地里夏提·庫爾班

[摘要]目的：探討微小RNA-21（miRNA-21）基因與轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）基因在正常皮膚組織和增生性瘢痕組織中的表達(dá)，并分析其相關(guān)性。方法：選取本院燒傷整形科收治的16例燒傷整形患者的增生性瘢痕組織及其臨近的正常皮膚組織，提取組織中的總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）技術(shù)分別檢測增生性瘢痕組織和正常組織中miRNA-21與TGF-β1基因表達(dá)量，對檢測結(jié)果進(jìn)行分析比較，并行相關(guān)性分析。結(jié)果：增生性瘢痕組織中miRNA-21基因表達(dá)明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其表達(dá)水平是正常皮膚組織的2.18倍；增生性瘢痕中TGF-β1的表達(dá)量多于正常皮膚組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其表達(dá)水平是正常皮膚組織的2.31倍；增生性瘢痕組織中miRNA21基因表達(dá)量與TGF-β1基因表達(dá)量呈正相關(guān)（r=0.836，P<0.01）。結(jié)論：增生性瘢痕組織中miRNA-21和TGF-β1基因表達(dá)異常，可能與瘢痕組織形成相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]增生性瘢痕；微小RNA21；TGF-β1

[中圖分類號(hào)]R619+.6 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2017）10-0068-03

Abstract： Objective To investigate the expression of microRNA-21 （miRNA-21） gene and transforming growth factor-β（TGF-β1） gene in normal skin and hypertrophic scar tissue， and to analyze its correlation. Methods Collected from 16 hypertrophic scar tissues and adjacent normal skin tissues formed by burn and plastic surgery department in our hospital， total RNA was extracted from normal tissues and Hypertrophic scar tissue. The expressions of miRNA-21 and TGF-β1 gene in hypertrophic scar tissue and normal tissue were detected by RT-qPCR. The detection results were analyzed and compared， and the correlation analysis was carried out. Results The expression of miRNA-21 gene in hypertrophic scar tissue was significantly up-regulated， the difference was statistically significant（P<0.05）， its expression level was 2.18 times of normal skin tissue. The expression of TGF-β1 in hypertrophic scar was higher than that in normal skin tissue（P<0.05）. The expression level of TGF-β1 was 2.31 times higher than that of normal skin tissue. There was a positive correlation between the expression of miRNA-21 gene and the expression of TGF-β1 gene in hypertrophic scar tissue（r=0.836， P<0.01）. Conclusion The abnormal expression of miRNA-21 and TGF-β1 gene in hypertrophic scar tissue may be related to the formation of scar tissue.

Key words： hypertrophic scar； microRNA-21； TGF-β1

增生性瘢痕是傷口表皮愈合過程中組織過度增生而引起的病理性瘢痕，不具備正常皮膚結(jié)構(gòu)和生理功能。嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷及外科手術(shù)后常并發(fā)程度不等的增生性瘢痕，影響外貌美觀，甚至可導(dǎo)致嚴(yán)重畸形及功能障礙，降低患者生活質(zhì)量。具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。但有研究表明，增生性瘢痕主要與成纖維細(xì)胞異常增殖及凋亡抑制、分泌和釋放的正向及負(fù)向細(xì)胞因子調(diào)節(jié)機(jī)制的異常，以及細(xì)胞外基質(zhì)膠原合成與降解的失平衡有關(guān)，包括整合素、TGF-β和miRNA的異常表達(dá)[1-2]。在增生性瘢痕與正常皮膚組織微小RNA芯片及基因芯片檢測研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA-21和TGF-β1在增生性瘢痕與正常皮膚組織中存在差異表達(dá)，可能與增生性瘢痕組織的發(fā)生、發(fā)展及演化密切相關(guān)[3]。但關(guān)于miRNA-21與TGF-β1基因在增生性瘢痕形成過程中是否起協(xié)同作用，目前相關(guān)研究報(bào)道尚罕見。且以往關(guān)于TGF-β1的研究多局限于免疫組化、原位雜交或半定量水平的研究。本研究通過熒光定量PCR法測定增生性瘢痕組織和正常組織中miRNA-21與TGF-β1的基因表達(dá)水平，了解miRNA-21與TGF-β1在增生性瘢痕組織與正常組織中的表達(dá)差異，分析兩者與增生性瘢痕組織病理發(fā)展的相關(guān)性。endprint

