復4 次，4 ℃貯存24 h。

1.3.2 殺菌率的測定

打開包裝樣品以環(huán)狀取樣器鉆取肉塊中心牛肉20 g于自封袋，用無菌剪刀切碎、混勻，加入180 mL無菌生理鹽水，均質(zhì)器以12 次/s拍打40 s，梯度稀釋后選擇適宜稀釋度涂平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，計數(shù)。按下式計算低溫等離子體殺菌率。

式中：N0、Np分別為對照組和處理組菌落總數(shù)/（CFU/g）。

1.3.3 色澤的測定

以標準白板校正的色差儀測定牛肉表面的紅度a*值，每個樣品測定3 個點，取其平均值。

1.3.4 低溫等離子體處理條件對生鮮牛肉殺菌效果及色澤的影響

1.3.4.1 電壓對低溫等離子體殺菌率及a*值影響

低溫等離子體處理階段，固定處理時間為60 s，氣體組成為35% O2、35% CO2、30% N2，然后按照電壓0、50、60、70、80、90 kV不同的梯度進行處理。

1.3.4.2 處理時間對低溫等離子體殺菌率及a*值影響

低溫等離子體處理階段，固定電壓為70 kV，氣體組成為35% O2、35% CO2、30% N2，然后按照處理時間0、30、60、90、120、150 s不同的梯度進行處理。

1.3.4.3 O2比例對低溫等離子體殺菌率及a*值影響

低溫等離子體處理階段，固定處理時間為60 s，電壓為70 kV，然后按照N2固定為30%，O2與CO2分別為0%+70%、15%+55%、25%+45%、35%+35%、45%+25%、55%+15%的氣體比例進行處理。

1.3.5 響應面試驗方法設計

在1.3.4節(jié)單因素試驗的研究結果基礎上，選擇電壓、處理時間、O2比例的因素水平，以a*值為參考、殺菌率為評價指標進行響應面優(yōu)化分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

單因素試驗結果用Excel 2010軟件分析作圖，用Design-Expert 8.0軟件處理響應面試驗結果，并用最小二乘法進行二次多項式回歸統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同殺菌條件對生鮮牛肉殺菌效果及色澤的影響

2.1.1 電壓對低溫等離子體殺菌率及a*值的影響

圖1 電壓對殺菌率及a*值的影響Fig. 1 Effect of voltage on sterilization eff i ciency and a* value

由圖1可見，氣調(diào)未處理組（電壓為0 kV）由于含有CO2，對牛肉有一定的抑菌作用。低溫等離子體處理后，殺菌率呈先上升后平緩的趨勢，隨著電壓的升高，放電功率增加，從而增加高能粒子的密度[22]，殺菌率提高。當處理電壓為70 kV時，殺菌率達到最高值，之后殺菌率維持穩(wěn)定。可能因為高電壓時氣體碰撞加劇，電離狀態(tài)不穩(wěn)定，各類粒子進一步聚合或反應消耗，有效殺菌成分不再增加所導致。氣調(diào)未處理組的a*值高于各處理組，說明低溫等離子體對牛肉肉色有不利影響，但電壓為50～80 kV時，a*值均大于充空氣包裝中牛肉a*值19.67，肉色較紅；電壓高于80 kV時，a*值迅速下降，可能是過高的電壓破壞了肌紅蛋白及色素，使肉色變暗。此外，過高的電壓會對陰極造成損傷，因此，綜合考慮選擇電壓為60～80 kV。

2.1.2 處理時間對低溫等離子體殺菌率及a*值影響

圖2 處理時間對殺菌率及a*值的影響Fig. 2 Effect of processing time on sterilization eff i ciency and a* value

