顏彬 陳慧君 高晗 譚文福 蔡鴻寧 周志剛 戴璇 朱發(fā)霞 熊雨靜 徐檬 郭玉琳 鄒苗 吳緒峰

腫瘤相關(guān)CD66b陽性中性粒細(xì)胞對預(yù)測宮頸癌Ⅰb至Ⅱa期復(fù)發(fā)的價值*

顏彬①陳慧君②高晗①譚文福①蔡鴻寧①周志剛①戴璇①朱發(fā)霞①熊雨靜①徐檬①郭玉琳①鄒苗①吳緒峰①

目的：探討宮頸癌組織中的多形核嗜中性粒細(xì)胞（polymorphnuclear neutrophil，PMN）數(shù)量在預(yù)測宮頸癌復(fù)發(fā)中的作用。方法：回顧性分析1999年2月至2006年12月湖北省婦幼保健院及武漢大學(xué)中南醫(yī)院92例初治宮頸癌Ⅰb～Ⅱa期患者的臨床病理資料。采用免疫組織化學(xué)法檢測宮頸癌組織中陽性CD66b的PMN數(shù)量，計算PMN數(shù)量平均值。將患者按宮頸癌組織中PMN浸潤數(shù)量分組，數(shù)量＞PMN平均值為A組，數(shù)量≤PMN平均值為B組。以無復(fù)發(fā)生存（recurrence free survival，RFS）為結(jié)點，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素分析，采用Cox風(fēng)險回歸模型進(jìn)行多因素分析。結(jié)果：A組的RFS期明顯短于B組（P=0.001）。單因素及Cox風(fēng)險回歸模型多因素分析結(jié)果顯示，腺癌（HR為3.020，95%CI為1.340～6.805，P=0.008）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR為2.450，95%CI為1.065～5.637，P=0.035）、PMN浸潤數(shù)量增加（HR為2.866，95%CI為1.274～46.447，P=0.011）為宮頸癌患者RFS的獨立危險因素。結(jié)論：宮頸癌組織中PMN數(shù)量的增加與宮頸癌患者RFS期縮短相關(guān)，是宮頸癌患者預(yù)后不良的一個潛在預(yù)測指標(biāo)。

宮頸癌 預(yù)后 中性粒細(xì)胞 復(fù)發(fā)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)中常見惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升，并且患病年齡呈年輕化趨勢。宮頸癌Ⅰb～Ⅱa期的早期患者行根治術(shù)后，根據(jù)術(shù)后病理檢查結(jié)果有無高危因素，臨床醫(yī)生決定后續(xù)治療及預(yù)測患者復(fù)發(fā)風(fēng)險［1］。雖然患者具有相同的臨床分期及臨床病理高危因素，但其預(yù)后仍有較大差異，因此亟需發(fā)現(xiàn)新的預(yù)后指標(biāo)應(yīng)用于臨床。在人類，多形核嗜中性粒細(xì)胞（polymorphnuclear neutrophil，PMN）簡稱中性粒細(xì)胞，占外周血白細(xì)胞總數(shù)的50%～70%，腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞均能分泌PMN趨化因子，在多種人類惡性腫瘤中均可觀察到PMN浸潤［2］。CD66b是PMN細(xì)胞膜表面的特異性分子標(biāo)志［3］，在多種腫瘤中CD66b陽性的PMN浸潤數(shù)量與患者預(yù)后密切相關(guān)［4］。目前僅有少量小樣本研究報道了宮頸癌組織中PMN數(shù)量與患者預(yù)后的關(guān)系［5］，我國目前仍缺乏相應(yīng)的臨床研究結(jié)果。為此，本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測宮頸癌患者癌組織中CD66b陽性的PMN浸潤數(shù)量，探討PMN數(shù)量與宮頸癌患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系，為患者制定個體化治療方案、提示患者的預(yù)后提供新的預(yù)測指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 資料

