劉 珂，熊麗姬，高金燕，陳紅兵，佟 平*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

熱加工對(duì)雞蛋中4 種主要過(guò)敏原結(jié)構(gòu)的影響

劉 珂1,2，熊麗姬1,2，高金燕2，陳紅兵1,3，佟 平1,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

為探究熱加工對(duì)雞蛋主要過(guò)敏原結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)雞蛋清中的4 種過(guò)敏原進(jìn)行不同條件的熱加工，并利用圓二色光譜、紫外-可見(jiàn)光光譜、外源熒光光譜對(duì)加熱前后過(guò)敏原的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。結(jié)果表明，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)熱不穩(wěn)定，隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的升高，分子結(jié)構(gòu)逐漸展開(kāi)，芳香族殘基和疏水基團(tuán)暴露于分子表面；輕微加熱使卵白蛋白分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)更加有序，吸光度減小，表面疏水性增大，隨著加熱程度的增大，其二級(jí)結(jié)構(gòu)變得無(wú)序，分子發(fā)生聚集；加熱后卵類黏蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，輕微加熱其分子展開(kāi)，吸光度和熒光強(qiáng)度增大，繼續(xù)加熱使蛋白分子部分聚集；熱處理使溶菌酶分子的有序性下降，芳香族殘基和疏水基團(tuán)逐漸暴露，但隨著加熱程度的增加，蛋白分子發(fā)生部分聚集。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)研究加熱對(duì)雞蛋過(guò)敏原致敏性的影響提供理論依據(jù)。

熱加工；雞蛋過(guò)敏原；光譜分析；結(jié)構(gòu)

雞蛋富含優(yōu)質(zhì)蛋白、碳水化合物、脂肪及微量元素[1]，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，且價(jià)格相對(duì)低廉，適用人群廣泛，頗受人們喜愛(ài)。但是，雞蛋過(guò)敏也是常見(jiàn)于嬰幼兒和兒童的食物過(guò)敏反應(yīng)[2]。雞蛋蛋清中的主要過(guò)敏原有4 種[3]，分別是卵類黏蛋白（ovomucoid，OVM）、卵白蛋白（ovalbumin，OVA）、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（ovotransferrin，OVT）和溶菌酶（lysozyme，Lys）。過(guò)敏原的致敏性與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，加熱作為一種最常見(jiàn)的加工方式，能夠改變過(guò)敏原蛋白的結(jié)構(gòu)，暴露或隱藏過(guò)敏原蛋白的表位，從而使其致敏性發(fā)生變化[4-6]。因此，對(duì)過(guò)敏原結(jié)構(gòu)的研究顯得十分必要。

目前常采用光譜分析技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，常用的包括圓二色光譜（circular dichroism，CD）、熒光光譜和紫外-可見(jiàn)光（ultraviolet-visible，UVVis）光譜等[7]。其中，CD是樣品在左右偏振光的照射下產(chǎn)生的吸收光譜，在測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的應(yīng)用中越來(lái)越廣泛[8]。UV-Vis光譜及熒光光譜主要表征蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，UV-Vis光譜可考察蛋白質(zhì)展開(kāi)的變化，而熒光光譜可表征蛋白質(zhì)分子表面疏水性的變化。本研究采用離子層析方法對(duì)OVT、OVA和Lys進(jìn)行分離純化，并利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對(duì)分離得到的3 種過(guò)敏原以及購(gòu)買(mǎi)的OVM的純度和性質(zhì)進(jìn)行鑒定，采用不同的加熱條件對(duì)雞蛋4 種主要過(guò)敏原進(jìn)行加熱處理，并通過(guò)CD、UV-Vis光譜、熒光光譜來(lái)表征熱加工對(duì)雞蛋過(guò)敏原結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白殼雞蛋 市售。

OVM（純度大于90%） 美國(guó)Sigma公司；預(yù)染Marker 德國(guó)Fermentas公司；牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

迷你型蛋白垂直電泳儀、GS-800光密度掃描儀、Model680酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；96孔可拆酶標(biāo)板丹麥NUNC公司；恒溫水浴鍋 德國(guó)Kottermann公司；J-810 CD儀 日本分光公司；TU-1901 UV-Vis分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；F-4500熒光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 雞蛋主要過(guò)敏原的分離純化

參照周煌[9]的方法，采用CM Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換柱初步分離OVT、OVA和Lys，然后用羥基磷灰石柱層析進(jìn)一步純化。1.3.2 雞蛋主要過(guò)敏原的純度分析

