王方方，康瑩，張權(quán)，齊夢(mèng)蝶，劉永剛，高同雨，武雅娟，劉勇*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102；2.北京市門(mén)頭溝區(qū)國(guó)家生態(tài)修復(fù)科技綜合示范基地，北京 102300)

北京妙峰山玫瑰花渣中黃酮類(lèi)成分的UPLC/Q-TOF-MS分析△

王方方1，康瑩1，張權(quán)1，齊夢(mèng)蝶1，劉永剛1，高同雨2，武雅娟2，劉勇1*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102；2.北京市門(mén)頭溝區(qū)國(guó)家生態(tài)修復(fù)科技綜合示范基地，北京 102300)

目的采用UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)玫瑰花渣中的黃酮類(lèi)成分進(jìn)行定性分析。方法采用Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱溫：40 ℃，洗脫系統(tǒng)為乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫；采用ESI離子源并在負(fù)離子模式下進(jìn)行采集數(shù)據(jù)。結(jié)果通過(guò)UPLC的快速分離，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)分析推測(cè)，鑒定了11種黃酮類(lèi)化合物。結(jié)論采用UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)，可有效地分析玫瑰花渣中黃酮類(lèi)成分，為玫瑰花渣的回收利用提供了數(shù)據(jù)支持。

UPLC/Q-TOF-MS；玫瑰花渣；黃酮類(lèi)化合物；北京妙峰山

玫瑰花為薔薇科植物玫瑰RosarugosaThunb.的干燥花蕾，具有行氣解郁、和血、止痛的功效，用于肝胃氣痛、食少?lài)I惡、月經(jīng)不調(diào)、跌補(bǔ)傷痛[1]。玫瑰花具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，包括人體所需的氨基酸和膳食纖維等，并且具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等作用[2-3]。玫瑰花精油具有“液體黃金”之美譽(yù)，但是人們只注重玫瑰精油的研究卻很少重視玫瑰花渣的研究，造成玫瑰花資源的浪費(fèi)[4]。有研究表明玫瑰花渣中總黃酮的含量達(dá)3.34%[5]。黃酮類(lèi)化合物具有多種生物活性，對(duì)缺血性腦損傷有保護(hù)作用，具有抗腫瘤活性，并且具有較強(qiáng)的抗氧化自由基作用[6]。本實(shí)驗(yàn)利用UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)，對(duì)玫瑰花渣中黃酮類(lèi)化學(xué)成分快速鑒定分析，有利于了解玫瑰花渣中化學(xué)成分，對(duì)玫瑰花渣的回收利用提供有效的依據(jù)。

1 儀器和試劑

1.1 儀器

Accele 600 pump高效液相色譜儀和LTQ QrbiTrap XL線(xiàn)性離子阱-串聯(lián)靜電軌道場(chǎng)質(zhì)譜(美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品)；BSA1245 型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Pacific T-Ⅱ型超純水儀(美國(guó)Thermo公司)；0.22 μm微孔濾膜。

1.2 試劑

對(duì)照品槲皮素(批號(hào)：117-39-5)、蘆丁(批號(hào)：153-18-4)、楊梅素(批號(hào)：529-44-2)，均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，純度均大于等于98%；甲醇、乙腈均為色譜級(jí)試劑，水為娃哈哈純凈水；玫瑰花采自北京妙峰山，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉勇教授鑒定為玫瑰RosarugosaThunb.的花。

2 方法

2.1色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱溫：25 ℃；體積流量：0.3 mL·min-1；流動(dòng)相：色譜乙腈(A)、0.1%的甲酸水溶液(B)按程序梯度洗脫(0～4 min，5%～13%A；4～16 min，13%～29%A；16～21 min，29%～46%A；21～25 min，46%～59%A；25～27 min，59%～95%A；27～29 min，95%～95%A；29～30 min，95%～5%A)。