由圖2得出，低溫等離子體處理可以有效降低牛肉細菌，當處理時間為0～60 s時，隨著處理時間的延長，殺菌率逐漸升高；當處理時間長于60 s時，殺菌率上升緩慢。Song等[21]研究等離子體對火腿表面的殺菌，發(fā)現(xiàn)處理時間對殺菌效率有顯著影響，時間越長殺菌率越高。Hu Miao等[22]的研究表明殺菌率隨時間延長先上升后平緩，與本研究結果一致。這可能是由于隨處理時間的延長，產(chǎn)生的活性氧自由基等殺菌物質(zhì)濃度逐漸增加，90 s后已超過能與表面細菌充分反應的濃度；此外，由于低溫等離子體是一種表面殺菌技術，對牛肉內(nèi)部的細菌殺菌作用有限，故對肉塊整體的殺菌率不再持續(xù)快速上升。a*值隨處理時間的延長逐漸降低，處理時間短于90 s時牛肉顏色均優(yōu)于充空氣包裝，處理120 s時肉色明顯變暗。隨著處理時間的延長，低溫等離子體中的活性氧自由基等成分逐漸增加，導致高鐵肌紅蛋白的含量增加，使a*值逐步降低[23]。在不顯著影響肉色的前提下，選擇處理時間為30～90 s。

2.1.3 O2比例對低溫等離子體殺菌率及a*值的影響

圖3 O2比例對殺菌率及a*值的影響Fig. 3 Effect of oxygen percentage on sterilization eff i ciency and a* value

原始氣體的組成決定了低溫等離子體形成的成分[24]。研究表明，20%以上的O2能夠促進形成較好的肉色，O2比例超過55%時護色效果不再顯著增加[25]；CO2可溶解于汁液，降低牛肉pH值從而抑菌。故本研究采用O2與CO2分別為0%+70%、15%+55%、25%+45%、35%+35%、45%+25%、55%+15%研究氣體組成的影響。由圖3可以看出，O2比例在0%～35%時，低溫等離子體的殺菌率迅速增加；O2比例大于35%時，低溫等離子體的殺菌率呈現(xiàn)下降趨勢，降幅較小。這可能是在低O2比例時，低溫等離子體產(chǎn)生活性氧等殺菌性自由基的總量隨O2比例的增加而升高，CO2的抑菌性降低程度低于自由基殺菌作用的增長；當O2比例大于35%時，CO2的抑菌作用進一步減弱，而產(chǎn)生的自由基超過與牛肉表面細菌充分反應的總量，二者疊加使殺菌率降低。此外，不同組成的氣體會造成放電量的差異，H2O、CO2與O2等電負性氣體能夠吸附電離的自由電子，當再次外施電壓時，這些電子在電場作用下又被釋放出來，引發(fā)下一次放電。放電量的大小是電子吸附和電子釋放2 個過程相互競爭的結果[26]，影響最終各自由基成分的濃度。a*值隨O2比例變化的趨勢與殺菌率總體一致。可能是在低O2比例時，牛肉中肌紅蛋白與氧結合，氧合肌紅蛋白含量隨O2比例的增加而升高，肌肉顏色呈現(xiàn)令人愉悅的櫻桃紅色；當O2比例大于35%時，高濃度的自由基與氧合肌紅蛋白的反應加劇，促進高鐵肌紅蛋白含量增加使肉色變暗。故選擇合適的O2比例為25%～45%。

2.2 響應面試驗結果及分析

2.2.1 回歸模型建立及顯著性分析

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，綜合分析單因素試驗結果，選取對殺菌率影響顯著的電壓、處理時間和O2比例，設計了3因素3水平的響應面分析試驗，試驗結果見表1。

表1 響應面設計及結果Table 1 Experiment design and results for response surface analysis

以低溫等離子體殺菌率為響應值，利用Design-Expert 8.0軟件對表1中的殺菌率數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得到殺菌率對自變量的多元回歸方程為：Y＝-639.57+12.36A+2.49B+10.36C-0.015AB-0.018AC-4.89×10-3BC-0.072A2-6.96×10-3B2-0.12C2。

表2 殺菌率及a*值回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance of regression equations for two response variables

由表2可知，殺菌率及a*值回歸模型極顯著（p＜0.01），失擬項不顯著（P＝0.105 9＞0.05，P＝0.104 5＞0.05），方程的決定系數(shù)（R2）和校正決定系數(shù)（R2Adj）較高，說明模型的擬合度高，試驗誤差小，能夠用于分析電壓、處理時間以及O2比例對低溫等離子體的殺菌率及牛肉a*值的交互作用并對其進行預測。