收集分離所得3 種過(guò)敏原，采用不連續(xù)SDS-PAGE對(duì)分離所得3 種過(guò)敏原及OVM進(jìn)行分析，將10 μL樣品與10 μL上樣緩沖液混合后，取15 μL上樣，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的分離膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠，電流設(shè)置為6 mA、30 min和12 mA、90 min。電泳后，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)顯色，脫色后在GS-800光密度掃描儀上對(duì)凝膠進(jìn)行分析。

1.3.3 雞蛋主要過(guò)敏原的質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定雞蛋中4 種主要過(guò)敏原的質(zhì)量濃度。將牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得方程y＝0.002x-0.002（R2＝0.997），在0～500 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。根據(jù)該方程計(jì)算4 種主要過(guò)敏原質(zhì)量濃度，以備后續(xù)熱處理和結(jié)構(gòu)測(cè)定質(zhì)量濃度的選擇。

1.3.4 雞蛋主要過(guò)敏原的熱加工處理

將雞蛋4 種主要過(guò)敏原OVT、OVA、OVM和Lys溶液稀釋至0.5 mg/mL，分別置于100 ℃水浴中恒溫加熱10、15、20、25 min，80、90 ℃水浴恒溫加熱25 min，加熱完成后置于冰水中冷卻，備用。1.3.5 雞蛋主要過(guò)敏原的CD分析

采用CD分析熱處理前后4 種主要過(guò)敏原的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。將OVT溶液稀釋至0.25 mg/mL，OVA、OVM和Lys稀釋至0.5 mg/mL。遠(yuǎn)紫外波長(zhǎng)掃描范圍設(shè)定為190～240 nm，掃描速率為100 nm/min，光徑為0.1 cm，間隔0.1 nm，帶寬0.1 nm，平行測(cè)樣3 次。通過(guò)在線CD分析網(wǎng)站（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以平均摩爾橢圓率θ表示，單位為deg·cm2/dmol。

1.3.6 雞蛋主要過(guò)敏原的UV光譜分析

采用UV光度計(jì)檢測(cè)加熱處理前后4 種主要過(guò)敏原展開(kāi)情況的變化。將樣品蛋白溶液稀釋成為0.1 mg/mL，波長(zhǎng)掃描范圍為250～350 nm，波長(zhǎng)間隔為1.0 nm，掃描速率中等，帶寬為2.0 nm，響應(yīng)時(shí)間為0.2 s。

1.3.7 雞蛋主要過(guò)敏原的外源性熒光光譜分析

采用以8-苯氨基-1-萘磺酸（8-a n i l i n o-1-naphthalenesulfonate，ANS）為熒光探針的熒光光譜，分析熱處理前后4 種主要過(guò)敏原表面疏水性變化。樣品蛋白溶液用磷酸鹽緩沖液（0.02 mmol/L，pH 7.4）稀釋成0.1 mg/mL，以超純水作為空白。在4 mL稀釋好的樣品中，加入20 μL 5 μmol/L ANS混勻，室溫避光反應(yīng)2 h。熒光色譜測(cè)量條件為：激發(fā)波長(zhǎng)390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍400～650 nm，狹縫寬度為5.0 nm，光徑1 cm，掃描速率為1 200 nm/min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin Pro 8軟件對(duì)CD、UV-Vis、熒光3 種光譜結(jié)果進(jìn)行作圖；并采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件的單因素方差分析法對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量、UV-Vis及熒光特征吸收峰的最大吸光度的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞蛋主要過(guò)敏原分離純化與鑒定

圖1 雞蛋主要過(guò)敏原的SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE patterns of major egg white allergens

利用SDS-PAGE對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離純化的OVT、OVA和Lys以及購(gòu)買(mǎi)的OVM的純度及分子質(zhì)量進(jìn)行分析，如圖1所示，OVT分子質(zhì)量約為76 kD，OVA分子質(zhì)量約為43 kD，OVM分子質(zhì)量約為28 kD，Lys分子質(zhì)量約為14.3 kD。經(jīng)Quantity One軟件對(duì)電泳圖進(jìn)行分析，OVT、OVA、OVM和Lys的純度均達(dá)到98%以上。

2.2 雞蛋主要過(guò)敏原熱加工后的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

圖2 不同加熱條件處理前后4 種雞蛋過(guò)敏原CD圖Fig. 2 Effect of heat treatment under different conditions on secondary structure of four egg white allergens measured by CD spectroscopy