2.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜的離子源為電噴霧離子源，負(fù)離子模式掃描，質(zhì)譜掃描范圍：m/z100～800；離子源溫度：110 ℃；毛細(xì)管電壓：3000 V，錐孔電壓：30 V，鞘流氣溫度：400 ℃，鞘流氣氮?dú)獾捏w積流量：9 L·min-1，碰撞能量：25～50 ℃。

2.3 供試品溶液制備

將曬干的玫瑰花粉碎，精確稱(chēng)量玫瑰花2 g，加入甲醇50 mL，加熱回流2 h，放冷，過(guò)濾，收集濾液，重復(fù)3次，合并濾液，旋干，色譜甲醇溶解，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，備用。

2.4 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取蘆丁、槲皮素、楊梅素適量，加入甲醇并稀釋成10 μg·mL-1的溶液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，備用。

3 結(jié)果與分析

3.1 玫瑰花渣中黃酮類(lèi)化合物的鑒別

本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)玫瑰花渣中黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行分析，由于在負(fù)離子模式下黃酮類(lèi)化合物易形成相對(duì)穩(wěn)定的離子化合物，因此在此條件下對(duì)玫瑰花渣中黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行分析[7]。通過(guò)高分辨質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子推測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)式，再根據(jù)對(duì)照品信息、相關(guān)文獻(xiàn)[8-17]及色譜峰來(lái)分析、鑒定玫瑰花渣中11種黃酮類(lèi)化合物，結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

3.2 玫瑰花渣中黃酮類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)解析

化合物1：槲皮素-7-O-鼠李糖苷。結(jié)合負(fù)離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z447.09[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C21H20O11，再根據(jù)化合物分子式找出二級(jí)質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z301、273、124、301[M-H-146]-是母離子失去一分子鼠李糖，并結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)此化合物為槲皮素-7-O-鼠李糖苷。

表1 UPLC玫瑰花渣中化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)

圖1 玫瑰花渣提取液總離子流圖

化合物2：槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷。結(jié)合負(fù)離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z477.10[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C21H18O13，再根據(jù)化合物分子式找出二級(jí)質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z301、124、301[M-H-176]-是母離子失去一分子葡萄糖醛酸，結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)此化合物為槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷。

化合物3：槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷。結(jié)合負(fù)離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z609.14[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C27H30O16，再根據(jù)化合物分子式找出二級(jí)質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z463、447、301、463[M-H-146]-是母離子失去一分子鼠李糖，m/z301[M-H-146-162]-是母離子失去一分子鼠李糖后又失去一分子葡萄糖，結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)此化合物為槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷。

化合物4：楊梅素-3-O-鼠李葡萄糖苷。結(jié)合負(fù)離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z625.13[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C27H30O17，再根據(jù)化合物分子式找出二級(jí)質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z463、317、463[M-H-162]-是母離子失去一分子葡萄糖，m/z317[M-H-162-146]-是母離子失去一分子葡萄糖再失去一分子鼠李糖，再將m/z317的碎片離子峰與對(duì)照品相比，發(fā)現(xiàn)其為楊梅素，故結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)此化合物為楊梅素-3-O-鼠李葡萄糖苷。

化合物5：槲皮素-3，7-O-二葡葡糖苷。結(jié)合負(fù)離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z625.13[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C27H30O17，再根據(jù)化合物分子式找出二級(jí)質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z463、301、124、463[M-H-162]-是母離子失去一分子葡萄糖，m/z301[M-H-162-162]-是母離子失去兩分子葡萄糖，結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)此化合物為槲皮素-3，7-O-二葡葡糖苷。

化合物6：蘆丁。結(jié)合負(fù)離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z609.14[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C27H30O16，再根據(jù)化合物分子式找出二級(jí)質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z463、301、463[M-H-146]-是母離子失去一分子鼠李糖，m/z301[M-H-146-162]-是母離子失去一分子鼠李糖后又失去一分子葡萄糖。故結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)此化合物為蘆丁。

化合物7：槲皮素-3-O-鼠李糖苷。結(jié)合負(fù)離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z447.09[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C21H20O11，再根據(jù)化合物分子式找出二級(jí)質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z301、300、273、124、301[M-H-146]-，是母離子失去一分子鼠李糖，結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)此化合物為槲皮素-3-O-鼠李糖苷。

