李雁峰 ，馮沖凌 ，李科林 ，彭天翊 ，何淑嬌 ，張 歡 ，周 韜

（中南林業(yè)科技大學 a. 環(huán)境科學與工程學院；b. 生命科學與技術學院，湖南 長沙 410004）

復合功能菌群的構建及其對鉛鋅脅迫下蓖麻種子萌發(fā)和鉛鋅積累的影響

李雁峰a，馮沖凌a，李科林a，彭天翊a，何淑嬌a，張 歡a，周 韜b

（中南林業(yè)科技大學 a. 環(huán)境科學與工程學院；b. 生命科學與技術學院，湖南 長沙 410004）

為了研究復合菌群對鉛鋅脅迫下蓖麻種子萌發(fā)的影響，以期為下一步微生物-蓖麻聯(lián)合修復盆栽實驗提供功能菌群和理論基礎，從課題組內經(jīng)菌肥改良后的植物根際土壤中篩選出根際促生菌，與課題組已有的菌株進行平板拮抗實驗，優(yōu)選測序并構建復合菌群。沙培實驗考察復合菌群對鉛鋅脅迫下種子萌發(fā)的影響，收獲后分別測定其萌發(fā)生長指標、掃描其根系形態(tài)、測定重金屬富集量，并對其結果進行分析。篩選出了具有溶磷能力的真菌L14為尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum，且與實驗室兩株耐性菌HA、J3構建的復合菌群相互無拮抗。該復合菌群接種到基質后，能在高濃度重金屬脅迫下有效促進蓖麻種子萌發(fā)及幼苗生長，同時促進其根系對重金屬的富集。其中，對Pb的累積量最大可提升38.6%，對Zn的累積量最大可提升25.2%。分析結果表明: 該復合菌群在鉛鋅脅迫下不僅能夠促進蓖麻種子萌發(fā)及幼苗生長，還可以顯著提高幼苗根系對重金屬的吸收累積。

鉛鋅；復合菌群；蓖麻；種子萌發(fā)；富集

植物修復作為生物修復的手段，兼具了高效經(jīng)濟無污染等優(yōu)點，在重金屬污染治理實踐中被廣為應用[1-3]。然而，隨著修復技術的發(fā)展，單一的植物修復已經(jīng)不能滿足人們的需求，研究人員通過引入根際微生物進行聯(lián)合修復，大大提高了植物修復的效果。陳生濤等[4]通過對植物促生細菌Rhizobiumsp. W33協(xié)助不同植物吸收銅的研究，發(fā)現(xiàn)根瘤菌W33-黑麥草聯(lián)合體系能夠顯著提升植物對重金屬Cu的吸收，該促生菌能夠在促使植物根部和地上部干重增加46.7% 和27.9%的同時，還使其Cu累積量分別增加25.5%和70.1%。Hazrat Ali[5]等通過總結得出，植物促生菌可以通過鐵載體、溶磷作用及促進ACC脫氨酶合成來改善植物生長，增加生物量，從而輔助植物進行重金屬污染環(huán)境修復。盡管有大量研究表明，微生物-植物聯(lián)合修復體系可以有效提高植物修復的效果，但是，這些研究大都集中在單一菌株對植物的促進作用方面，關于復合功能菌群對植物修復的促進作用的研究較少見。

由多種微生物在一定環(huán)境下共生而成的復合功能菌群，往往聚集了各部分微生物的特征，對于一些結構非常復雜的污染物，其修復效果遠高于單一微生物，從而在污染環(huán)境修復中顯示出巨大的潛力[6]。Takashi Hirooka[7]等利用復合自養(yǎng)菌群對2,4-二硝基酚（2,4-DNP）進行降解，同時實現(xiàn)了對2,4-DNP與其二次污染物2-氨基-4-硝基苯酚（2-ANP）的完全去除，達到了理想的效果；Prakash K. Singh[8]等利用復合細菌群從煤中去除有害的微量金屬，結果表明，該復合菌群去除了多達80%的Ni、Zn、Cd、Cu和Cr以及接近45%的Pb。這一系列的研究都說明，混合菌群能夠高效全面的實現(xiàn)對污染環(huán)境的修復。

