何莉媛，吳 偉，吳曉娟，付旭恒，林親錄

(中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004)

米糠貯藏時(shí)間對(duì)米糠蛋白體外胃蛋白酶消化性質(zhì)及其消化產(chǎn)物抗氧化性的影響

何莉媛，吳 偉，吳曉娟，付旭恒，林親錄

(中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004)

米糠貯藏；米糠蛋白；蛋白質(zhì)氧化；體外消化；抗氧化性

米糠是稻米加工的副產(chǎn)物，我國(guó)米糠年產(chǎn)量在1 000萬t以上，米糠營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，其中蛋白質(zhì)含量14%～20%[1]。米糠蛋白擁有過敏性低、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、功能性質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)，是食品工業(yè)中極有潛力的蛋白質(zhì)資源[2]。米糠富含脂質(zhì)和活性較強(qiáng)的脂肪水解酶和脂肪氧化酶，在糙米碾白過程中，米糠脂質(zhì)在脂肪水解酶的作用下快速形成游離脂肪酸，使得米糠酸值迅速升高[3]。在貯藏和運(yùn)輸過程中，米糠內(nèi)源脂肪氧合酶催化游離脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致米糠氧化酸敗[4]。米糠氧化酸敗產(chǎn)物具有較強(qiáng)的生物活性，能夠誘導(dǎo)米糠蛋白氧化，改變米糠蛋白的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)[5-6]。因此，米糠在綜合利用之前需要進(jìn)行及時(shí)有效的穩(wěn)定化處理，但米糠穩(wěn)定化設(shè)備投資較高，而我國(guó)稻米加工企業(yè)分布較為分散，且大部分產(chǎn)能和投資較低，無法及時(shí)有效地對(duì)米糠進(jìn)行穩(wěn)定化處理，大部分米糠在穩(wěn)定化之前已經(jīng)發(fā)生了不同程度的酸敗，其中米糠蛋白也發(fā)生了不同程度的氧化[5-7]。

蛋白質(zhì)氧化是蛋白質(zhì)分子在活性氧或次生氧化產(chǎn)物作用下發(fā)生的共價(jià)結(jié)構(gòu)修飾[7]。蛋白質(zhì)氧化不僅改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而且影響其功能性質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[8]。大量研究表明蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)受氧化影響的程度與蛋白質(zhì)氧化環(huán)境[9]、氧化程度[10]以及氧化蛋白質(zhì)的種類[11]有關(guān)，并且大多數(shù)研究圍繞肉類蛋白[8]和大豆蛋白[12-15]展開，鮮有研究關(guān)注米糠酸敗引起的蛋白質(zhì)氧化對(duì)米糠蛋白營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響。本文以新鮮米糠為原料，在一定條件下貯藏不同時(shí)間得到不同酸敗程度的米糠，穩(wěn)定化和脫脂后制備米糠蛋白，研究米糠貯藏時(shí)間對(duì)米糠蛋白體外胃蛋白酶消化性質(zhì)及其消化產(chǎn)物抗氧化性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮米糠：湖南糧食集團(tuán)有限責(zé)任公司；胃蛋白酶(800 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)：Biosharp公司；1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、高硫酸鉀、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：美國(guó) Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純。

Sorvall LYNX 6000高速落地離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher公司；DSI Z-300A水浴恒溫振蕩器；BlueStar紫外可見分光光度計(jì)；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)IKA公司；FMHE36-24雙螺桿擠壓機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 米糠預(yù)處理

參考蔡勇建[7]米糠預(yù)處理方法。以新鮮米糠為原料粉碎過40目篩，在室溫下分別貯藏0、1、3、5、10 d得到不同酸敗程度的米糠，采用雙螺桿擠壓機(jī)穩(wěn)定化處理，穩(wěn)定化條件：喂料量15 kg/h，水分含量16%，雙螺桿擠壓機(jī)二區(qū)至六區(qū)溫度依次為70、120、120、70、60℃；隨后干燥、粉碎過40目篩備用。室溫條件下將不同貯藏時(shí)間米糠與正己烷按1∶4料液比混合脫脂，振蕩30 min后抽濾得到濾餅，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正己烷，收集米糠毛油，濾餅重復(fù)脫脂3次。將濾餅置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干后得脫脂米糠。米糠毛油酸值測(cè)定參考GB/T 5530—2005，過氧化值測(cè)定參考GB/T 5538—2005。

1.2.2 米糠蛋白的制備

參考蔡勇建[7]制備米糠蛋白方法。將脫脂米糠與去離子水以1∶10混合，40℃下用2 mol/L NaOH將pH調(diào)節(jié)至9.0，攪拌4 h后將懸浮液在4℃條件下8 000 r/min離心20 min，上清液用2 mol/L HCl調(diào)pH至4.0，靜置30 min后在4℃條件下8 000 r/min離心15 min，水洗沉淀3次后分散于去離子水中，并用2 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，冷凍干燥得到米糠蛋白。