表1 不同加熱條件處理前后4 種雞蛋過(guò)敏原二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量Table 1 Secondary structure contents of four white allergens subjected to different heating conditions%

由圖2A可知，未加熱處理的OVT的光譜曲線，在192 nm處有一個(gè)正峰，208 nm和222 nm處呈負(fù)峰，這表明具有典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)；同時(shí)在195 nm有一個(gè)正峰，215 nm處有一個(gè)負(fù)峰，這是β-折疊的典型結(jié)構(gòu)，說(shuō)明未加熱OVT具有α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)。加熱處理后，在208 nm和222 nm處的負(fù)峰峰值降低，在192 nm和195 nm處的正峰峰值也降低，且曲線波動(dòng)較大。而從表1中明顯可知，與未處理的OVT相比，不同加熱溫度下的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量之間均存在顯著性差異（p＜0.05），加熱破壞了OVT的二級(jí)結(jié)構(gòu)[10]。加熱后α-螺旋含量降低，β-折疊含量增加，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲發(fā)生不同程度的變化，進(jìn)一步證實(shí)了OVT受熱不穩(wěn)定[11]。

OVA熱處理前后二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，如圖2B所示。從未處理OVA的CD圖中可看出，OVA具有典型α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)。表1顯示，與未加熱蛋白相比，100 ℃下加熱不同時(shí)間，α-螺旋向其他二級(jí)結(jié)構(gòu)形式轉(zhuǎn)化；隨時(shí)間的延長(zhǎng)α-螺旋含量逐漸下降，但β-折疊的含量并無(wú)顯著差異（P＞0.05），25 min時(shí)無(wú)規(guī)卷曲含量最多，說(shuō)明此條件下蛋白質(zhì)分子最為無(wú)序。在80 ℃下加熱25 min，與未加熱OVA相比，無(wú)規(guī)卷曲含量略有下降，分子的有序性增加，這可能是因?yàn)闊崽幚硎固烊籓VA向更為穩(wěn)定的S型轉(zhuǎn)化[12]，使結(jié)構(gòu)變的更加穩(wěn)定和有序；但隨著加熱溫度的升高，達(dá)到并超過(guò)S-OVA的變性溫度86 ℃，分子逐漸由有序變得無(wú)序。

OVM熱處理前后二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化如圖2C所示。從表1中可知，80 ℃加熱25 min、100 ℃加熱20 min的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量與未加熱的差別較大，但當(dāng)條件達(dá)到100 ℃加熱25 min時(shí)，結(jié)構(gòu)含量又與未加工OVM相似，說(shuō)明加熱對(duì)OVM二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變是可逆的，OVM耐熱性較強(qiáng)。

從圖2D中可明顯看出未加熱Lys存在典型的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)，說(shuō)明Lys為α+β型蛋白質(zhì)。表1顯示，與未加熱Lys相比，加熱均會(huì)使其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化（p＜0.05），α-螺旋和β-折疊含量降低，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲含量升高。在100 ℃下，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，α-螺旋和β-折疊比例先升高后降低，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲先降低后升高；而在相同加熱時(shí)間下，除了α-螺旋的含量外，80、90 ℃的處理并沒(méi)有造成其他二級(jí)結(jié)構(gòu)含量有顯著差異（p＜0.05）。加熱能不同程度地改變Lys的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中100 ℃加熱25 min時(shí)變化最大，無(wú)規(guī)卷曲含量最高，二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞的程度最大。

2.3 雞蛋主要過(guò)敏原熱加工后的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化

圖3 不同加熱條件下4 種雞蛋過(guò)敏原的UV-Vis光譜圖Fig. 3 UV-Vis spectra of four egg white allergens subjected to different heating conditions

從圖3A中可看出，未加熱OVT的UV-Vis光譜在280 nm左右有特征吸收峰，主要是由其肽鏈上色氨酸（tryptophan，Trp）和酪氨酸（tyrosine，Tyr）殘基的芳雜環(huán)π→π*躍遷引起的[13]。隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)和加熱溫度的升高，OVT的UV最大吸收峰的吸光度逐漸升高，OVT分子逐漸展開(kāi)，使得Trp和Tyr殘基暴露在蛋白質(zhì)分子表面。但值得注意的是，加熱15 min和20 min的結(jié)果基本無(wú)差別，表明當(dāng)OVT結(jié)構(gòu)展開(kāi)到一定程度后，從15 min到20 min的時(shí)間間隔并不影響其展開(kāi)，當(dāng)繼續(xù)加熱至25 min時(shí)，結(jié)構(gòu)進(jìn)一步展開(kāi)。因此，OVT結(jié)構(gòu)的展開(kāi)程度與加熱程度有關(guān)。