油料植物蓖麻Ricinus communistL.有著良好的適應性、重金屬耐性及高產(chǎn)油率，常被應用在重金屬污染土壤修復中[9,10]。然而，利用蓖麻進行修復時，高濃度的重金屬離子會破壞植物的正常代謝，限制種子的萌發(fā)，從而對其生長生存和修復效果造成嚴重影響[11]。針對以上情況，本文以實現(xiàn)蓖麻種子在鉛鋅脅迫下高效萌發(fā)為目的，以蓖麻為供試植物，在課題組前期研究的基礎上，將從菌肥改良后的根際土壤中篩選出的根際促生菌與實驗室保藏的兩株鉛鋅耐性菌株HA、J3混合[12-13]；通過單因素實驗，研究微生物菌群對重金屬脅迫下蓖麻種子萌發(fā)的影響，考察接種復合菌群對蓖麻生物量、重金屬富集及根系生長等情況的影響，探討其對蓖麻種子萌發(fā)及幼苗生長的作用，以期為后續(xù)的大規(guī)模盆栽試驗提供高效復合菌群及理論基礎。

1 材料與方法

1.1 功能菌株來源

耐鉛鋅功能菌株來自本課題組由鉛鋅礦渣土與尾礦渣先鋒植物黃精根際篩選獲得的耐性菌株米曲霉Aspergillus oryzae-HA，蟲生輪殖孢Verticillium insectorum-J3[12,13]。

植物根際促生菌篩選自本課題組內經(jīng)過有機菌肥改良后長勢良好的辣椒、向日葵根際土壤[14]。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，pH 7.4～7.6，去離子水1 000 mL。

孟加拉紅培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨5，葡萄糖 10，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5， 孟 加 拉 紅0.033，氯霉素0.1，去離子水1 000 mL。

無機磷培養(yǎng)基（NBRIP）參照文獻[15]配置，改進CAS檢測培養(yǎng)基參照文獻[16]配置。

固體培養(yǎng)基另加15～20 g/L的瓊脂。

Salkowski’s 顯色劑：150 mL 濃硫酸溶于250 mL去離子水中，加入7.5 mL 0.5 mol/L的FeCl3·6H2O 溶液。

1.3 根際促生菌的篩選與促生能力測定

取辣椒、向日葵根際新鮮土樣各10 g分別裝于有100 mL無菌水的三角瓶振蕩，制成土壤稀釋液，取稀釋液0.1 mL分別涂布于孟加拉紅、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3 d后，挑選單菌落，按照真菌、細菌分別接種于孟加拉紅培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。最后選取生長速度相對較快、菌落特征典型的真菌、細菌菌落進一步純化。

1.3.1 產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）能力測定

將分離純化后的菌株接種于含100 mg/L色氨酸的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)2 d。離心后取上清液1 mL與2 mL Sackowski’s顯色劑充分混合，以加入1 mL（50 mg/L）的IAA的標準液作為陽性對照。于室溫、避光條件下放置30 min后觀察，顏色變紅者表示能夠產(chǎn)IAA。

1.3.2 溶磷能力測定

取活化后的各菌株菌懸液1 mL分別接入100 mL NBRIP培養(yǎng)基中，未接作為空白對照，于28 ℃搖床培養(yǎng)3 d，過濾后離心，取濾液用鉬藍法測上清液磷含量。

1.3.3 產(chǎn)鐵載體能力測定

將待測菌株接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，待單菌落長出后，將滅菌后的改進CAS檢測培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右時，按每個平板10 mL倒入牛肉蛋白胨培養(yǎng)基中，放置1 h觀察每個平板的顏色變化，并記錄結果。根據(jù)菌落周圍暈圈的大小，定性檢測菌株分泌鐵載體能力。

1.4 菌株間拮抗實驗

在牛肉膏蛋白胨平板上，將挑選出的根際促生菌株與課題組已保存的2株菌進行相互對峙培養(yǎng)試驗。用某一菌株通過平板中心劃線接種，在該菌株劃線接種的兩側劃線接種另一菌株，保證劃線接種時兩菌株不相互接觸。每個平板接種2株菌株，重復3次。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，觀察菌株在平板上的拮抗作用。

1.5 根際促生菌的分子生物學鑒定

對上一步篩選出的菌株進行分子生物學鑒定，根據(jù)真菌分子系統(tǒng)發(fā)育譜，設計并合成ITS區(qū)通用引物：ITS1/ITS4，利用基因組DNA提取試劑盒提取DNA后，用引物擴增序列；PCR產(chǎn)物經(jīng)長沙愛科博生物科技有限公司純化測序；測序結果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov進行在線查詢分析，與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的已有序列進行BLAST 比對分析，利用Clustal 和MEGA軟件，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 種子萌發(fā)實驗