1.2.3 米糠蛋白體外胃蛋白酶消化程度的測(cè)定

參考Chen等[13]的方法。將米糠蛋白溶解于去離子水中配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的米糠蛋白溶液，用2 mol/L HCl調(diào)pH 2.0，加入4 U/mg胃蛋白酶，37℃下保溫酶解90 min，隨后沸水浴5 min終止消化，10 000 r/min離心10 min后取上清液，取部分上清液用凱氏定氮法測(cè)定氮含量，剩余上清液配制0.6 mg/mL的待測(cè)液，用于測(cè)定米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產(chǎn)物的抗氧化性。

1.2.4 米糠蛋白體外胃蛋白酶消化進(jìn)程的測(cè)定

參考Bax等[9]的方法。將米糠蛋白溶解于去離子水中配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的米糠蛋白溶液，用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH 2.0，加入4 U/mg胃蛋白酶，37℃下保溫酶解，分別在酶解0、5、10、20、30、40、60、90 min后加入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的三氯乙酸終止反應(yīng)，冰浴1 h后4℃下8 000 r/min離心15 min，取上清液在280 nm處測(cè)定吸光值。

1.2.5 米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產(chǎn)物抗氧化性的測(cè)定

2 結(jié)果與討論

2.1 米糠貯藏時(shí)間對(duì)米糠毛油酸值、過氧化值以及米糠蛋白體外胃蛋白酶消化率的影響(見表1)

表1 米糠貯藏不同時(shí)間米糠毛油的酸值、過氧化值以及米糠蛋白體外胃蛋白酶消化率

注：數(shù)值為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”，同一列肩標(biāo)中不同字母表示在5%水平上差異顯著，下同。

由表1可知，隨著新鮮米糠貯藏時(shí)間延長(zhǎng)到10 d，米糠毛油的酸值(KOH)和過氧化值分別從4.31 mg/g和1.42 mmol/kg增加到38.72 mg/g和7.79 mmol/kg，表明米糠貯藏期間米糠脂質(zhì)發(fā)生了水解酸敗和氧化酸敗。蔡勇建[7]在相同條件下貯藏新鮮米糠，發(fā)現(xiàn)米糠貯藏時(shí)間由0 d延長(zhǎng)到10 d時(shí)，米糠蛋白羰基含量從2.12 nmol/mg增至13.80 nmol/mg，表明米糠酸敗氧化產(chǎn)物導(dǎo)致米糠蛋白氧化。隨著新鮮米糠貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，米糠蛋白在體外胃蛋白酶作用下的消化率先上升后下降，在米糠貯藏3 d時(shí)達(dá)到最大值，為39.73%，較新鮮米糠蛋白增加了30.65%，米糠貯藏10 d時(shí)的體外胃蛋白酶消化率已顯著低于新鮮米糠(Plt;0.05)。Zhou等[10]研究氧化亞油酸濃度對(duì)豬肌原纖維蛋白體外消化率影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，低濃度亞油酸導(dǎo)致豬肌原纖維蛋白胃蛋白酶消化率上升，高濃度亞油酸使得豬肌原纖維蛋白胃蛋白酶消化率下降，并認(rèn)為蛋白質(zhì)適度氧化可使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的胃蛋白酶作用位點(diǎn)，促進(jìn)胃蛋白酶消化；蛋白質(zhì)過度氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，使得胃蛋白酶的作用位點(diǎn)減少，抑制胃蛋白酶消化。Chen等[12]研究丙二醛氧化修飾對(duì)大豆分離蛋白體外消化率影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，丙二醛氧化大豆分離蛋白形成的聚集體是導(dǎo)致氧化大豆分離蛋白體外消化率下降的原因。研究[5,7]發(fā)現(xiàn)新鮮米糠較長(zhǎng)時(shí)間的貯藏(5 d和10 d)可導(dǎo)致米糠蛋白形成氧化聚集體，米糠蛋白氧化聚集體主要由二硫鍵結(jié)合，少量非二硫鍵的共價(jià)鍵也參與米糠蛋白氧化聚集體的形成。由此可見，在新鮮米糠貯藏的前期，米糠酸敗程度和米糠蛋白氧化程度都較低，適度氧化導(dǎo)致米糠蛋白結(jié)構(gòu)展開，有利于胃蛋白酶酶解；在米糠貯藏的后期(5 d和10 d)，米糠酸敗程度和米糠蛋白氧化程度都較高，米糠蛋白氧化形成的共價(jià)交聯(lián)氧化聚集體使得胃蛋白酶作用位點(diǎn)減少，從而抑制胃蛋白酶的酶解。

