白轉(zhuǎn)麗+都慧聰+耿文鑫

[摘要]目的：設(shè)計(jì)、制備透皮型彈性蛋白樣多肽（elastin-like polypeptide， ELP）融合蛋白，探索其作為皮膚美容制劑的潛能。方法：設(shè)計(jì)具有透皮特性的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能域（protein transduction domain， PTD）和ELP融合蛋白PTD-ELP，聯(lián)合密碼子優(yōu)化、重疊延伸PCR和定向遞歸連接等技術(shù)構(gòu)建其原核表達(dá)載體。在此基礎(chǔ)上將該載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，進(jìn)行異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-Thiogalactoside， IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)并對(duì)目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位和可溶性進(jìn)行分析。結(jié)果：成功構(gòu)建了攜帶PTD-ELP讀碼框架的原核表達(dá)載體，攜帶該載體的大腸桿菌在IPTG誘導(dǎo)5h時(shí)PTD-ELP融合蛋白的表達(dá)量達(dá)到峰值，約占菌體總蛋白的23.6%；亞細(xì)胞定位分析表明PTD-ELP融合蛋白主要以包涵體形式在胞內(nèi)表達(dá)。結(jié)論：成功設(shè)計(jì)并構(gòu)建了能夠表達(dá)PTD-ELP融合蛋白的原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了其高效表達(dá)，為深入探討PTD介導(dǎo)的ELP透皮給藥在逆轉(zhuǎn)皮膚衰老和預(yù)防、治療光老化中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]彈性蛋白樣多肽；蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能域；原核表達(dá)；重組蛋白

[中圖分類號(hào)]Q591.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2017）10-0064-04

Abstract： Objective To design and express an elastin-like polypeptide （ELP） fusion protein which can be transcutaneously delivered to skin tissues to explore its potential as a skin cosmetics agent in the future. Methods A protein transduction domain （PTD）-ELP fusion protein with transdermal properties was designed and back-translated with E.coli-preferred codons. And its expression vector was constructed by overlap extension PCR and recursive directional ligation. After transforming the vector into Escherichia coli cells， the PTD-ELP protein was expressed by IPTG induction and the subcellular location and the solubility of the recombinant protein were analyzed. Results A prokaryotic vector containing PTD-ELP-coding cassette was successfully constructed as designed. And the E.coli cells harboring the vector could express the fusion protein after IPTG induction， which reached the highest level at 5h post induction with amount of 23.6% of total bacterial proteins. Further analysis demonstrated that PTD-ELP protein was subcellularly located in cytoplasm as insoluble inclusion bodies. Conclusion The recombinant prokaryotic expression vector was constructed successfully and the PTD-ELP fusion protein was efficiently expressed in Escherichia coli cells. These results laid a foundation for further investigating whether PTD-mediated transdermal delivery of ELP could prevent skin aging and reverse photoaging.

Key words： elastin-like polypeptide； protein transduction domain； prokaryotic expression； fusion protein

彈性蛋白是在維持皮膚組織結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，其約占皮膚總蛋白成分的2%[1-2]。彈性蛋白前體是由成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞合成并分泌的、分子量約為60～72kDa的可溶性彈性蛋白原，后者可在賴氨酰氧化酶的作用下發(fā)生分子內(nèi)和分子間交聯(lián)形成不溶性彈性蛋白，進(jìn)而維持皮膚彈性[3]。彈性蛋白在人體內(nèi)的合成從出生開始逐漸升高到青春期達(dá)到峰值，此后迅速下降。相關(guān)研究證實(shí)[4]，在光老化過(guò)程中，基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)上調(diào)從而引發(fā)彈性蛋白降解，致使皮膚組織出現(xiàn)日光性彈力纖維變性?；瘖y品中添加動(dòng)物組織源性的彈性蛋白水解產(chǎn)物用于延緩皮膚衰老、對(duì)抗光老化、促進(jìn)皮膚細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)皮膚年輕化等由來(lái)已久，然而動(dòng)物源性蛋白存在人畜共患病風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)彈性蛋白因分子量較大而難以穿越表皮屏障進(jìn)入淺表真皮組織發(fā)揮其生物學(xué)作用[5]。因此使用基因工程技術(shù)設(shè)計(jì)、制備具有透皮能力的重組彈性蛋白具有重要意義。endprint