以前一步實驗為依據(jù)構建復合菌群，沙培實驗考察其對蓖麻種子萌發(fā)的影響。供試種子為取自湖南林科院的湘篦8號，選取經(jīng)烘干后的潔凈河沙過目（Φ＜1 mm），向240 mL組培罐中加入75 mL細沙。加入Pb(NO3)2、Zn(NO3)2溶液使其Pb2+、Zn2+濃度分別為0、100、200、400、600 mg/L，補充去離子水至總體積為100 mL并使沙子濕潤，滅菌后待用。取制備好的復合菌液，在超凈工作臺中向基質中接種1 mL菌液，對照為不接菌，各重復6次。選干凈飽滿的蓖麻種子浸泡在25 ℃溫水中催芽24 h，用1% NaClO消毒20 min后無菌水沖洗4～5次，待菌液滲入并攪拌均勻后，向每個組培罐中均勻鋪入4粒種子，蓋上透氣蓋后置人工氣候箱中進行萌發(fā)實驗。培養(yǎng)條件為溫度（28±2 ℃），光照12 h/d，生長8 d后收獲。

1.7 指標測定

測定其種子萌發(fā)相關指標（萌發(fā)率、根長株高、生物量）以及植物中重金屬富集量，對其進行根系掃描并觀察組織細胞切片。其中，萌發(fā)率、根長株高及生物量的測量方法為：

萌發(fā)率（%）=播種后第8天后全部萌發(fā)的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；利用刻度為1 mm的直尺測定其主根長及株高；剪下的新鮮根系洗凈后用WinRHIZO根系分析系統(tǒng)進行掃描分析。

用吸水紙將植物表面水分擦拭后，用天平稱量其鮮重。將植株于105 ℃烘箱內殺青30 min，再于70 ℃下烘干至恒重，稱取干質量。植物的各部分采用HNO3-HClO4消解法進行消解，用火焰原子吸收光譜儀測定其各部分的重金屬富集量[17]。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均采用Origin 8.0作圖，使用Excel及SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)處理。利用一般線性模型及多重比較（Duncan）方法對數(shù)據(jù)進行分析，差異顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 根際促生菌的篩選及相關指標測定

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基及孟加拉紅培養(yǎng)基上對菌肥改良后的根際土壤中微生物進行涂布初篩，共篩選出菌株32株。在初篩試驗的基礎上，選擇菌落形態(tài)不同、長勢良好的7株菌株根據(jù)促生性能進行復篩，各項指標如表1所示。其中，L11、L14菌株的溶磷能力相對較高但不產(chǎn)吲哚乙酸與鐵載體；X8菌株產(chǎn)吲哚乙酸的能力較強且能夠產(chǎn)鐵載體，但是在其生長過程中需要消耗掉一定的水溶性磷；L6、L7有一定的產(chǎn)吲哚乙酸能力但溶磷能力相對較低。

微生物產(chǎn)生植物激素類物質如吲哚乙酸，能夠促進細胞分裂和伸長以及新器官的分化和形成，從而促進植物的生長發(fā)育[18]；其產(chǎn)生的鐵載體作為三價鐵螯合物，不僅可以滿足微生物自身對鐵離子的需求，同時還可以供給植物作為鐵源吸收，從而促進植物生長[19]；而溶磷作用，則是微生物通過產(chǎn)酸等機制將被固定的磷釋放出來，使難溶態(tài)的磷變?yōu)榭扇軕B(tài)的磷，以便植物吸收[20]。這一系列促生特性及其作用，可以有效緩解重金屬等環(huán)境因子的脅迫，促進植物生長發(fā)育。根據(jù)結果，初步確定L6、L7、L11、L14與X8這5株菌進行下一步拮抗試驗。

表1 菌株促生能力指標測定情況?Table 1 Ability of strains in promoting plant growth

2.2 菌株間拮抗實驗

平板對峙培養(yǎng)結果表明，5株菌株中除了L6、L11與HA之間有一定的拮抗作用之外，其余菌株與J3、HA之間均沒有相互抑制作用。根據(jù)性能，優(yōu)選X8、L14兩株根際促生菌，且X8、L14之間并無抑制作用，因而可作為復合菌群構建的可選菌株。