2.2 米糠貯藏時(shí)間對(duì)米糠蛋白體外胃蛋白酶消化進(jìn)程的影響(見圖1)

圖1 米糠貯藏時(shí)間對(duì)米糠蛋白體外胃蛋白酶消化進(jìn)程的影響

由圖1可知，米糠蛋白體外模擬消化進(jìn)程中，OD280變化趨勢(shì)與Bax等[9]研究氧化豬肌原纖維蛋白體外胃蛋白酶模擬消化進(jìn)程變化趨勢(shì)相似。為了更好地表征胃蛋白酶消化進(jìn)程，引入擬合指數(shù)曲線方程：

1/OD=1/ODmax×eβ(1/t)

式中：ODmax為消化完全時(shí)穩(wěn)定的最大OD；β為描述曲線形狀的系數(shù)。

參考Bax等[9]研究，引入半衰期(t1/2)表征達(dá)到0.5倍ODmax所需的消化時(shí)間，半衰期由方程推導(dǎo)而得：

t1/2=β/ln2

以半衰期對(duì)應(yīng)的OD280計(jì)算初始消化速率。以米糠貯藏10 d為例，擬合曲線如圖2所示，不同貯藏時(shí)間下的擬合曲線參數(shù)見表2。

圖2 貯藏10 d時(shí)米糠蛋白體外胃蛋白酶消化擬合曲線

貯藏時(shí)間/d1/ODmaxODmaxβt1/2/minR204．580．21814．3420．690．9614．270．23413．9620．140．9733．690．27113．3419．250．9854．680．21414．1220．370．99106．750．14814．7021．210．99

由表2可知，隨著米糠貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，ODmax的變化趨勢(shì)與消化率一致，最大值出現(xiàn)在新鮮米糠貯藏3 d。半衰期隨米糠貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)先下降后上升，且大致位于20 min左右，與Bax等[9]研究胃蛋白酶消化進(jìn)程的半衰期落在20 min左右結(jié)果相似。

米糠貯藏時(shí)間對(duì)米糠蛋白體外胃蛋白酶初始消化速率的影響如圖3所示。

注：圖中不同字母表示在Plt;0.05水平上差異顯著。

圖3米糠貯藏時(shí)間對(duì)米糠蛋白體外胃蛋白酶初始消化速率的影響

由圖3可知，隨著米糠貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，米糠蛋白初始消化速率先增大后減小。在米糠貯藏初期，半衰期逐漸減小，初始消化速率逐漸增大，兩者均在米糠貯藏3 d時(shí)達(dá)到極值，分別為19.25 min和0.381 h-1。Bax等[9]研究熱處理對(duì)豬肌原纖維蛋白體外胃蛋白酶消化進(jìn)程的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著熱處理溫度的升高，豬肌原纖維蛋白氧化程度增加，豬肌原纖維蛋白在胃蛋白酶中的初始消化速率先增大后減小，當(dāng)熱處理溫度超過100℃時(shí)，初始消化速率、半衰期和ODmax逐漸趨于穩(wěn)定，并認(rèn)為適度熱處理引發(fā)的適度氧化使得蛋白質(zhì)暴露出更多的疏水區(qū)域，提高胃蛋白酶催化效率；過度熱處理引發(fā)的蛋白質(zhì)過度氧化可形成蛋白質(zhì)共價(jià)交聯(lián)聚集體，從而抑制胃蛋白酶的消化。在新鮮米糠貯藏的前期，米糠酸敗程度不高，米糠蛋白適度氧化后有利于暴露出更多的疏水區(qū)域，增加胃蛋白酶酶解位點(diǎn)，使得初始消化速率上升、半衰期下降，提高了胃蛋白酶酶解速率，促進(jìn)了米糠蛋白的消化；在米糠貯藏的后期(5 d和10 d)，米糠酸敗程度急劇增加，米糠蛋白劇烈氧化后形成大量的共價(jià)交聯(lián)氧化聚集體，掩蓋了米糠蛋白氧化初期暴露的胃蛋白酶位點(diǎn)，使初始消化速率下降、半衰期上升，從而減緩胃蛋白酶消化進(jìn)程，抑制了米糠蛋白的消化。

米糠貯藏時(shí)間對(duì)米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產(chǎn)物抗氧化性的影響見表3。

表3 米糠貯藏時(shí)間對(duì)米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產(chǎn)物抗氧化性的影響