各因素的顯著性檢驗表明：一次項中A、B對于2 個響應值的影響極顯著（p＜0.01），C對響應值的影響顯著（p＜0.05），而所有的二次項對響應值的影響均極顯著（p＜0.01）；交互項中，電壓與處理時間及電壓與O2比例的交互作用（AB、AC）對響應值影響顯著（p＜0.05，p＜0.01），BC交互項影響不顯著。這些結果表明低溫等離子體殺菌過程中，三因素對殺菌率及a*值的影響是非線性的。由于在實際處理過程中，各個因素往往同時起作用，因此在維持良好肉色的前提下研究它們的交互作用對提高牛肉的殺菌率具有重要意義。本研究以提高殺菌率為主要目的，以下僅討論三因素對殺菌率的交互作用。

2.2.2 電壓和O2比例對殺菌率的交互作用

圖 4 電壓和O2比例對殺菌率交互作用的響應面圖Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactive effect of voltage and oxygen percentage on sterilization eff i ciency

通過回歸模型繪制響應面，從響應面的形狀可以反映出兩試驗因素之間的交互作用是否顯著。圖4是固定處理時間為60 s時，電壓和O2比例對低溫等離子體殺菌率的響應面，可以看出，電壓和O2比例對殺菌率具有明顯的交互作用。響應面的形狀反映了因素對變量的交互作用，曲率越大，表明交互作用越顯著，反之越弱。電壓比O2比例的曲面斜率更大，說明電壓對殺菌率的影響更顯著。

由表3可知，在特定電壓下，O2比例越偏離臨界值，殺菌率越低。當電壓為60 kV時，該臨界值約為36.26%；當電壓增加到80 kV時，臨界值減少到34.84%。將表中的O2比例臨界值對電壓進行線性回歸分析，可以看出O2比例對殺菌率影響的臨界值隨著電壓的增大呈線性降低趨勢（y＝-0.070 9x+40.518，R2＝1），但變化并不顯著。殺菌率隨電壓的增加呈先上升后平緩趨勢，當電壓為70 kV時，O2比例的臨界值為35.55%，殺菌率為87.80%，繼續(xù)增大電壓，殺菌率略有下降，這與單因素試驗結果基本一致。

表3 不同電壓下O2比例對殺菌率影響的臨界值Table 3 Critical oxygen percentages for sterilization eff i ciency at different voltage levels

表4 不同O2比例下電壓對殺菌率影響的臨界值Table 4 Critical voltages for sterilization eff i ciency at different oxygen percentages

由表4可知，電壓對殺菌率影響的臨界值隨著O2比例的增加線性降低，殺菌率隨O2比例的增加呈先上升后下降趨勢。當O2比例為35%時，殺菌率為89.40%，當O2比例為45%時，殺菌率為77.62%，下降顯著，因此過高的O2比例會抑制低溫等離子體的殺菌作用。

2.2.3 電壓和處理時間對殺菌率的交互作用

圖5 電壓和處理時間對殺菌率交互作用的響應面圖Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effect of voltage and processing time on sterilization eff i ciency

圖5 是固定O2比例為35%，電壓和處理時間對殺菌率的響應面，可以看出，電壓和處理時間對殺菌率具有明顯的交互作用。處理時間比電壓的曲面斜率更大，說明處理時間對殺菌率的影響更顯著。對開放體系的低溫等離子體研究表明，隨著供應能量增加和時間的延長，自由基含量線性上升，食品表面的食源性致病菌殺菌率持續(xù)升高[27]。而本研究中低溫等離子體產(chǎn)生于密閉包裝內(nèi)，自由基含量隨著電壓和處理時間的延長逐漸飽和，不同條件下高能粒子間的復雜反應導致自由基成分發(fā)生轉變，較高電壓時的殺菌率反而有所下降[20]。

表5 不同電壓下處理時間對殺菌率影響的臨界值Table 5 Critical processing times for sterilization eff i ciency at different voltage levels