構建復合菌群，除了考慮其效果之外，不同菌種之間的相互作用也會對菌群的穩(wěn)定及效果產(chǎn)生影響。Gaylarde[21]等將十多種真菌混合培養(yǎng)以構建復合菌群，結果發(fā)現(xiàn)僅剩下Ulocladium atrum及Penicillium purpurogenum兩種真菌；分析表明，在混合培養(yǎng)過程中，這兩種菌產(chǎn)生了抗真菌次級代謝產(chǎn)物從而抑制了其他真菌的生長。Knudsen[22]等人的研究則發(fā)現(xiàn)，某些真菌菌絲可以作為細菌運輸載體，刺激細菌的分裂與生長；Gorkem Akinci[23]等用復合硫桿菌對重金屬沉積物進行浸提，由于不同菌種的馴化效率差別以及菌種之間的拮抗作用，使得復合菌群的金屬溶解率最終低于單一菌。不同菌株之間的相互作用往往會對菌株生長及其作用造成影響，無拮抗作用是復合菌群構建及功能發(fā)揮的重要前提。根據(jù)結果顯示，本實驗中的菌株組合經(jīng)拮抗實驗后并未表現(xiàn)出拮抗作用。

2.3 菌種鑒定

從菌株形態(tài)上觀察，X8為細菌，L14為真菌。由于耐鉛鋅菌株均為真菌，因此本實驗選取L14作為復配菌株。

對L14進行進一步測序鑒定，將其測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對后，選取同源性相近的菌株，采用軟件MEGA繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，由系統(tǒng)發(fā)育樹圖1可知，L14與Fusarium oxysporum的進化關系最近。經(jīng)過BLAST比對，L14與Fusarium oxysporum的基因序列有100%的同源性。綜上，可將根際促生真菌L14鑒定為尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）。

圖1 L14菌株與相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of L14 and its relatives

2.4 重金屬脅迫下復合菌群蓖麻種子萌發(fā)的影響

2.4.1 萌發(fā)指標

由圖2可知，萌發(fā)率隨著重金屬濃度的升高而逐漸降低，這表明重金屬脅迫會嚴重影響蓖麻種子的萌發(fā)；相比于不加菌組，加菌組對萌發(fā)率會有一定的提升作用，且這種提升作用會隨著濃度的增加而增強。根長方面，除了100 mg/L濃度下加菌組略低于不加菌組，其他濃度下加菌組均優(yōu)于不加菌組，在0和400 mg/L時差異顯著；這表明該菌群可以有效促進根的生長，且在0和400 mg/L濃度下作用最為明顯。株高方面，在低濃度（0～200 mg/L）下，加菌組與不加菌組差異不顯著；在高濃度下，加菌組與不加菌組差異顯著，該差異隨著濃度增加而趨于顯著；這表明該菌群可以在高濃度鉛鋅脅迫下有效促進植物生長，且隨著濃度增加該促進作用愈趨明顯。在鮮重與干質量方面，在100 mg/L這兩項指標均達到最高，加菌組的鮮質量、干質量普遍大于不加菌組，且當濃度≥100 mg/L時，加菌組與不加菌組差異顯著，該差異隨著濃度增加而趨于顯著。這表明，該菌群可以在鉛鋅脅迫下顯著提高植物的生物量，且隨著濃度增加該促進作用愈趨明顯。

圖2 復合菌群對蓖麻種子萌發(fā)及幼苗生長的影響Fig.2 Effects of microbial consortium on seed germination and seedling growth of Ricinus communis L.

一般研究認為，Pb積聚在植物周圍會對植物產(chǎn)生毒害作用，影響種子萌發(fā)和植物生長；Zn雖然是生物體的必需元素，但高濃度的Zn也會對植物產(chǎn)生毒害作用[24]。又有研究表明，在低濃度條件下，部分重金屬離子反而會對種子萌發(fā)及植物生長產(chǎn)生一定的促進作用[25]。故而在100 mg/L濃度下，蓖麻幼苗的根長、株高及生物量達到最大；超過該濃度后，隨著濃度的提高，蓖麻種子萌發(fā)的各項指標都急劇下降。實驗中，添加了復合菌群的組別相比于沒有添加菌群的組別在各項指標上都有一定的提升，但在高濃度重金屬脅迫下，這種提升十分明顯，遠大于低濃度下的提升效果。Radwan Smiar S等[26]指出，植物根際促生菌主要通過兩種方式作用于植物，一是通過產(chǎn)生鐵載體等物質改變重金屬的生物有效性及轉移性，促進或抑制植物對重金屬的吸收；二是通過產(chǎn)生生長調節(jié)因子及酶類等提高植物養(yǎng)分吸收，促進植物生長。Chunyu Jiang[27]等研究還表明，某些耐性菌的接種能在不同程度上提高植物根際土壤水溶態(tài)、醋酸銨提取態(tài)重金屬的活性，增強植物對重金屬的吸收，從而促進植物生長。因而，該復合菌群對重金屬脅迫，尤其是高濃度重金屬脅迫下蓖麻種子萌發(fā)顯著的促進作用，很有可能是根際促生菌與重金屬耐性菌共同作用的結果。