從圖3B中可看出，OVA的UV-Vis光譜圖在280 nm處有特征吸收峰，與未加熱樣品相比，加熱后最大吸收峰的吸光度降低。在100 ℃下，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，最大吸收峰的吸光度先降低，超過(guò)15 min后又略微升高，但變化幅度并不大。加熱時(shí)間相同，UV最大吸收峰的吸光度隨溫度的升高而呈現(xiàn)極顯著性降低（p＜0.01），80 ℃時(shí)天然構(gòu)象逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镾-構(gòu)象，因?yàn)橛行虻亩?jí)結(jié)構(gòu)增多，具有UV吸收的芳香族氨基酸殘基部分由分子表面被包埋至分子內(nèi)部；而隨著溫度升高到90 ℃甚至100 ℃，S-OVA變性，蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，可能掩蓋了部分暴露于分子表面的Trp和Tyr殘基，使得吸光度大幅度降低。

OVM的UV-Vis光譜如圖3C所示，在280 nm處出現(xiàn)特征吸收峰。加熱后的樣品在280 nm波長(zhǎng)處特征峰的吸光度均增加，但持續(xù)加熱后，吸光度略升高后又有所降低，說(shuō)明加熱使分子展開(kāi)，后又發(fā)生部分聚集；同樣加熱25 min，90 ℃和100 ℃的條件對(duì)樣品沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），但比80 ℃更能引起三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，使芳香族殘基暴露于分子表面。

從圖3D中可看出，在280 nm處出現(xiàn)特征吸收峰。加熱后Lys的最大吸收峰的吸光度比未加熱的大，表明加熱會(huì)使其結(jié)構(gòu)展開(kāi)。但是100 ℃加熱15 min其吸光度與未加熱基本相同，而繼續(xù)加熱至20 min，吸光度又升高，然后25 min后又略降低；80 ℃和90 ℃加熱25 min后樣品的吸光度都升高，且?guī)缀跬耆睾希?dāng)升高到100 ℃時(shí)，吸光度下降，表明加熱使其結(jié)構(gòu)展開(kāi)，后又發(fā)生部分聚集，造成Trp和Tyr殘基的部分包埋。

2.4 雞蛋主要過(guò)敏原熱加工后的疏水性變化

疏水基團(tuán)的相互作用是維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)最重要的作用力之一，ANS作為一種有效的熒光探針，通過(guò)非共價(jià)結(jié)合到蛋白質(zhì)分子的非極性區(qū)域中，這時(shí)熒光光譜會(huì)隨著所處環(huán)境非極性的增加而發(fā)生藍(lán)移，且熒光強(qiáng)度也會(huì)隨之提高[14]。利用ANS這個(gè)性質(zhì)，可以衡量與ANS結(jié)合的蛋白質(zhì)部位的極性變化，ANS與蛋白質(zhì)結(jié)合的熒光強(qiáng)度與蛋白的表面疏水性呈正相關(guān)[15]，本研究利用ANS熒光探針檢測(cè)OVT、OVA、OVM、Lys加熱處理前后蛋白表面疏水性的差異。

圖 4 不同加熱條件下4 種雞蛋過(guò)敏原的外源性熒光光譜圖Fig. 4 Extrinsic fl uorescent spectra of four egg white allergens subjected to different heating conditions

如圖4A所示，與未加熱相比，加熱后OVT的熒光強(qiáng)度極顯著增加（p＜0.01），且隨著加熱溫度的升高和加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度逐漸增加，但100 ℃加熱15 min和20 min的光譜曲線幾乎重合，并沒(méi)有明顯變化（P＞0.05），這與UV-Vis光譜趨勢(shì)一致。加熱處理后樣品的最大熒光強(qiáng)度峰值所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)（λmax）發(fā)生了不同程度的藍(lán)移，這表明溶液中OVT周圍微環(huán)境的極性發(fā)生了變化。加熱可能破壞了OVT的三級(jí)結(jié)構(gòu)，隨加熱程度的增加，蛋白分子由折疊逐漸展開(kāi)，暴露出原本包埋在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)，表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)。