由表3可知，隨著米糠貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，米糠蛋白在胃蛋白酶酶解90 min后產(chǎn)物的抗氧化性先上升后下降，并且各項(xiàng)抗氧化性指標(biāo)均在米糠貯藏3 d時(shí)最佳。Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)氧化可降低大豆分離蛋白體外消化產(chǎn)物的抗氧化性，并認(rèn)為氧化修飾形成蛋白質(zhì)氧化聚集體是造成大豆蛋白消化產(chǎn)物抗氧化性下降的原因。Zhou等[10]研究氧化亞油酸濃度對(duì)豬肌原纖維蛋白體外消化產(chǎn)物抗氧化性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著氧化亞油酸濃度增加，豬肌原纖維蛋白氧化程度加深，而豬肌原纖維蛋白體外消化產(chǎn)物自由基吸收能力先上升后下降，并認(rèn)為輕微氧化使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多抗氧化性好的氨基酸，有助于消化產(chǎn)物抗氧化性的提升；過度氧化不僅會(huì)造成蛋白質(zhì)形成共價(jià)聚集體，還會(huì)帶來氨基酸損失，尤其是擁有良好抗氧化性的氨基酸，從而極大降低消化產(chǎn)物的抗氧化性。由此可見，米糠貯藏期間，米糠蛋白消化產(chǎn)物抗氧化性的變化主要取決于米糠蛋白氧化后結(jié)構(gòu)的變化。在新鮮米糠貯藏的前期(1、3 d)，米糠酸敗程度較低，適度氧化導(dǎo)致米糠蛋白結(jié)構(gòu)展開，有利于胃蛋白酶消化產(chǎn)物抗氧化性的增加；在米糠貯藏的后期(5 d和10 d)，米糠酸敗程度較高，米糠蛋白氧化程度加深，進(jìn)一步形成共價(jià)交聯(lián)氧化聚集體，將適度氧化后米糠蛋白結(jié)構(gòu)展開的優(yōu)勢(shì)掩蓋，使得胃蛋白酶消化產(chǎn)物抗氧化性降低。

還原能力是評(píng)估抗氧化劑提供氫或電子的能力。在新鮮米糠貯藏期間，米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產(chǎn)物的還原能力先上升后下降，在米糠貯藏3 d時(shí)，還原能力達(dá)到最大值。在新鮮米糠貯藏的前期(1、3 d)，米糠酸敗程度較低，米糠蛋白適度氧化后結(jié)構(gòu)展開，提升了米糠蛋白提供電子的能力，有利于胃蛋白酶消化產(chǎn)物還原能力的增加；在米糠貯藏的后期(5 d和10 d)，米糠酸敗程度較高，米糠蛋白過度氧化后形成共價(jià)交聯(lián)氧化聚集體，使米糠蛋白提供電子的能力下降，從而降低米糠蛋白胃蛋白酶消化產(chǎn)物的還原能力。

3 結(jié) 論

將新鮮米糠在室溫下貯藏0、1、3、5、10 d，穩(wěn)定化和脫脂后得到不同酸敗程度的米糠，并以此制備不同氧化程度的米糠蛋白，通過體外胃蛋白酶消化，研究米糠貯藏時(shí)間對(duì)米糠蛋白消化性質(zhì)及消化產(chǎn)物抗氧化性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著米糠貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，米糠毛油酸值和過氧化值迅速升高，米糠蛋白的胃蛋白酶消化率、初始消化速率以及消化產(chǎn)物的抗氧化性都先上升后下降，且均在貯藏3 d時(shí)達(dá)到最佳。表明新鮮米糠的短期貯藏可一定程度上改善米糠蛋白的消化性質(zhì)和消化產(chǎn)物的抗氧化性，有助于米糠蛋白營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的提升；但長(zhǎng)期貯藏對(duì)米糠蛋白體外胃蛋白酶消化有顯著的負(fù)面影響，貯藏10 d后米糠蛋白體外胃蛋白酶消化率、初始消化速率以及消化產(chǎn)物的抗氧化性已顯著低于新鮮米糠，極大地降低了米糠蛋白的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和利用價(jià)值。

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Effectsofricebranstoragetimeoninvitropepsindigestibilityofricebranproteinandantioxidantactivityofricebranproteinhydrolysates

HE Liyuan, WU Wei, WU Xiaojuan, FU Xuheng, LIN Qinlu

(National Engineering Laboratory for Rice and By-Product Deep Processing, College of Food Science and Engineering, Center South University of Forestry and Technology, Changsha 410004，China)

rice bran storage; rice bran protein; protein oxidation; in vitro digestibility; antioxid-ant activity

TS210.9;TQ932

A

1003-7969(2017)11-0070-05

2017-02-02；

2017-07-20

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303071)；糧油深加工與品質(zhì)控制2011湖南省協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目(湘教通[2013]448號(hào))；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31771918)

何莉媛(1992)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榧Z油加工(E-mail)hly9271@163.com。

通信簡(jiǎn)介：吳 偉，副教授，博士(E-mail)foodwuwei@126.com。