1 材料和方法

1.1 材料：原核表達(dá)載體pET28a購(gòu)自Novagen公司；克隆載體pSP73購(gòu)自Promega公司，ER2566購(gòu)自NEB公司；限制性核酸內(nèi)切酶Nco I、Xho I、BamH I和Bgl II、T4 DNA Ligase、Pyrobest DNA Polymerase購(gòu)自Takara公司；IPTG、Tris和SDS購(gòu)自Amresco公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺購(gòu)自Sigma公司；GeneRuler DNA Ladder Mix和PageRuler Prestained Protein Ladder購(gòu)自Fermentas公司；引物pPTD1： 5-TTT CTC GAG TGC GGC CGC AAG CTT GTC GAC GGA GCT CGA ATT CGG ATC CAC GAC GAC GC-3， pPTD2： 5-GCC GTG GTT ATG GCC GTA AGA AAC GTC GTC AGC GTC GTC GTG GAT CCG AAT TCG AGC TC-3， pPTD3： 5-CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC GGC ATT GAA GGC CGT GGT TAT GGC CGT AAG AAA CGT CG-3， pPTD4： 5-AAA CCA TGG GCA GCA GCC ATC ATC ATC ATC ATC ACA GCG GCA TTG AAG G-3， pELP1：5-AAA AGA TCT GTG GCG CCG GGC GGT GTT GCG CCG GGC GTG GGT CTC GCG CCG-3和pELP2：5‘-AAA CTC GAG CTA TTA GGA TCC TAC GCC CGG CGC GAG ACC CAC GCC CGG CGC-3由上海鼎安生物科技有限公司合成。

1.2 構(gòu)建原核表達(dá)載體pPTD：配置反應(yīng)體系（10×Pyrobest BufferⅡ5.0μl，dNTP4.0μl，Pyrobest DNA Polymerase0.25μl，濃度為10μM的引物pPTD1和pPTD4各1.0μl，濃度為1μM的引物pPTD2和pPTD3各1.0μl，加去離子水至終體積為50μl），進(jìn)行重疊延伸PCR。循環(huán)參數(shù)為變性30s，退火30s，延伸30s，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后使用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切后克隆至pET28a的相應(yīng)酶切位點(diǎn)之間獲得pPTD，經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)。

1.3 ELP編碼序列的設(shè)計(jì)和構(gòu)建：根據(jù)人彈性蛋白特有基序VAPGXG設(shè)計(jì)ELP氨基酸序列為VAPGVGVAPGVGVAPGVGS，使用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子反翻譯為cDNA序列，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物pELP1和pELP2，進(jìn)行重疊延伸PCR后以Bgl II和Xho I雙酶切后克隆至pSP73的相應(yīng)酶切位點(diǎn)獲得pSP73-3ELP，經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)后使用定向遞歸連接技術(shù)構(gòu)建pSP73-96ELP。

1.4 PTD-96ELP原核表達(dá)載體的構(gòu)建：利用Bgl II和BamH I能夠酶切產(chǎn)生相同的粘端，使用Bgl II和Xho I將96ELP從pSP73-96ELP上切下并克隆至pPTD的BamH I和Xho I之間獲得原核表達(dá)載體pPTD-96ELP，經(jīng)Bgl II和Xho I雙酶切鑒定后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PTD-96ELP在大腸桿菌ER2566中的誘導(dǎo)表達(dá)：使用pPTD-96ELP轉(zhuǎn)化ER2566感受態(tài)細(xì)胞并涂布在含30μg/ml卡那霉素的LB瓊脂平板。經(jīng)37℃過(guò)夜培養(yǎng)篩選后，挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落接種于含30μg/ml卡那霉素的LB中，置于37℃、220rpm條件下振蕩培養(yǎng)12h獲得種子液。將種子液用含30μg/ml卡那霉素的LB以1：100比例稀釋，置于37℃、220rpm條件下振蕩培養(yǎng)2h，加入1M IPTG至終濃度為1mM進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別在誘導(dǎo)3h、4h、5h、6h、7h和8h時(shí)收獲樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.6 PTD-96ELP表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析：將200ml誘導(dǎo)后菌液在4℃、2 000g條件下離心15min，收獲菌體并重懸于20ml去離子水中。在-20℃～37℃反復(fù)凍融3次后超聲破碎菌體，超聲條件為400W，工作5s，間隔5s，重復(fù)200次。在4℃、16 000g條件下離心30min，分別取上清和沉淀制樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.7 PTD-96ELP表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位分析：將200ml誘導(dǎo)后菌液在4℃、2 000g條件下離心15min，收獲菌體并重懸于高滲液（pH8.0，30mM Tris-HCl，1mM EDTA，20%蔗糖）中，室溫?cái)嚢?0min。在4℃、2 000g條件下離心15min，收獲菌體重懸于預(yù)冷的5mM MgSO4中，冰浴攪拌10min后4℃、10 000g條件下離心15min，分別取上清和沉淀制樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果