回顧性分析1999年2月至2006年12月92例湖北省婦幼保健院及武漢大學(xué)中南醫(yī)院初治宮頸癌患者的病理資料，根據(jù)FIGO指南（2009年）中的臨床分期為Ⅰb～Ⅱa期。所有患者均經(jīng)病理確診，根據(jù)患者隨訪有無復(fù)發(fā)分為復(fù)發(fā)組和無復(fù)發(fā)組。由于病例收集始于1999年，當(dāng)時FIGO臨床分期還未推薦亞分期（Ⅰb1和Ⅰb2），因此無法進(jìn)行Ⅰb期患者的Ⅰb1期和Ⅰb2期的亞分期。本研究獲武漢大學(xué)中南醫(yī)院、湖北省婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法 采用免疫組織化學(xué)法檢測宮頸癌組織中CD66b陽性的PMN數(shù)量，計算PMN數(shù)量平均值。將患者按宮頸癌組織中PMN浸潤數(shù)量分組，數(shù)量＞PMN平均值為A組，數(shù)量≤PMN平均值為B組。標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，脫蠟至水，封閉、抗原修復(fù)，抗原抗體反應(yīng)（一抗4℃過夜，二抗室溫1 h），蘇木素復(fù)染、脫水、中性樹脂封片后制片。設(shè)置已知陽性對照片，小鼠IgG替代一抗作為陰性對照。

1.2.2 PMN計數(shù)方法 采用免疫組織化學(xué)染色法CD66b陽性標(biāo)記細(xì)胞呈棕黃色，計數(shù)呈棕黃色的細(xì)胞數(shù)量即為PMN數(shù)量。每張玻片分別計數(shù)20個高倍鏡視野（×400）后取平均值，壞死以及染色有問題的部位不予選取。

1.2.3 隨訪 所有患者從初次入院治療開始隨訪，至復(fù)發(fā)、失訪或隨訪至2016年12月，生存數(shù)據(jù)來自患者隨訪記錄及電話隨訪，中位隨訪時間為61（5～145）個月。無復(fù)發(fā)生存期（recurrence free survival，RFS）自行根治術(shù)當(dāng)日開始計算，RFS截止至腫瘤復(fù)發(fā)、進(jìn)展或末次隨訪時間。期間失訪3例，失訪率為3%（3/92）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較采用Log rank檢驗，并繪制患者PMN浸潤數(shù)量的生存曲線，單因素分析采用Kaplan-Meier法，多因素分析采用Cox風(fēng)險回歸模型。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌患者復(fù)發(fā)與臨床病理特征的關(guān)系

92例臨床分期為Ⅰb～Ⅱa期宮頸癌患者均行根治術(shù)切除（廣泛全子宮切除+盆腔淋巴結(jié)清掃），14例Ⅰb期和21例Ⅱa期具有高危因素患者（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、深肌層受侵、脈管浸潤、切緣陽性、卵巢轉(zhuǎn)移）行根治術(shù)后放療。在中位隨訪時間61（5～145）個月內(nèi)，32例患者復(fù)發(fā)，總復(fù)發(fā)率為34.8%（32/92），其中Ⅰb期患者的復(fù)發(fā)率為30.3%（20/66）、Ⅱa期為46.2%（12/ 26）?；颊叩膹?fù)發(fā)與患者的年齡、病理類型、臨床分期等無明顯相關(guān)性（均P＞0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性（P=0.031，表1）。

表1 92例宮頸癌患者復(fù)發(fā)與臨床病理特征的相關(guān)性Table 1 Relationship between recurrence and clinicopathologic characteristics of patients with cervical cancer

2.2 宮頸癌組織中PMN浸潤

CD66b為PMN細(xì)胞膜表面分子標(biāo)志，表達(dá)于PMN的細(xì)胞膜上，免疫組織化學(xué)法染色陽性呈棕黃色（圖1）。復(fù)發(fā)組腫瘤組織中PMN浸潤數(shù)量的平均值為103.6個/mm2，明顯高于無復(fù)發(fā)組中PMN浸潤數(shù)量的平均值53.8個/mm2（P=0.031，圖1）。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測宮頸癌組織中陽性CD66b的PMN浸潤（Hamp;E×400）Figure 1 Immunohistochemistry representative example of CD66b-positive neutrophils in cervical cancer tissues(Hamp;E×400)

2.3 PMN浸潤數(shù)量與患者臨床病理特征的關(guān)系

PMN浸潤數(shù)量與患者年齡、臨床分期、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均無明顯相關(guān)性（均P＞0.05，表2）。

表2 宮頸癌組織中PMN浸潤數(shù)量與患者臨床病理特征相關(guān)性Table 2 Relationship between the number of PMN infiltration in cervical cancer and clinicopathologic characteristics of patients with cervical cancer