當電壓增加時，處理時間對殺菌率影響的臨界值呈現(xiàn)降低的趨勢，而殺菌率先上升后降低。由表5可知，當電壓大于70 kV時，殺菌率開始降低。因此電壓不應過高。處理時間對電壓臨界值進行線性回歸分析的結果（y＝-1.099 8x+166.5，R2＝1）表明，處理時間影響殺菌率的臨界值隨著電壓的升高呈降低趨勢，且變化顯著。在實際應用中，為達到快速高效的目的，應選擇時間較短的處理條件。對于電壓的臨界值，當處理時間延長時呈現(xiàn)降低的趨勢，而殺菌率持續(xù)上升。

表6 不同處理時間下電壓對殺菌率影響的臨界值Table 6 Critical voltages for sterilization eff i ciency at different processing times

具體關于電壓對于處理時間的臨界值及殺菌率的影響結果見表6。當處理時間在60～90 s之間時，電壓的臨界值變化較小，殺菌率變化也不顯著。綜合表5、6的結果，推斷在響應曲面試驗水平下，電壓為70.00～74.76 kV，處理時間為78.51～90.00 s內(nèi)，殺菌率達到最高值。

2.3 驗證實驗結果

限定a*值大于19.67的范圍條件下取殺菌率的最大值，預測最佳處理條件為：處理時間86.08 s、電壓71.91 kV，O2、CO2、N2比例分別為34.88%、35.12%、30.00%。在此工藝下，殺菌率預測值為94.04%。為便于操作，調(diào)整最佳處理條件為：處理時間86 s、電壓72 kV，O2、CO2、N2比例分別為35%、35%、30%。在此條件下，做3 次平行驗證實驗，實際a*值為19.74，殺菌率為93.75%，與預測值相比誤差為0.31%，這表明該模型的預測效果良好，響應面模型優(yōu)化試驗結果可靠。

3 結 論

通過單因素試驗研究了電壓、處理時間和O2比例對牛肉表面殺菌率及a*值的影響，并采用響應面法對低溫等離子體工藝進行優(yōu)化，通過回歸分析建立了殺菌率的二次多項式預測模型。優(yōu)化后的殺菌率比單因素最高殺菌率93.71%提高了0.04%。試驗結果表明優(yōu)化后的DBD低溫等離子體對牛肉表面殺菌具有較好的效果，對其實際應用有一定的理論指導意義。

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Effect of Cold Plasma on Sterilization and Color of Fresh Beef

QIAO Weiwei1, HUANG Mingming1, WANG Jiamei2, YAN Wenjing1, ZHANG Jianhao1,*, YANG Longping1
(1. National Center of Meat Quality and Safety Control, Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture, Jiangsu Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing for Quality and Safety Control, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2. College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, China)

In order to obtain the optimal sterilization conditions for fresh beef with a cold plasma system, where beef color is not signif i cantly impacted, the sterilization eff i ciency and redness (a*) value were optimized as a function of voltage,treatment time and O2percentage using a combination of one-factor-at-a-time method and response surface methodology with a Box-Behnken design. A quadratic polynomial regression equation to predict the two response variables was fi tted. The results showed that cold plasma could effectively reduce the total viable count of beef, and a voltage of 72 kV, a processing time of 86 s and an atmosphere consisting of 35% O2, 35% CO2and 30% N2were found to be the optimal conditions to obtain a higher sterilization efficiency of 93.75%, agreeing with the predicted value (94.04%). The optimization model proposed in this study can provide a useful guideline for practical application of cold plasma as a sterilization technology.

cold plasma; beef; sterilization; a* value; response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201723038

TS201.6

A

1002-6630（2017）23-0237-06

喬維維, 黃明明, 王佳媚, 等. 低溫等離子體對生鮮牛肉殺菌效果及色澤的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(23): 237-242.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723038. http://www.spkx.net.cn

QIAO Weiwei, HUANG Mingming, WANG Jiamei, et al. Effect of cold plasma on sterilization and color of fresh beef[J]. Food Science,2017, 38(23): 237-242. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723038. http://www.spkx.net.cn

2016-08-25

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2015BAD16B05）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目（CX（15）1049）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目

喬維維（1991—），女，碩士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。E-mail：2014108073@njau.edu.cn

*通信作者：章建浩（1961—），男，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。E-mail：nau_zjh@njau.edu.cn