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源：收集本院2016年1月到2017年5月收治的16例燒傷整形患者術(shù)中切取的增生性瘢痕組織和臨近正常皮膚組織。其中男9例，女7例，年齡18～60歲；致傷部位：頜面部6例，上臂4例，膝關(guān)節(jié)2例，大腿4例；瘢痕面積：4.0cm×3.0cm～6.0cm×5.5cm。納入標(biāo)準(zhǔn)：①瘢痕增生時(shí)間為9～18個(gè)月，局部皮膚色澤鮮紅，質(zhì)地較硬；②發(fā)病后未長時(shí)間服用瘢痕增生抑制藥物，包括放射或注射治療；③無全身系統(tǒng)性纖維化、腫瘤等病史，術(shù)前1個(gè)月內(nèi)未使用激素類藥物；④患者均知情同意，自愿簽署知情同意書。本次研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 試劑：Trizol試劑購自日本Takara公司；PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購自日本Takara公司；微小RNA分離試劑購自ABI公司；實(shí)時(shí)定量RT-qPCR儀購自美國ABI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RNA制備：從液氮中取出標(biāo)本約100mg，用移液器吸取1ml Trizol溶液加入到組織中，于冰上研磨攪勻，后續(xù)RNA提取步驟參照Trizol試劑盒說明?？俁NA在紫外分光光度計(jì)上檢測260nm、280nm波長處的吸光度（A）值，并計(jì)算A260/A280比值，采用1.8～2.0者進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。cDNA的合成嚴(yán)格按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進(jìn)行，將產(chǎn)物cDNA凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 RT-qPCR檢測mRNA表達(dá)水平：采用美國ABI公司RT-PCR儀檢測mRNA表達(dá)水平。建立總體積20μl反應(yīng)體系：包括10μl SYBR熒光（定量）染料，2μl cDNA，0.4μl ROX 染料，7.1μl ddH2O，上下游引物各為0.25μl，引物序列見表1。定量PCR的反應(yīng)條件：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)用Ct值表示。每份標(biāo)本均作復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后作熔解曲線。ΔCt=目的基因Ct值-減去內(nèi)參Ct值，2-ΔΔCt值表示目的基因mRNA表達(dá)水平的高低。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示miRNA-21與TGF-β1 mRNA表達(dá)水平，行配對t檢驗(yàn)，變量間相關(guān)關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-21基因表達(dá)量測定結(jié)果：增生性瘢痕組織中miRNA-21的2-ΔΔCt值為2.88±0.15，正常皮膚組織miRNA-21的2-ΔΔCt值為1.32±0.23，表明增生性瘢痕組織中miRNA-21的表達(dá)量高于正常皮膚組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.12，P=0.03）；且增生性瘢痕組織與正常皮膚的miRNA-21比值為2.18，表明增生性瘢痕組織中miRNA-21基因表達(dá)量是正常皮膚組織的2.18倍。見表2。

2.2 TGF-β1基因表達(dá)量測定結(jié)果：增生性瘢痕組織TGF-β1的2-ΔΔCt值為0.827±0.085，正常皮膚組織TGF-β1的2-ΔΔCt值為0.357±0.079，表明增生性瘢痕組織中TGF-β1的表達(dá)量高于正常皮膚組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.17，P=0.04）；增生性瘢痕組織與正常皮膚的TGF-β1比值為2.31，表明增生性瘢痕組織中TGF-β1基因表達(dá)量是正常皮膚組織的2.31倍。見表2。

2.3 增生性瘢痕組織中miRNA-21和TGF-β1的關(guān)系：增生性瘢痕組織中miRNA-21基因表達(dá)量與TGF-β1基因表達(dá)量呈正相關(guān)（r=0.836，P<0.01）。

