劉偉偉，彭 妍，馬 歡，張 欣，陳祥松，姚建銘

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，合肥 230036； 2.淮南新能源研究中心，安徽 淮南 232000； 3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036)

不同來(lái)源脂肪酶催化餐廚廢油水解實(shí)驗(yàn)研究

劉偉偉1, 2，彭 妍1，馬 歡3，張 欣3，陳祥松2，姚建銘2

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，合肥 230036； 2.淮南新能源研究中心，安徽 淮南 232000； 3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036)

研究不同來(lái)源的脂肪酶催化餐廚廢油水解反應(yīng)制備脂肪酸，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察了酶用量對(duì)酶解率的影響，在此基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)水解工藝參數(shù)酶用量、水解溫度、油水比和水解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：豬胰脂肪酶L3621和假絲酵母脂肪酶LS20在適宜條件下均可實(shí)現(xiàn)餐廚廢油的高效酶催化水解；L3621最佳水解條件為酶用量700 U/g、水解溫度45℃、油水比1∶1.2、水解時(shí)間36 h，在此條件下酶解率達(dá)94.30%；LS20最佳水解條件為酶用量600 U/g、水解溫度40℃、油水比1∶1、水解時(shí)間36 h，在此條件下酶解率達(dá)96.84%。

脂肪酶；餐廚廢油；水解；生物柴油

餐廚廢油的非法收運(yùn)和加工是造成地溝油等食品安全及社會(huì)問(wèn)題的重要原因[1-2]。以高酸值的餐廚廢油為原料制備生物柴油[3-4]是將其無(wú)害化、高值利用的重要途徑。將餐廚廢油采用先酯化降酸、再進(jìn)行酯交換反應(yīng)的二步法工藝是生物柴油制備的傳統(tǒng)方法[5-6]，其中酯化和酯交換反應(yīng)通常采用強(qiáng)酸(如濃H2SO4)和強(qiáng)堿(如KOH)做均相催化劑，但其反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、溫度高、能耗大、設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，排放含酸、堿的廢水易造成環(huán)境污染[7]。

脂肪酶催化是簡(jiǎn)捷、經(jīng)濟(jì)的油脂水解方法[8-11]。脂肪酶催化油脂水解工藝具有反應(yīng)條件溫和、能耗低、產(chǎn)物分離純化簡(jiǎn)單、過(guò)程無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，且避免了其用于脂肪酸甲酯類生物柴油制備時(shí)存在的甲醇中毒的問(wèn)題[12]。因此，針對(duì)餐廚廢油等高酸值油脂，采用先脂肪酶催化水解、再進(jìn)行酯化反應(yīng)的新型“二步法”工藝[13]。

本研究采用不同來(lái)源的豬胰脂肪酶和假絲酵母脂肪酶進(jìn)行餐廚廢油的酶催化水解，并對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為其后續(xù)生物柴油制備工程化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

餐廚廢油，取自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)生食堂，在進(jìn)行餐廚廢棄物油脂分離過(guò)程中采集。預(yù)處理方法：過(guò)濾除去食物殘?jiān)捌渌蝗苄噪s質(zhì)，再于100～105℃烘箱內(nèi)烘干3～5 h，除去水分。初始酸值(KOH)12.22 mg/g、皂化值(KOH)197.19 mg/g，甘油酯含量93.80%。

豬胰脂肪酶L3621(酶活≥30 000 U/g)，購(gòu)自德國(guó)Ruibio公司；假絲酵母脂肪酶LS20(酶活≥200 000 U/g)，購(gòu)自北京凱泰新世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；十二烷基苯磺酸鈉、氫氧化鉀、無(wú)水乙醇、乙醚、吐溫-80等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-82型氣浴恒溫振蕩器， FA2004B型電子分析天平， DHG-9243S-III型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 餐廚廢油的水解

在100 mL三角瓶中加入20 g經(jīng)預(yù)處理的餐廚廢油，加入5%吐溫-80乳化，再加入實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)比例的不同來(lái)源脂肪酶、蒸餾水，置于氣浴恒溫振蕩器中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速120 r/min，于不同實(shí)驗(yàn)設(shè)定溫度下反應(yīng)，定時(shí)取樣測(cè)定酸值。

1.2.2 皂化值和酸值測(cè)定

餐廚廢油皂化值測(cè)定采用GB/T 5534—2008《動(dòng)植物油脂 皂化值的測(cè)定》的方法；酸值測(cè)定采用GB/T 5530—2005《動(dòng)植物油脂 酸值和酸度的測(cè)定》的方法。