2.1 PTD-96ELP的設(shè)計(jì)：如圖1所示，PTD-ELP融合蛋白由4個(gè)功能域構(gòu)成，從氨基端到羧基端分別為：①組氨酸標(biāo)簽，用于檢測(cè)和純化融合蛋白；②X因子a識(shí)別位點(diǎn)，用于最終切除組氨酸標(biāo)簽；③來(lái)源于HIV反式轉(zhuǎn)錄激活因子（transactivator of transcription， TAT）的PTD，用于介導(dǎo)ELP穿越表皮屏障；④32倍串聯(lián)重復(fù)的VAPGVGVAPGVGVAPGVGS，用于發(fā)揮彈性蛋白樣生物學(xué)作用。

2.2 pPTD-96ELP的鑒定和測(cè)序分析結(jié)果：對(duì)原核表達(dá)載體pPTD-96ELP進(jìn)行Bgl II和Xho I雙酶切鑒定可見(jiàn)約2000bp新生條帶（圖2），與預(yù)期相符；pPTD-96ELP中的目標(biāo)蛋白開放讀碼框架如圖3所示，進(jìn)一步DNA測(cè)序證實(shí)插入序列與設(shè)計(jì)完全相符（圖4）。endprint

2.3 PTD-96ELP在ER2566中的誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果：如圖5所示，SDS-PAGE分析表明，攜帶pPTD-96ELP的ER2566工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可表達(dá)分子量約為53kDa的新生蛋白，與預(yù)期相符；同時(shí)，目標(biāo)蛋白的表達(dá)量在IPTG誘導(dǎo)5h時(shí)達(dá)到峰值，約占菌體總蛋白的23.6%，進(jìn)一步延長(zhǎng)誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間并不能提高蛋白表達(dá)量。

2.4 PTD-96ELP表達(dá)產(chǎn)物可溶性分析結(jié)果：如圖6所示，SDS-PAGE分析表明，攜帶pPTD-96ELP的ER2566工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5h后目標(biāo)蛋白主要位于細(xì)胞內(nèi)，而周質(zhì)空間內(nèi)幾乎沒(méi)有目標(biāo)蛋白。同時(shí)，目標(biāo)蛋白主要位于菌體超聲裂解后的沉淀中，提示該蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。

3 討論

鑒于具有串聯(lián)重復(fù)序列的蛋白常因特定tRNA豐度的限制而難于表達(dá)，本研究使用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子對(duì)VAPGVGVAPGVGVAPGVGS基本單元的編碼序列進(jìn)行了修飾，并在此基礎(chǔ)上使用定向遞歸克隆技術(shù)制備了ELP串聯(lián)重復(fù)序列cDNA并將之與PTD編碼序列融合，構(gòu)建了能夠表達(dá)重組PTD-ELP融合蛋白的原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了PTD-ELP高效表達(dá)。