化合物8：山柰酚-3-O-葡萄糖苷。結(jié)合負(fù)離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z447.09[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C21H20O11，再根據(jù)化合物分子式找出二級(jí)質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z285、227、159、285[M-H-162]-是母離子失去一分子葡萄糖，m/z285與山柰酚的母離子相同，又經(jīng)過(guò)碎片離子m/z227和159可以驗(yàn)證為山柰酚，結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)此化合物為山奈酚-3-O-葡萄糖苷。

化合物9：山柰酚-3-O-蕓香糖。結(jié)合負(fù)離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z593.15[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C27H30O15，再根據(jù)化合物分子式找出二級(jí)質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z285、159、117、285[M-H-308]-是母離子失去一分子蕓香糖，又經(jīng)過(guò)m/z159和117可驗(yàn)證為山柰酚的碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)此化合物為山奈酚-3-O-蕓香糖。

化合物10：槲皮素-3-O-葡萄糖苷。結(jié)合負(fù)離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z463.09[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C21H20O12，再根據(jù)化合物分子式找出二級(jí)質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z301、273、152、124。m/z301是槲皮素的母核離子，m/z301[M-H-162]-是母離子失去一分子葡萄糖，m/z273[M-H-162-28]-是母離子失去一分子葡萄糖后再失去一個(gè)CO，m/z152[M-H-162-149]-是母離子失去一分子葡萄糖后再進(jìn)行A1.3裂解[18]，m/z124[M-H-162-149-28]-是A1.3裂解后再失去一個(gè)CO，并結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)此化合物為槲皮素-3-O-葡萄糖苷。此譜圖中的槲皮素碎片離子與對(duì)照品中的槲皮素碎片離子相同。見(jiàn)圖2。

圖2 槲皮素-3-O-葡萄糖苷可能的裂解途徑

化合物11：櫻黃素。結(jié)合負(fù)離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z283.06[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C16H12O5，再根據(jù)化合物分子式找出二級(jí)質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z268、152、135、268[M-H-15]-是母離子失去一分子甲基，m/z152和135是母離子在C環(huán)的O和3間的鍵斷裂所形成的碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)此化合物為櫻黃素。

4 討論

UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)可快速、高效地得到玫瑰花渣提取液中化合物的質(zhì)譜碎片離子，并根據(jù)碎片離子可以快速分析其中化合物的結(jié)構(gòu)。綜上所述玫瑰花渣中的黃酮類(lèi)化合物主要以醇苷類(lèi)成分存在，并且以槲皮素、山柰酚為苷元與葡萄糖基、鼠李糖基結(jié)合形成黃酮醇苷類(lèi)化合物。玫瑰花渣中黃酮醇苷的裂解主要是先逐步失去糖類(lèi)成分，黃酮苷元的裂解先是C環(huán)的RDA裂解，然后再失去小分子碎片，比如H2O、CO、CO2等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)，根據(jù)RDA裂解產(chǎn)生的碎片離子及A環(huán)和B環(huán)上的取代基種類(lèi)對(duì)該碎片的豐度的影響來(lái)判定糖基和苷元的連接位置。

目前對(duì)玫瑰花渣的研究較少涉及到具體成分分析，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)得到玫瑰花渣中黃酮類(lèi)化合物的成分，對(duì)今后玫瑰花渣的資源開(kāi)發(fā)和回收利用提供數(shù)據(jù)支持。若要全面分析玫瑰花渣化合物成分，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：200.

[2] 李明，李艷芳，孫永超.中藥玫瑰花的研究進(jìn)展[J].衛(wèi)生職業(yè)教育，2007，25(8)：146-148.

[3] 王輝，姚雷.油用玫瑰國(guó)內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀和研究進(jìn)展[J].香料香精化妝品，2012(2)：47-51.

[4] 趙曉峰，吳榮書(shū).玫瑰花綜合利用與其開(kāi)發(fā)前景[J].保鮮與加工，2004，4(3)：30-31.