圖4B中，與未加工OVA相比，加熱后的熒光強(qiáng)度極顯著增加（p＜0.01），λmax發(fā)生了不同程度的藍(lán)移。隨時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度的變化無(wú)明顯規(guī)律。相同加熱時(shí)間下，80 ℃比90 ℃和100 ℃所引起熒光強(qiáng)度變化更大，這可能是因?yàn)榧訜崾沟梅肿觾?nèi)部振動(dòng)增強(qiáng)，維系蛋白空間結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵遭到破壞，導(dǎo)致分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露；而更高的加熱溫度使分子發(fā)生聚集，有可能包埋了一部分疏水基團(tuán)，使得熒光強(qiáng)度比80 ℃時(shí)降低。

OVM加熱前后的外源性熒光光譜圖如圖4C所示，與未加熱樣品相比，加熱后的OVM的熒光強(qiáng)度增加，這表明加熱使蛋白分子展開(kāi)，暴露出分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)。100 ℃下，加熱10 min時(shí)熒光強(qiáng)度變化最大，而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度又有所降低，但15 min與25 min熱處理后蛋白的光譜圖并無(wú)明顯差別（P＞0.05），且與天然OVM相近；同樣地，80 ℃加熱后熒光強(qiáng)度變化最大，隨著溫度的升高，熒光強(qiáng)度又有所降低，且90 ℃和100 ℃所引起的圖譜變化并無(wú)顯著區(qū)別（P＞0.05），這表明熱處理達(dá)到一定的強(qiáng)度時(shí)，蛋白分子可能發(fā)生聚集，暴露出的部分疏水基團(tuán)被掩埋。

從溶菌酶加熱前后的外源性熒光光譜圖（圖4D）中可看出，加熱后樣品的熒光強(qiáng)度增加，且λmax發(fā)生了不同程度的藍(lán)移，這表明加熱使溶菌酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，分子變得松散，內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露。一般情況下，隨著溫度的升高和加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，Lys的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，表面疏水性越大。

3 討 論

3.1 熱加工對(duì)OVT結(jié)構(gòu)的影響

Tong Ping等[10]研究加熱對(duì)OVT的結(jié)構(gòu)及致敏性的影響，發(fā)現(xiàn)加熱溫度高于80 ℃時(shí)，其致敏性顯著降低，二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，且UV吸光度和外源性熒光強(qiáng)度隨著加熱處理的溫度或者處理時(shí)間而增加，二硫鍵斷裂和重排。本研究通過(guò)3 種光譜學(xué)技術(shù)對(duì)OVT加熱前后的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)加熱前后在空間結(jié)構(gòu)上存在較大差異，與Tong Ping等[10]研究結(jié)果基本一致。OVT具有典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)，且不耐受高溫，加熱能破壞其二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)由有序變?yōu)闊o(wú)序；且隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的升高，其三級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，結(jié)構(gòu)變得松散，暴露出生色基團(tuán)[16]，表面疏水性增大。

3.2 熱加工對(duì)OVA結(jié)構(gòu)的影響

OVA是一種熱不穩(wěn)定性蛋白[17-18]，熱加工過(guò)程中，其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的變化。Kato等[19]在早年的研究中表明蛋清熱處理會(huì)造成OVA結(jié)構(gòu)的改變，使OVA分子內(nèi)α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角向β-折疊轉(zhuǎn)化，分子間β-折疊結(jié)構(gòu)的交聯(lián)使分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露出疏水基團(tuán)，進(jìn)而產(chǎn)生聚合物。本研究表明，OVA經(jīng)熱加工后，α-螺旋含量顯著降低（p＜0.05），β-折疊及β-轉(zhuǎn)角含量均有所增加，與Kato等[19]研究的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化有所不同，很可能是因?yàn)槿扒逯械钠渌鞍壮煞謺?huì)對(duì)OVA結(jié)構(gòu)的變化造成影響；另外，輕微加熱使OVA分子展開(kāi)，分子表面的芳香氨基酸殘基被包埋，使吸光度減小，而分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來(lái)，表面疏水性增強(qiáng)；加熱程度的增加又使分子發(fā)生聚集，表面疏水性降低。相同加熱時(shí)間下，80 ℃時(shí)無(wú)規(guī)卷曲含量有所降低，為結(jié)構(gòu)變化界限的溫度，可能與OVA分子由天然構(gòu)象向更加穩(wěn)定的S型轉(zhuǎn)化有關(guān)。張銀等[20]也表明，加熱時(shí)OVA分子的展開(kāi)一方面暴露出疏水殘基而趨于聚合，一方面掩藏在分子內(nèi)部的表位暴露出來(lái)，二者的相互作用使抗原性隨加熱的溫度和時(shí)間不斷變化；而當(dāng)加熱溫度超過(guò)80 ℃以上，OVA分子充分伸展，暴露的巰基基團(tuán)使分子間形成二硫鍵，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子間相互作用而產(chǎn)生大量聚合物，表面疏水性的降低，這一點(diǎn)與本研究結(jié)果一致，同時(shí)其抗原性也大幅度降低。Golias等[21]也已證實(shí)加熱引起OVA的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，能夠改變其消化性和抗原表位的構(gòu)象，最終導(dǎo)致其致敏性的降低。