彈性蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)中富含有VPGXG和VAPGXG基序，其中X為除脯氨酸外的任意氨基酸。目前由人彈性蛋白第24個(gè)外顯子編碼的VGVAPG寡肽已經(jīng)廣泛用做美容護(hù)膚品添加劑[6-8]，其能夠通過(guò)與分子量為67kDa的高親和性彈性蛋白受體結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)活性[9]。大量研究證實(shí)VGVAPG寡肽不但能夠趨化成纖維細(xì)胞，還能刺激人皮膚成纖維細(xì)胞增殖[10]，而VPGVG及其多聚體則無(wú)此作用[11]。同時(shí)，VGVAPG寡肽能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移和分化[12]。此外，VGVAPG寡肽能促進(jìn)人血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和成管，表明其能促進(jìn)血管生成[13]。最近研究發(fā)現(xiàn)VGVAPG寡肽能通過(guò)激活I(lǐng)GF-1受體上調(diào)彈性蛋白表達(dá)并促進(jìn)彈性組織生成[14]，并且含有（VGVAPG）3基序的多肽能上調(diào)彈性蛋白和膠原蛋白在人皮膚成纖維細(xì)胞和人皮膚組織體外培養(yǎng)物中的表達(dá)[15]。這些資料表明含有VGVAPG基序的多肽具有對(duì)抗皮膚衰老和促進(jìn)皮膚組織再生的功能。本研究采用的VAPGVGVAPGVGVAPGVGS基本單元中含有兩個(gè)VGVAPG基序，因此在理論上融合蛋白PTD-ELP也能夠通過(guò)刺激成纖維細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移和分化、促進(jìn)血管生成以及上調(diào)彈性蛋白和膠原蛋白表達(dá)等多種機(jī)制改善皮膚質(zhì)量、延緩皮膚衰老，并極具潛力成為一種安全、高效的美容生物制劑。

表皮屏障雖然能保護(hù)皮膚組織免受外界物理化學(xué)損傷，但是也限制了功能分子的經(jīng)皮給藥效率。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，HIV TAT-PTD、PEP-1和IMT-P8多種不同來(lái)源的PTD均能夠賦予與之融合表達(dá)的蛋白分子穿越表皮屏障的能力[16-18]。為了能夠獲得高效原核表達(dá)，本研究中選用了報(bào)道數(shù)量較多、透皮能力確切、長(zhǎng)度僅為11個(gè)氨基酸殘基的TAT-PTD[16，19-21]。為了實(shí)現(xiàn)重組PTD-ELP在大腸桿菌中的高效表達(dá)，使用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子對(duì)PTD和ELP編碼序列進(jìn)行了改造。雖然結(jié)果顯示密碼子優(yōu)化后PTD-ELP的表達(dá)量較高，但是目標(biāo)蛋白主要存在于包涵體中，必須在溶解包涵體后才能應(yīng)用ELP的溫度依賴性相變作用進(jìn)行規(guī)模純化。因此優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)工藝以實(shí)現(xiàn)PTD-ELP的可溶性表達(dá)將是下一步工作的研究重點(diǎn)。

綜上所述，本研究設(shè)計(jì)了具有透皮能力的PTD-ELP蛋白，聯(lián)合密碼子優(yōu)化和定向遞歸連接技術(shù)構(gòu)建了其原核表達(dá)載體，并實(shí)現(xiàn)了PTD-ELP在大腸桿菌中的高效表達(dá)，不僅建立了相對(duì)簡(jiǎn)單的ELP串聯(lián)重復(fù)序列構(gòu)建方法，而且為深入探討ELP透皮給藥在對(duì)抗皮膚衰老和促進(jìn)皮膚年輕化中的作用奠定了基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Widgerow AD，F(xiàn)abi SG，Palestine RF，et al.Extracellular Matrix Modulation： Optimizing Skin Care and Rejuvenation Procedures[J].J Drugs Dermatol，2016，15（4 Suppl）：s63-71.

[2]Almine JF，Wise SG，Weiss AS.Elastin signaling in wound repair[J].Birth Defects Res C Embryo Today，2012，96（3）：248-257.

[3]Theocharis AD，Skandalis SS，Gialeli C，et al.Extracellular matrix structure[J]. Adv Drug Deliv Rev，2016，97：4-27.

[4]Weihermann AC，Lorencini M，Brohem CA，et al.Elastin structure and its involvement in skin photoageing[J].Int J Cosmet Sci，2016，39（3）：241-247.