[5] 尉芹，王永紅，胡亞云，等.玫瑰花渣化學(xué)成分與營(yíng)養(yǎng)成分研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20(3)：140-141，168.

[6] 高玲美，李志香，丁淑燕，等.玫瑰花渣的研究進(jìn)展[J].山東教育學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25(6)：43-45.

[7] 石任兵.中藥化學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：68-86.

[8] 孫冬梅，董玉娟，胥愛(ài)麗，等.UPLC-Q-TOF-MS法快速篩查銀杏磷脂軟膠囊中12種黃酮類(lèi)化合物[J].中成藥，2015，37(2)：320-324.

[9] 黃輝強(qiáng)，馮毅凡，芮雯，等.紫花杜鵑中黃酮類(lèi)成分的UPLC/Q-TOF-MS分析[J].中國(guó)中藥雜志，2009，34(7)：875-878.

[10] 芮雯，范賢，岑穎洲，等.千斤拔中黃酮類(lèi)成分的UPLC/Q-TOF-MS分析[J].中成藥，2012，34(3)：509-513.

[11] 馬欣，孫毓慶.高效液相色譜-紫外-電噴霧-質(zhì)譜法分析銀杏葉中黃酮醇苷類(lèi)化合物[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，20(4)：275-279.

[12] 張佳嬋，謝婭霏，虞旦，等.玫瑰花及花渣中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取及其抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技，2014(22)：226-230.

[13] 謝秋濤，李高陽(yáng).超臨CO2提取玫瑰精油工藝優(yōu)化及副產(chǎn)物綜合利用研究[D].長(zhǎng)沙：中南大學(xué)，2013.

[14] 李麗梅，婁潔，劉貴有，等.玫瑰花中的異黃酮類(lèi)化合物及其活性研究[J].中草藥，2015，46(10)：1420-1422.

[15] 賈佼佼，苗明三.玫瑰花的化學(xué)、藥理及應(yīng)用分析[J].河南中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，(9)：1337-1338.

[16] 張語(yǔ)遲，劉春明，劉志強(qiáng)，等.羅布麻葉黃酮類(lèi)成分酶解前后的液相色譜-質(zhì)譜分析及活性比較[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2010，29(10)：1073.

[17] 周小琦，方敏，宮智勇.玫瑰花中總黃酮提取工藝及其抗氧化與抑菌作用的研究[J].食品科學(xué)，2010，31(20)：102-105.

[18] 李想，方洪狀.黃酮醇類(lèi)化合物ESI-ITMSn質(zhì)譜裂解規(guī)律的量子化學(xué)研究[D].佳木斯：佳木斯大學(xué)，2015.

AnalysisofFlavonoidsinRoseDregsofMiaofengMountaininBeijingbyUPLC/Q-TOF-MS

WANGFangfang1，KANGYing1，ZHANGQuan1，QIMengdie1，LIUYonggang1，GAOTongyu2，WUYajuan2，LIUYong1*

(1.BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China；2.BeijingMentougouNationalEcologicalRestorationTechnologyComprehensiveDemonstrationBase，Beijing102300，China)

Objective：The qualitative analysis of flavonoids in rose dregs was carried out by UPLC/Q-TOF-MS.MethodsThe separation was performed on a Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)with acetonitrile-0.1% formic acid in water by gradient elution.Electrospray ionization-(ESI)source was applied and operated in negative ion mode.Results11 flavonoids were identified by rapid separation of UPLC and based on mass spectrometry data and literature analysis.ConclusionThe use of UPLC/Q-TOF-MS technology can effectively analyze the flavonoids in rose dregs and provide data for the recovery of rose dregs.

UPLC/Q-TOF-MS；rose dregs；flavonoids；Miaofeng montain in Beijing

北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目(Z151100001415009)

*

劉勇，教授，研究方向：藥用植物親緣學(xué)、中藥質(zhì)量與開(kāi)發(fā)；Tel：(010)84738656，E-mail：yliu0126@aliyun.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.011

2017-04-10)