3.3 熱加工對(duì)OVM結(jié)構(gòu)的影響

OVM具有3 個(gè)由二硫鍵連接的穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域[22]，使它對(duì)熱處理及胰蛋白酶酶解都相當(dāng)穩(wěn)定[23]，而且去除OVM的蛋清致敏性比全蛋清低[24]，所以O(shè)VM是蛋清中致敏性最強(qiáng)的蛋白質(zhì)[25]。在本研究設(shè)置的熱加工過(guò)程中，OVM二級(jí)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，且二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化存在可逆性。與未加工OVM相比，輕微加熱使蛋白分子展開(kāi)，芳香族氨基酸殘基暴露于分子表面；但持續(xù)加熱后，吸光度又略有降低，且疏水基團(tuán)暴露，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，后隨加熱強(qiáng)度的增加又有降低的趨勢(shì)，有可能加熱程度的增加使分子部分聚集。史曉霞[26]研究發(fā)現(xiàn)，OVM經(jīng)熱處理后，其過(guò)敏原性逐漸降低，且加熱影響OVM分子內(nèi)部的電荷分布及氨基酸殘基結(jié)合的牢固程度，致使其二級(jí)結(jié)構(gòu)相互轉(zhuǎn)化，分子有序性降低，具有UV吸收的氨基酸殘基暴露于分子表面，表面疏水性隨加熱溫度的升高而降低。此結(jié)果與本研究略有不同，可能是因?yàn)樘崛VM所用方法不同，導(dǎo)致加熱對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響不同。此外，Rupa等[27]研究表明加熱導(dǎo)致的OVM構(gòu)象的變化也會(huì)影響CD4+細(xì)胞的分化激活和細(xì)胞因子的釋放，使其致敏性降低。

3.4 熱加工對(duì)Lys結(jié)構(gòu)的影響

雞蛋Lys是一種對(duì)熱不穩(wěn)定的球狀蛋白[28-29]，Sassi等[30]研究表明，Lys在22～92 ℃范圍內(nèi)會(huì)因分子間相互作用而使其二級(jí)結(jié)構(gòu)局部或全部重排。本研究發(fā)現(xiàn)，加熱處理使Lys的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)含量降低，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲含量增加，Lys有序結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o(wú)序。隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的升高，蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)暴露，表面疏水性逐漸增大；而吸光度先升高后降低，則可能是深程度的熱處理使分子結(jié)構(gòu)重排，部分蛋白聚集，掩埋了部分芳香族氨基酸。

4 結(jié) 論

經(jīng)加熱處理后，雞蛋中4 種主要過(guò)敏原的結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的變化。熱處理使OVT的二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞；隨時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的升高，OVT分子逐漸展開(kāi)，芳香族殘基和疏水基團(tuán)暴露于分子表面。輕微加熱時(shí)，OVA分子轉(zhuǎn)化為更為穩(wěn)定的S-OVA，二級(jí)結(jié)構(gòu)更加有序，芳香族殘基被包埋至分子內(nèi)部，表面疏水性增大；隨著加熱程度的增大，OVA二級(jí)結(jié)構(gòu)由有序到無(wú)序，分子發(fā)生聚集，芳香族殘基和疏水性基團(tuán)被掩埋。OVM的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)熱較為穩(wěn)定；輕微加熱其分子展開(kāi)，吸光度和熒光強(qiáng)度增大，繼續(xù)加熱使蛋白分子部分聚集，包埋了部分芳香族氨基酸殘基和疏水基團(tuán)。Lys為球狀蛋白，熱處理使其球狀鏈結(jié)構(gòu)展開(kāi)，有序性下降，芳香族殘基和疏水基團(tuán)逐漸暴露，但隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的升高，蛋白分子發(fā)生部分聚集。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為后續(xù)研究加熱對(duì)雞蛋過(guò)敏原致敏性的影響提供理論依據(jù)。

[1] 關(guān)蘊(yùn)良, 杜劍云. 試論雞蛋的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[J]. 中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng)(下旬刊),2012, 22(12): 5509. DOI:10.969/j.issn.1004-7484(x).2012.12.770.