[5]Pai VV，Bhandari P，Shukla P.Topical peptides as cosmeceuticals[J].Indian J Dermatol Venereol Leprol，2017，83（1）：9-18.

[6]Husein El Hadmed H，Castillo RF.Cosmeceuticals： peptides， proteins， and growth factors[J].J Cosmet Dermatol，2016，15（4）：514-519.

[7]Zhang L，F(xiàn)alla TJ.Cosmeceuticals and peptides[J].Clin Dermatol，2009，27（5）： 485-494.endprint

[8]Reddy B，Jow T，Hantash BM.Bioactive oligopeptides in dermatology： Part I[J].Exp Dermatol，2012，21（8）：563-568.

[9]Floquet N，Hery-Huynh S，Dauchez M，et al.Structural characterization of VGVAPG， an elastin-derived peptide[J].Biopolymers，2004，76（3）：266-280.

[10]Chatron-Colliet A，Lalun N，Terryn C，et al.The elastin peptide （VGVAPG） induces the 3D reorganisation of PML-NBs and SC35 speckles architecture， and accelerates proliferation of fibroblasts and melanoma cells[J].Histochem Cell Biol，2015，143（3）： 245-258.

[11]Tajima S，Wachi H，Uemura Y，et al.Modulation by elastin peptide VGVAPG of cell proliferation and elastin expression in human skin fibroblasts[J].Arch Dermatol Res，1997，289（8）：489-492.

[12]Fujimoto N，Tajima S，Ishibashi A.Elastin peptides induce migration and terminal differentiation of cultured keratinocytes via 67 kDa elastin receptor in vitro： 67 kDa elastin receptor is expressed in the keratinocytes eliminating elastic materials in elastosis perforans serpiginosa[J].J Invest Dermatol，2000，115（4）：633-639.

[13]Robinet A，F(xiàn)ahem A，Cauchard JH，et al.Elastin-derived peptides enhance angiogenesis by promoting endothelial cell migration and tubulogenesis through upregulation of MT1-MMP[J].J Cell Sci，2005，118（Pt 2）：343-356.

[14]Qa'aty N，Vincent M，Wang Y，et al.Synthetic ligands of the elastin receptor induce elastogenesis in human dermal fibroblasts via activation of their IGF-1 receptors [J].J Dermatol Sci，2015，80（3）：175-185.

[15]Attia-Vigneau J，Terryn C，Lorimier S，et al.Regeneration of human dermis by a multi-headed peptide[J].J Invest Dermatol，2014，134（1）：58-67.

[16]Chen X，Liu S，Rao P，et al.Topical application of superoxide dismutase mediated by HIV-TAT peptide attenuates UVB-induced damages in human skin[J].Eur J Pharm Biopharm，2016，107：286-294.

[17]Gautam A，Nanda JS，Samuel JS，et al.Topical Delivery of Protein and Peptide Using Novel Cell Penetrating Peptide IMT-P8[J].Sci Rep，2016，6：26278.

[18]Nasrollahi SA，Taghibiglou C，Azizi E，et al.Cell-penetrating peptides as a novel transdermal drug delivery system[J].Chem Biol Drug Des，2012，80（5）：639-646.

[19]Liu TP，Chen YP，Chou CM，et al.Therapeutic evaluation of HIV transduction basic domain-conjugated superoxide dismutase solution on suppressive effects of the formation of peroxynitrite and expression of COX-2 in murine skin[J].J Biomed Sci， 2016，23：11.

[20]Song HY，Lee JA，Ju SM，et al.Topical transduction of superoxide dismutase mediated by HIV-1 Tat protein transduction domain ameliorates 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate （TPA）-induced inflammation in mice[J]. Biochem Pharmacol，2008，75（6）：1348-1357.

[21]Uchida T，Kanazawa T，Takashima Y，et al.Development of an efficient transdermal delivery system of small interfering RNA using functional peptides， Tat and AT-1002 [J].Chem Pharm Bull（Tokyo），2011，59（2）：196-201.

[收稿日期]2017-08-21 [修回日期]2017-09-06

編輯/朱婉蓉endprint