2.4.2 根系形態(tài)

根據(jù)表2的相關結果可以發(fā)現(xiàn)，重金屬濃度以及是否添加復合菌群對于蓖麻幼苗根系發(fā)育會產(chǎn)生重要的影響。其中，當Pb2+、Zn2+濃度為0～200 mg/L時，根系各項指標加菌組和不加菌組之間差異不顯著；這表明在低濃度情況下，復合菌群的添加及重金屬濃度的差異對植物根系發(fā)育的影響不大。當濃度為400～600 mg/L與時，加菌組和不加菌組的在總根長、根體積、根尖數(shù)三個指標上差異顯著，這表明在高濃度重金屬脅迫下，復合菌群對蓖麻幼苗根系發(fā)育的促進作用十分明顯，能夠在高濃度環(huán)境下有效提高蓖麻幼苗的根系發(fā)育能力。根系吸收面積的擴大，一方面可以增加植物對養(yǎng)分的獲取來促進植物的生長，這也可能是本實驗中加菌組蓖麻各項萌發(fā)指標得到提升的原因；另一方面，還可以促進植物對重金屬的富集，提高宿主植物的抗逆性，提升植物修復效果[28]。

表2 復合菌群對蓖麻幼苗根系形態(tài)的影響?Table 2 Effects of microbial consortium on root morphology of Ricinus communis L. seedling

植物根系形態(tài)是一個重要的農(nóng)學和生態(tài)學指標，根系形態(tài)直接反映了根系的生長狀況。良好的根系形態(tài)不僅可以提高根系對土壤養(yǎng)分和水分的利用率，也是構建穩(wěn)定生態(tài)群落的基礎。植物根際微生物的活動，可以強烈影響金屬形態(tài)及其在環(huán)境中的運輸，從而促進根系發(fā)育，影響根系形態(tài)[29]。有研究進一步指出，這種對于非生物脅迫下植物根系發(fā)育及幼苗生長的有益效果，主要是這些微生物的活動導致植物根系中抗氧化活性增加的結果[30]。除此之外，復合菌群中的溶磷促生菌，也可能對植物根系發(fā)育產(chǎn)生了促進作用。鐘傳青等研究表明[31]，具有溶磷特性的微生物可以通過產(chǎn)生檸檬酸、琥珀酸、乳酸以及乙酸等有機酸，螯合磷礦粉中的金屬離子，從而使磷游離出來。溶磷菌通過該過程，將固定態(tài)磷轉化為有效磷，以供植物吸收利用，從而促進植物根系生長。

2.5 鉛鋅在蓖麻幼苗不同器官的吸收累積

蓖麻幼苗根系及地上部重金屬含量如圖3所示，從圖中可以看出，幼苗根部為鉛鋅的主要累積部位，在200 mg/L濃度下幼苗根部對Pb的最大累積達到1 050.68 mg/kg；由于Pb并非蓖麻生長的必需元素，且植物吸收后的Pb大部分固定在根部，固根部對Pb的吸收累積遠大于地上部分。根據(jù)圖3及其統(tǒng)計分析結果，加菌組根系對Pb的吸收有一定程度的提升（5.2%～38.6%），其中，在200、600 mg/L濃度下加菌組與不加菌組差異顯著，在200 mg/L濃度下加菌組對Pb的累積量提升最大，達到了38.6%。在濃度為400 mg/L時，Pb的累積量相比于200 mg/L有明顯下降，根據(jù)任繼凱等人的研究[32]，這可能是由于高濃度的Zn抑制了植物對Pb的吸收所致。