[2] HEINE R G, LASKE N, HILL D J. The diagnosis and management of egg allergy[J]. Current Allergy and Asthma Reports, 2006, 6(2): 145-152.

[3] JACOBSEN B, HOFFMANN-SOMMERGRUBER K, HAVE T T, et al. The panel of egg allergens, Gal d1-Gal d5: their improved purification and characterization[J]. Molecular Nutrition and Food Research, 2008, 52(Suppl 1): 176-185. DOI:10.1002/mnfr.200700414.

[4] GOMAA A, BOYE J. Impact of irradiation and thermal processing on the immunochemical detection of milk and egg allergens in foods[J].Food Research International, 2015, 74: 275-283. DOI:10.1016/j.foodres.2015.05.023.

[5] CLAUDE M, LUPI R, BOUCHAUD G, et al. The thermal aggregation of ovalbumin as large particles decreases its allergenicity for egg allergic patients and in a murine model[J]. Food Chemistry, 2016, 203:136-144. DOI:10.1016/j.foodchem.2016.02.054.

[6] RAHAMAN T, VASILJEVIC T, RAMCHANDRAN L. Effect of processing on conformational changes of food proteins related to allergenicity[J]. Trends in Food Science & Technology, 2016, 49: 24-34. DOI:10.1016/j.tifs.2016.01.001.

[7] 張婉舒. 光譜法解析人乳β-酪蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及其對(duì)脂肪球膜結(jié)構(gòu)的影響[D]. 哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014: 2-5.

[8] CHAKRABORTY A, BASAK S. pH-Induced structural transitions of caseins[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology,2007, 87(3): 191-199. DOI:10.1016/j.jphotobiol.2007.04.004.

[9] 周煌. 雞蛋清過(guò)敏原卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制[D].南昌: 南昌大學(xué), 2014: 13-27.

[10] TONG Ping, GAO Jinyan, CHEN Hongbing, et al. Effect of heat treatment on the potential allergenicity and conformational structure of egg allergen ovotransferrin[J]. Food Chemistry, 2012, 131(2): 603-610. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.08.084.

[11] 袁小軍, 馬美湖. 禽蛋中卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的研究進(jìn)展[J]. 家禽科學(xué),2009(5): 40-44.

[12] 黃群, 馬美湖, 蔡朝霞, 等. S-構(gòu)型轉(zhuǎn)化對(duì)卵白蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響[J].光譜學(xué)與光譜分析, 2011, 31(12): 3319-3322. DOI:10.3964/j.is sn.1000-0593(2011)12-3319-04.

[13] 潘明喆, 李斌, 孟憲軍. 木糖醇對(duì)大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)和起泡特性的影響[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(15): 63-68. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615011.

[14] 尹燕霞, 向本瓊, 佟麗. 熒光光譜法在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用[J]. 實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理, 2010, 27(2): 33-36; 40.

[15] 陳蓁蓁, 張寧, 張文申, 等. 蛋白質(zhì)分子熒光探針研究及其應(yīng)用新進(jìn)展[J]. 分析化學(xué), 2006, 34(9): 1341-1347.

[16] 袁小軍. 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及體外抗菌研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011: 61-77.

[17] JOO K, KATO Y. Assessment of allergenic activity of a heatcoagulated ovalbumin after in vivo digestion[J]. Bioscience Biotechnology Biochemistry, 2006, 70(3): 591-597. DOI:10.1271/bbb.70.591.

[18] MARTOS G, LOPEZ-EXPOSITO I, BENCHARITIWONG R, et al.Mechanisms underlying differential food allergy response to heated egg[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2011, 127(4):990-997. DOI:10.1016/j.jaci.2011.01.057.

[19] KATO A, TAKAGI T. Formation of intermolecular beta-sheet structure during heat denaturation of ovalbumin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1988, 36(6): 1156-1159.DOI:10.1021/jf00084a007.

[20] 張銀, 佟平, 麻小娟, 等. 熱加工及超高壓處理對(duì)卵白蛋白抗原性的影響[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(19): 250-253.