2.4 宮頸癌組織中PMN的浸潤與患者RFS的關(guān)系

本研究中位隨訪時間61（5～145）個月內(nèi)32例患者復(fù)發(fā)。宮頸癌組織中PMN浸潤數(shù)量的平均值為71.8（5～159）個/mm2。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，A組患者的復(fù)發(fā)率為52.2%（24/46），明顯高于B組的17.4%（8/46），兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001，圖2）。另外，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也與宮頸癌患者的RFS密切相關(guān)（P=0.001）。

圖2 宮頸癌患者根治術(shù)后RFS生存曲線Figure 2 Kaplan-Meier survival curves of patients with cervical cancer after surgery

2.5 影響Ⅰb～Ⅱa期宮頸癌患者RFS的獨立危險因素

本研究單因素分析結(jié)果顯示，年齡、臨床分期（Ⅰb期或Ⅱa期）對患者RFS無顯著性影響，病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和PMN浸潤數(shù)量與患者RFS密切相關(guān)。將病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及PMN浸潤數(shù)量行多因素分析，臨床上考慮到年齡、臨床分期與患者預(yù)后密切相關(guān)，將年齡和臨床分期也同時納入，結(jié)果顯示腺癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PMN浸潤數(shù)量的增加是患者RFS的獨立預(yù)后因素，年齡、臨床分期對患者預(yù)后的影響無顯著性差異（表3）。

表3 影響宮頸癌患者RFS的單因素與Cox多因素分析Table 3 Univariate and multivariate analyses of the influencing factors of the recurrence-free survival in patients with cervical cancer(n=92)

3 討論

本研究對92例臨床分期Ⅰb～Ⅱa期的早期宮頸癌初治患者行宮頸癌組織中PMN浸潤數(shù)量與患者生存關(guān)系的分析。宮頸癌組織中PMN浸潤數(shù)量的增加與患者RFS呈負(fù)相關(guān)，患者PMN的浸潤數(shù)量＞PMN平均值的5年RFS為47.8%，PMN的浸潤數(shù)量≤PMN平均值的5年RFS為82.6%。因此在隨訪中應(yīng)對癌組織中PMN浸潤數(shù)量增加的患者給予關(guān)注，該指標(biāo)是潛在的預(yù)測宮頸癌患者預(yù)后的新指標(biāo)。

腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是惡性腫瘤的第七大特征［6］，在腫瘤微環(huán)境中，惡性腫瘤細(xì)胞與炎性細(xì)胞的相互作用在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)中起到重要作用［7］。免疫細(xì)胞中包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，在腫瘤慢性炎癥微環(huán)境中與腫瘤細(xì)胞相互影響、協(xié)同發(fā)揮作用［8］，與腫瘤細(xì)胞之間的網(wǎng)絡(luò)交互作用決定了腫瘤的進(jìn)展或者消退。

在宮頸癌及其他腫瘤中淋巴細(xì)胞的浸潤已被證實具有預(yù)測患者預(yù)后的作用［8］，宮頸癌組織中T淋巴細(xì)胞CD8+浸潤數(shù)量的增加是預(yù)測宮頸癌RFS的獨立預(yù)測因子［4］。因腫瘤具有逃避獲得性免疫系統(tǒng)攻擊的特征，PMN能夠抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的功能［9］，在腎細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌以及食管癌組織中CD66b陽性的PMN數(shù)量與患者預(yù)后密切相關(guān)［4］。在宮頸癌及其他腫瘤中，雖血液檢測中PMN數(shù)量的增加以及PMN與淋巴細(xì)胞比值的增加均與患者的不良預(yù)后相關(guān)［10-12］，但在宮頸癌組織中PMN浸潤數(shù)量與患者預(yù)后的關(guān)系卻鮮有報道。一項回顧性研究分析了46例早期宮頸癌患者Ⅰb～Ⅱa期復(fù)發(fā)與癌組織中PMN浸潤數(shù)量的關(guān)系，結(jié)果顯示宮頸癌組織中PMN浸潤數(shù)量增加，提示Ⅰb～Ⅱa期宮頸癌患者復(fù)發(fā)的風(fēng)險增加［5］，但該研究存在樣本量小、臨床病理資料有限等不足。本研究結(jié)果采用Cox多因素分析，顯示Ⅰb～Ⅱa期宮頸癌組織中PMN浸潤數(shù)量的增加與RFS呈負(fù)相關(guān)，與外周血中PMN浸潤數(shù)量的增加提示宮頸癌患者預(yù)后不良的報道相一致［5］，外周血中的免疫細(xì)胞與宮頸癌組織中浸潤的免疫細(xì)胞之間是相互關(guān)聯(lián)且處于動態(tài)平衡。