1.2.3 水解反應(yīng)酶解率計(jì)算

脂肪酶催化油脂水解反應(yīng)的酶解率(EHR)按下式計(jì)算：

式中：SV為油樣皂化值，mg/g；AV0為油樣初始酸值，mg/g；AV1為酶催化水解反應(yīng)后樣品酸值，mg/g。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪酶用量對(duì)酶解率的影響

酶用量是影響油脂水解的重要因素[14-15]。參考酶制劑的推薦使用條件及相關(guān)研究[16-19]，豬胰脂肪酶L3621的單因素實(shí)驗(yàn)用量范圍為600～1 000 U/g，假絲酵母脂肪酶LS20的實(shí)驗(yàn)用量范圍為400～800 U/g。2種脂肪酶用量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)梯度均為100 U/g。

在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的水解溫度45℃、油水比1∶1、水解時(shí)間48 h條件下，豬胰脂肪酶L3621不同酶用量催化餐廚廢油水解效果見(jiàn)圖1；在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的水解溫度40℃、油水比1∶0.8、水解時(shí)間48 h條件下，假絲酵母脂肪酶LS20不同酶用量催化餐廚廢油水解效果見(jiàn)圖2。

圖1 L3621不同酶用量下酶催化餐廚廢油水解效果

由圖1可知，隨著酶用量的不斷增加，餐廚廢油酸值及酶解率均不斷提高，說(shuō)明隨著酶催化水解反應(yīng)的進(jìn)行，餐廚廢油中脂肪酸甘油酯不斷被水解為游離脂肪酸，至酶用量最大1 000 U/g時(shí)，樣品酸值(KOH)及酶解率分別達(dá)到192.40 mg/g、97.41%；但也可以看出，當(dāng)酶用量達(dá)到700 U/g時(shí)，樣品酸值(KOH)及酶解率已分別達(dá)到186.04 mg/g、93.97%的較高水平，且繼續(xù)提高酶用量對(duì)酸值和酶解率的貢獻(xiàn)并不大。因此，從酶的使用成本方面考慮，選擇700 U/g為適宜的豬胰脂肪酶L3621用量。

圖2 LS20不同酶用量下酶催化餐廚廢油水解效果

由圖2可知，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定條件下，假絲酵母脂肪酶LS20顯示了與豬胰脂肪酶L3621類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。隨著假絲酵母脂肪酶LS20用量的增加，餐廚廢油水解效果也不斷提高，至酶用量最大800 U/g時(shí)，樣品酸值(KOH)及酶解率分別達(dá)到193.37 mg/g、97.93%，同樣表現(xiàn)出良好的水解效果；但也發(fā)現(xiàn)在酶用量600 U/g之后，酶用量的提高帶來(lái)的酸值及酶解率的增加并不顯著。因此，選擇600 U/g為適宜的假絲酵母脂肪酶LS20用量。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定2種脂肪酶的用量范圍后，參考所采用脂肪酶的使用條件及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[16-19]，針對(duì)酶用量、水解溫度、油水比、水解時(shí)間4個(gè)影響脂肪酶催化油脂水解的關(guān)鍵因素，采用Design Expert軟件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選用L9(34)正交表安排各因素及水平，L3621催化餐廚廢油水解正交實(shí)驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)2，方差分析見(jiàn)表3。LS20催化餐廚廢油水解正交實(shí)驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表4，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析見(jiàn)表6。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平(L3621)

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(L3621)

表3 方差分析(L3621)

注：F0.1=9；F0.05=19。

由表2可知，實(shí)驗(yàn)組5酶催化水解后樣品酸值(KOH)及酶解率最高，分別達(dá)到187.05 mg/g、94.52%，可作為適宜的餐廚廢油酶催化水解條件。根據(jù)R(極差)值大小，可以看出在實(shí)驗(yàn)設(shè)定范圍內(nèi)，4因素對(duì)酶解率影響大小的順序?yàn)椋好赣昧縢t;水解溫度gt;油水比gt;水解時(shí)間；得到的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)組合為A3B2C3D3，即酶用量750 U/g、水解溫度45℃、油水比1∶1.2、水解時(shí)間60 h。由表3可知，水解溫度、油水比、水解時(shí)間在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平變化條件下對(duì)餐廚廢油酶催化水解效果均無(wú)顯著影響，酶用量在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平變化條件下對(duì)酶解率影響極顯著。