[21] GOLIAS J, SCHWARZER M, WALLNER M, et al. Heat-induced structural changes affect OVA-antigen processing and reduce allergic response in mouse model of food allergy[J]. PLoS ONE, 2012, 7:e37156. DOI:10.1371/journal.pone.0037156.

[22] DJURTOFT R, PEDERSEN H S, AABIN B, et al. Studies of food allergens: soybean and egg proteins[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology, 1991, 289: 281-293.

[23] FUJIMURA Y, TACHIBANA H, ETO N, et al. Antigen binding of an ovomucoid specific antibody is affected by a carbohydrate chain located on the light chain variable region[J]. Bioscience Biotechnology Biochemistry, 2000, 64(11): 2298-2305. DOI:10.1271/bbb.64.2298.

[24] URISU A, ANDO H, MORITA Y, et al. Allergenic activity of heated and ovomucoid-depleted egg white[J]. Journal of Allergy of Clinical Immunology, 1997, 100(2): 171-176. DOI:10.1016/S0091-6749(97)70220-3.

[25] BARTNIKAS L M, SHEEHAN W J, PHIPATANAKUL W.Ovomucoid is not superior to egg white testing in predicting tolerance to baked egg[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology: in Practice, 2013, 1: 354-360. DOI:10.1016/j.jaip.2013.04.002.

[26] 史曉霞. 蛋清卵類粘蛋白分離純化、結(jié)構(gòu)表征及其過(guò)敏原性的研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012: 43-48.

[27] RUPA P, ACHNARR L, MINE Y. Effect of heat denaturation of egg white proteins ovalbumin and ovomucoid on CD4+T cell cytokine production and human mast cell histamine production[J]. Journal of Functional Foods, 2015, 18: 28-34. DOI:10.1016/j.jff.2015.06.030.

[28] 趙龍飛, 徐亞軍. 雞蛋清中溶菌酶的應(yīng)用性研究[J]. 食品工業(yè), 2006,27(3): 19-20.

[29] 王晶. 雞蛋貯藏期間三種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的變化研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012: 43-45.

[30] SASSI P, GIUGLIARELLI A, PAOLANTONI M, et al. Unfolding and aggregation of lysozyme: a thermodynamic and kinetic study by FTIR spectroscopy[J]. Biophysical Chemistry, 2011, 158(1): 46-53.DOI:10.1016/j.bpc.2011.05.002.

Effect of Thermal Processing on Structure of Four Major Egg White Allergens

LIU Ke1,2, XIONG Liji1,2, GAO Jinyan2, CHEN Hongbing1,3, TONG Ping1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China;2. School of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China;3. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

In order to explore the impact of thermal processing on the structure of egg white allergens, four major allergens in hen’s egg white were heated under different conditions of temperature and time. Circular dichroism, ultraviolet and fluorescence spectroscopy were used to detect the spatial structure of allergens. Results showed that ovotransferrin was unstable to heat, and its molecular structure was unfolded, with the aromatic residues and hydrophobic groups exposed on the molecular surface after heating. The secondary structure of ovalbumin became more ordered, ultraviolet absorbance value decreased, and surface hydrophobicity increased when it was heated slightly; however, with increasing temperature and heating time, ovalbumin became unordered and aggregated. The secondary structure of ovomucoid was relatively stable, and its molecules were unfolded after mild heating, leading to increased absorption and fl uorescence intensities, and then aggregated partly after further heating. The secondary structure of lysozyme became disordered with the aromatic residues and hydrophobic groups gradually exposed after heating, but with increasing degree of heating, part of lysozyme became aggregated. The present study may provide a theoretical basis for studying the effect of heating on the allergenicity of egg allergens.

thermal processing; egg white allergens; spectral analysis; structure

10.7506/spkx1002-6630-201723009

TS201.2

A

1002-6630（2017）23-0051-08

劉珂, 熊麗姬, 高金燕, 等. 熱加工對(duì)雞蛋中4 種主要過(guò)敏原結(jié)構(gòu)的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(23): 51-58.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723009. http://www.spkx.net.cn

LIU Ke, XIONG Liji, GAO Jinyan, et al. Effect of thermal processing on structure of four major egg white allergens[J]. Food Science,2017, 38(23): 51-58. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723009. http://www.spkx.net.cn

2016-09-28

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA102205）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301524）；江西省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（20161BBG70062）；江西省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（20133ACB20009）；食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（SKLF-ZZA-201612；SKLF-QN-201514）

劉珂（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：liuke0916@163.com

*通信作者：佟平（1984—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：tongping@ncu.edu.cn