相比于Pb，植物地上部分對Zn的吸收明顯較高，展現(xiàn)出了一定的向上運輸能力，這可能與Zn為植物生長的必需元素有關。根據(jù)圖3及其統(tǒng)計分析結果，相比于不加菌組，加菌組根系對Zn的吸收有一定程度的提升（12.1%～25.2%），其中在400 、600 mg/L濃度下加菌組與不加菌組差異顯著，在400 mg/L濃度下加菌組對Zn的累積量提升最大，達到了25.2%。而在地上部分，除了極少濃度下莖、葉（0、200 mg/L濃度下莖以及100 mg/L濃度下葉）對Zn的吸收加菌組與不加菌組差異顯著外，其余濃度下莖、葉對Zn的吸收加菌組與不加菌組差異均不顯著。這表明，該菌群主要通過促進根系對重金屬的富集來促進植物對重金屬的富集，而對于其地上部分重金屬富集的提升效果不明顯。

圖3 蓖麻幼苗不同器官對重金屬的吸收累積Fig.3 Accumulation of heavy metals on different organs of Ricinus communis L. seedling

這種提升，一方面可能與根際微生物尤其是耐性菌的接種對土壤中水溶態(tài)重金屬活性的提升有關，另一方面，也可能與其促進了植物根系發(fā)育，從而增加了對重金屬的吸收有關[27,33]。另有研究表明，植物根尖為吸收重金屬的主要部位，根總長則決定了植物根系的吸收能力，它們都會對重金屬的吸收累積起到關鍵作用[34-35]；故表2中根總長、根尖數(shù)的顯著差異，可能是根系中加菌組重金屬富集量顯著提升的直接原因。蓖麻幼苗對重金屬的吸收累積結果表明，該復合菌群可以有效地促進鉛鋅脅迫下蓖麻種子的萌發(fā)及對重金屬的富集，可以作為下一步功能菌群-植物聯(lián)合修復的供試菌群對鉛鋅礦渣進行聯(lián)合修復。

3 結論與討論

3.1 結 論

雖然國內外有大量的關于植物-微生物聯(lián)合修復重金屬污染的報道，但鮮見對復合功能菌群與植物聯(lián)合修復的報道。本實驗以課題組前期工作為基礎，從菌肥改良后的植物根系土壤中篩選出了溶磷真菌L14尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum。經(jīng)拮抗試驗后與實驗室另有的2株耐性真菌構建復合功能菌群，考查了其對鉛鋅脅迫下蓖麻種子萌發(fā)的影響。該復合菌群接種到基質后，能在高濃度重金屬脅迫下有效促進蓖麻種子萌發(fā)及幼苗生長，同時促進其根系對重金屬的富集。其中，對Pb的累積量最大可提升38.6%，對Zn的累積量最大可提升25.2%。分析結果表明，該復合菌群在鉛鋅脅迫下不僅能夠促進蓖麻種子萌發(fā)及幼苗生長，還可以顯著提高幼苗根系對重金屬的吸收累積。

3.2 討 論

已有研究表明，功能菌群中的微生物能夠通過相互交流和分工行使不同的復雜功能，更加適應環(huán)境變化；基于其微生物群落生態(tài)學原理，功能菌群在增加植物生物量、提高生物修復效果等方面效果顯著。長期以來，聯(lián)合修復多采用單一細菌，其生長易受到營養(yǎng)物質和外界毒害作用的限制，故本實驗采用了復合真菌作為供試微生物[36]。

事實上，已有研究人員對于微生物生物修復鉛鋅礦渣的效果進行了研究，易心鈺等的研究指出，在純鉛鋅礦渣上播種蓖麻種子后，20 d后其種子萌發(fā)率為70.83%，而平均干重為0.2 g/株；本實驗中8 d后加菌組種子萌發(fā)率即便在高濃度（600 mg/L）重金屬脅迫下，也能夠達到60%以上的萌發(fā)率，而當重金屬濃度≤200 mg/L時，萌發(fā)率更是達到了80%以上，其平均干重也接近0.2 g/株，考慮到生長時間的差異，該復合菌群的添加對于鉛鋅脅迫下蓖麻種子萌發(fā)的促進效果較為優(yōu)秀。