綜合正交實(shí)驗(yàn)與方差分析的結(jié)果，選擇正交實(shí)驗(yàn)效果最好的第5組為豬胰脂肪酶L3621的優(yōu)化條件，即酶用量700 U/g、水解溫度45℃、油水比1∶1.2、水解時(shí)間36 h。在優(yōu)化條件下進(jìn)行2 kg餐廚廢油的放大及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果餐廚廢油酶解率達(dá)到94.30%。

表4 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平(LS20)

表5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(LS20)

表6 方差分析(LS20)

注：F0.1=9；F0.05=19。

由表5可知，實(shí)驗(yàn)組9酶催化水解后樣品酸值(KOH)及酶解率最高，分別達(dá)到187.75 mg/g和94.90%，但實(shí)驗(yàn)組5在較少的酶用量和較低的水解溫度下同樣獲得了相當(dāng)水平的催化效果，其酸值(KOH)和酶解率分別為186.83 mg/g、94.40%，因此在成本及能耗方面更具優(yōu)勢(shì)；對(duì)于R(極差)值的分析表明，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定范圍內(nèi)，4因素對(duì)酶解率影響大小的順序?yàn)椋好赣昧縢t;水解溫度gt;油水比gt;水解時(shí)間；得到的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)組合為A3B2C2D2，即酶用量650 U/g、水解溫度40℃、油水比1∶0.8、水解時(shí)間48 h，其酶用量較大、水解時(shí)間較長(zhǎng)。由表6可知，水解溫度在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平變化條件下對(duì)餐廚廢油水解效果影響顯著；酶用量在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平變化條件下對(duì)酶解率影響極顯著。

綜合正交實(shí)驗(yàn)與方差分析的結(jié)果，考慮酶的用量成本及能耗，選擇最佳的假絲酵母脂肪酶LS20酶催化水解條件為：酶用量600 U/g，水解溫度40℃，油水比1∶1，水解時(shí)間36 h。驗(yàn)證及放大實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，餐廚廢油在最佳條件下酶催化水解后樣品酸值(KOH)及酶解率可分別達(dá)到191.35 mg/g和96.84%。

3 結(jié) 論

(1)適宜條件下，豬胰脂肪酶L3621和假絲酵母脂肪酶LS20均可實(shí)現(xiàn)餐廚廢油的高效酶催化水解。

(2)豬胰脂肪酶L3621最佳水解條件為：酶用量700 U/g，水解溫度45℃，油水比1∶1.2，水解時(shí)間36 h。在最佳水解條件下酶解率達(dá)94.30%。

(3)假絲酵母脂肪酶LS20最佳水解條件為：酶用量600 U/g，水解溫度40℃，油水比1∶1，水解時(shí)間36 h。在最佳水解條件下酶解率達(dá)96.84%。

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Hydrolysisofwastecookingoilcatalyzedbylipasefromdifferentsources

LIU Weiwei1,2, PENG Yan1, MA Huan3, ZHANG Xin3， CHEN Xiangsong2, YAO Jianming2

(1. School of Technology ,Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. Huainan New Energy Research Center, Huainan 232000, Anhui ,China; 3. School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)

Waste cooking oil was hydrolyzed to prepare fatty acids with lipase from different sources as catalyst.The dosage of lipase was studied by single factor experiment, and on this basis, the dosage of lipase, ratio of oil to water, reaction temperature and reaction time were optimized by orthogonal experiment. The results showed that waste cooking oil could be hydrolyzed successfully both byPorcinepancreaslipase L3621 andCandidarugosalipase LS20. The optimal conditions were obtained as follows: dosage of lipase 700 U/g, reaction temperature 45℃, reaction time 36 h and ratio of oil to water 1∶1.2 for L3621, and under these conditions, the enzymatic hydrolysis rate reached 94.30%; dosage of lipase 600 U/g, reaction temperature 40℃, reaction time 36 h and ratio of oil to water 1∶1 for LS20, and under these conditions, the enzymatic hydrolysis rate reached 96.84%.

lipase; waste cooking oil; hydrolysis; biodiesel

TQ645;TK63

A

1003-7969(2017)11-0049-04

2017-05-26;

2017-08-21

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1508085SQE213)；安徽省高?？蒲袆?chuàng)新平臺(tái)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(皖教秘科[2015]49號(hào))；安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)穩(wěn)定與引進(jìn)人才項(xiàng)目(wd2017-02)

劉偉偉(1981)，男，副教授，博士，主要從事生物質(zhì)能與環(huán)境工程方面的研究工作(E-mail)liuww@ahau.edu.cn。

馬 歡，副教授，博士(E-mail)mahuan@ahau.edu.cn。