本研究結(jié)果顯示，在宮頸癌組織中PMN浸潤數(shù)量的增加與患者的RFS密切相關(guān)，與既往在腎癌、黑色素瘤、乳腺癌等其他人體腫瘤中的研究結(jié)果一致［13］。在宮頸癌組織中PMN的浸潤提示PMN可能在宮頸癌的進(jìn)展中起到促進(jìn)作用，相關(guān)分子機制有待后續(xù)進(jìn)一步研究。此外宮頸腺癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也與患者RFS密切相關(guān)，是患者預(yù)后不良的一個獨立危險因素。本研究中，Ⅰb期和Ⅱa期早期宮頸癌均可手術(shù)治療，雖預(yù)后存在差別但無顯著性差異，與其他研究的結(jié)果相一致［5，14-15］。

綜上所述，本研究初步證實宮頸癌組織中PMN的浸潤與患者RFS密切相關(guān)，并且PMN浸潤數(shù)量的增加是宮頸癌患者復(fù)發(fā)的一個獨立危險因素，為宮頸癌患者的預(yù)后判斷提供了新的評估指標(biāo)。未來可進(jìn)行大樣本、前瞻性的研究，納入已知的宮頸癌高、中危因素（如手術(shù)切緣情況、HPV感染及型別、腫瘤大小、深肌層受侵、脈管浸潤情況等）行分層分析，明確相關(guān)的分子機制。

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（2017-05-29收稿）

（2017-10-09修回）

Value of tumor-associated CD66b-positive neutrophils for the prediction of the recurrence of stage Ib and IIa cervical cancer

Bin YAN1,Huijun CHEN2,Han GAO1,Wenfu TAN1,Hongning CAI1,Zhigang ZHOU1,Xuan DAI1,Faxia ZHU1,Yujing XIONG1,Meng XU1,Yulin GUO1,Miao ZOU1,Xufeng WU1

1Department of Gynecologic Oncology,Hubei Maternity and Child Health Hospital,Wuhan 430070,China;2Department of Gynecology and Obstetrics,Zhongnan Hospital,Wuhan University,Wuhan 430071,China

Xufeng WU;E-mail:zwuxufeng@163.com

Objective:To investigate the prognostic effect of polymorphnuclear neutrophil(PMN)in cervical cancer.Methods:Patients (n=92)who underwent curative surgery for the treatment of stage Ib and IIa cervical cancer according to the International Federation of Gynecology and Obstetrics(FIGO)were assessed to determine their tumor-infiltrating CD66b-positive neutrophils through immunohistochemistry.Assessment results were then analyzed to identify their correlation with recurrence-free survival(RFS)as an end point. Kaplan–Meier method was used for survival curve analysis,and a Cox proportional hazard model was utilized for univariate and multivariate analyses.ResultsThe RFS of the group with a density of CD66b-positive neutrophils above the median in cervical cancer tissues was significantly shorter than that of the group with a density of CD66b-positive neutrophils below the median(P=0.001).Univariate and multivariate analyses revealed adenocarcinoma(HR=3.020;95%CI=1.340-6.805;P=0.008),lymph node metastasis(HR=2.450; 95%CI=1.065-5.637;P=0.035),and high neutrophil density(HR=2.866;95%CI=1.274-46.447;P=0.011)as independent prognostic factors of short RFS.Conclusion:The increasing number of tumor-infiltrating neutrophils in cervical cancer tissues was correlated with short RFS of patients with cervical cancer.

cervical cancer,prognosis,neutrophil,recurrence

①湖北省婦幼保健院腫瘤婦科（武漢市430070）；②武漢大學(xué)中南醫(yī)院婦產(chǎn)科

*本文課題受國家自然青年科學(xué)基金項目（編號：81502265）和武漢市科技計劃項目（編號：2015061701011647）資助

吳緒峰 zwuxufeng@163.com

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.21.598

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81502265),the Key Project of National Health and Family Planning Commission of Hubei Province(No.WJ2015MA017),the Natural Science Foundation of Hubei Province(No.2015CFB381),and the Scientific Research Project of Wuhan Science and Technology Bureau(No.2015061701011647)

顏彬 專業(yè)方向為婦科腫瘤臨床治療及基礎(chǔ)研究。E-mail：yanbin1984@163.com