重金屬離子對于根生長的抑制、對根形態(tài)及根體積的改變，會對其富集重金屬產(chǎn)生不利的影響；另一方面，土壤中重金屬元素較低的生物利用度也會阻礙植物對重金屬的吸收[25]。作為一種被廣泛應用的重金屬修復植物，蓖麻對重金屬的富集能力有限，但耐性很強。實驗中向蓖麻幼苗的根系中接種了同時具有促生能力和重金屬耐性的復合菌群，不僅促進植物了生長，同時也增加幼苗對重金屬的吸收，這與Wenhui Zhang[37]的研究結果相一致。另有研究指出[10]，蓖麻在純鉛鋅礦渣下對Pb的累積量可達778.09 mg/kg、對Zn的累積量可達803.43 mg/kg；而本研究中蓖麻對Pb最大累積量可達1146.06 mg/kg，對Zn的累積量最大可達810.19 mg/kg，對比而言，復合菌群的添加對于蓖麻富集鉛鋅的能力有一定的提升。

本實驗直接將功能菌群接種到植物根系中，探究了功能菌群-植物聯(lián)合修復的實際效果，此技術在生物修復領域鮮有報道，具有一定的創(chuàng)新。其實驗結果不僅為下一步大規(guī)模盆栽實驗提供了功能菌群，同時也為功能菌群-植物聯(lián)合修復提供了理論支撐。但是，Jixiang Lin[38]等人的研究還進一步指出，根際微生物及其復合菌群的使用，還可以在其他非生物脅迫環(huán)境下促進植物根系的生長，諸如鹽堿壓力和氮沉積等，故而該復合菌群的更多特點還有待進一步研究。且本文是以種子萌發(fā)階段的發(fā)育情況和重金屬富集量為指標，來反映菌群對植物的影響及其原因，對挑選出的菌群進行初步的聯(lián)合修復探究，并沒有完整體現(xiàn)成熟植株在整個生長過程中受復合菌群影響而可能產(chǎn)生的情況。故該聯(lián)合體系更多的功能和作用有待開展盆栽實驗以作進一步檢驗。

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[本文編校：吳 彬]

Construction of microbial consortium and its effects on seed germination and lead-zinc accumulation ofRicinus communisL. under lead-zinc stress

LI Yanfenga, FENG Chonglinga, LI Kelina, PENG Tianyia, HE Shujiaoa, ZHANG Huana, ZHOU Taob
(a. College of Environmental Science and Engineering; b. College of Life Sciences and Technology, Central South University of Forestry& Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

In order to investigate the effects of lead-zinc resistant microbial consortium on seed germination ofRicinus communisL.which would be used to construct a functional microbial consortium for the further study ofRicinus communisL.-microbial remediation.The screened rhizospheric microorganisms in microbial fertilizer improved rhizosphere soil were carried out a plate antagonism test with the preserved strains in our laboratory for a gene sequence analysis to construct the functional microbial consortium. Moreover,a pot experiment of the seed ofRicinus communisL. under lead-zinc stress was conducted to analyze the effect of the germination percentage, growth indicators, heavy metal accumulation, and the root morphologyon the inoculation of microbial consortium. The obtained phosphate-solubilizing fungi L14 was identified asFusarium oxysporum. There is nonantagonistic effect among the microbial consortium composed by the screened fungi and the preserved 2 strains (HA, J3) strains in our laboratory. After inoculating into substrate, the microbial consortium can effectively promote seed germination and seedling growth ofRicinus communisL. under heavy metal stress of a high concentration. Meanwhile, the maximum accumulation of heavy metal in root can be increased by 38.6% for Pb as well as 25.2% for Zn. The microbial consortium not only could promote seed germination and seedling growth, but also obviously improve the root accumulation of heavy metal inRicinus communisL. seedling under lead-zinc stress.

Lead-zinc; Microbial consortium;Ricinus communisL.; Seed germination; Accumulation

S719；X172 文獻標志碼：A 文章編號：1673-923X(2017)10-0045-09

10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.10.008

http: //qks.csuft.edu.cn

2016-07-04

湖南省重點研發(fā)計劃（2016SK2045）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目（CX2016B325）；中南林業(yè)科技大學研究生科技創(chuàng)新基金（CX2016B11）；湖南省高校重點實驗室創(chuàng)新平臺開放基金項目（10K82）

李雁峰，碩士研究生

李科林，教授，博士；E-mail：csfuklli@163.com

李雁峰，馮沖凌，李科林，等. 復合功能菌群的構建及其對鉛鋅脅迫下蓖麻種子萌發(fā)和鉛鋅積累的影響[J].中南林業(yè)科技大學學報，2017, 37(10): 45-53.