3 討論

曾有研究報(bào)道，增生性瘢痕與miRNA的異常表達(dá)密切相關(guān)[4]。通過對人增生性瘢痕組織中miRNA表達(dá)譜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中一部分miRNA表達(dá)與正常皮膚組織中存在顯著差異，其中miRNA-21表達(dá)差異較明顯，且較多研究已證實(shí)miRNA-21在增生性瘢痕組織中表達(dá)異常高于正常組織[5]。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miRNA-21拮抗劑可以顯著減少增生性瘢痕的瘢痕面積和瘢痕厚度[6]。miRNA-21廣泛存在于植物、線蟲和人類細(xì)胞中，其作為內(nèi)源性調(diào)控性RNA，通過基因調(diào)節(jié)參與生命中的重要進(jìn)程，如早期胚胎發(fā)生、細(xì)胞增殖、細(xì)胞生存及凋亡、細(xì)胞代謝、能量平衡等[7-8]，在腫瘤、增生性瘢痕形成與發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用[9-10]。細(xì)胞核內(nèi)miRNA-21是由RNA多聚酶Ⅱ、Ⅲ催化轉(zhuǎn)錄生成初始微小RNA，再經(jīng)核酸Dicer酶加工成前體miRNA，然后被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)經(jīng)Dicer酶剪切為成熟的miRNA-21。成熟miRNA-21的單鏈可以選擇性結(jié)合RNA，誘導(dǎo)沉默復(fù)合體生成，結(jié)合靶基因，導(dǎo)致靶基因mRNA裂解或抑制靶基因蛋白翻譯，參與轉(zhuǎn)錄后基因和蛋白表達(dá)水平調(diào)節(jié)[11]。本次研究結(jié)果顯示，miRNA-21在增生性瘢痕組織中的表達(dá)顯著高于正常皮膚組織，即miRNA-21在人增生性瘢痕中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)量是正常皮膚組織的2.18倍。miRNA-21作為一種可調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性小分子RNA，可能通過調(diào)節(jié)增生性瘢痕的靶基因或蛋白來影響細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化、凋亡等過程。這與胡洋紅等研究結(jié)論基本一致[12]，即miRNA-21在增生性瘢痕與正常皮膚組織中存在差異表達(dá)，且增生性瘢痕組織中表達(dá)顯著高于正常皮膚組織。

皮膚真皮層是由大量作為支架的細(xì)胞外基質(zhì)及少量細(xì)胞、表皮等構(gòu)成。其中Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，增生性瘢痕組織主要是由機(jī)體修復(fù)細(xì)胞——成纖維細(xì)胞，在創(chuàng)傷修復(fù)時(shí)，大量合成Ⅰ型膠原而形成。TGF-β1參與創(chuàng)面修復(fù)的各個(gè)階段和瘢痕形成期[13-14]。研究表明，TGF-β1可通過激活轉(zhuǎn)移生長因子β激化激酶（transforming growth factor-beta-activated kinase 1，TAK1），啟動(dòng)下游一系列的信號(hào)反應(yīng)，主要包括細(xì)胞凋亡、周期調(diào)控、細(xì)胞分化、纖維化、纖維疾病的病理生理過程[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在增生性瘢痕組織表達(dá)顯著高于正常皮膚組織，且增生性瘢痕組織中TGF-β1基因表達(dá)量是正常皮膚組織的2.31倍。而近年來研究表明，TGF-β1在增生性瘢痕組織中表達(dá)顯著高于正常皮膚組織[3，17]，這與本研究結(jié)果一致。endprint

通過對增生性瘢痕組織中miRNA-21和TGF-β1的表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，增生性瘢痕組織中miRNA-21基因表達(dá)量與TGF-β1基因表達(dá)量呈正相關(guān)。miRNA-21可能通過調(diào)節(jié)TGF-β1而在增生性瘢痕組織中發(fā)揮作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增生，導(dǎo)致miRNA-21表達(dá)量增加，加速纖維化進(jìn)程，促使增生性瘢痕組織形成，這也與本研究結(jié)論基本一致[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21還可以通過調(diào)節(jié)TGF-β-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)間質(zhì)干細(xì)胞向成脂細(xì)胞分化和抑制人脂肪源干細(xì)胞增殖，推測也可能通過次信號(hào)通路參與增生性瘢痕組織的形成和發(fā)展過程[19]。

綜上，增生性瘢痕組織中miRNA-21與TGF-β1基因表達(dá)量異常，顯著高于正常皮膚組織，可能與瘢痕組織形成相關(guān)。但其具體機(jī)制尚需在成纖維細(xì)胞中進(jìn)行miRNA21的沉默表達(dá)實(shí)驗(yàn)加以完善。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Boo S，Dagnino L.Integrins as Modulators of Transforming Growth Factor Beta Signaling in Dermal Fibroblasts During Skin Regeneration After Injury[J].Adv Wound Care（New Rochelle），2013，2（5）：238-246.

[2]Xiao K，Luo X，Wang X，et al.MicroRNA-185 regulates transforming growth factor-β1 and collagen-1 in hypertrophic scar fibroblasts[J].Mol Med Rep，2017，15（4）：1489-1496.

[3]寧璞，劉德伍，毛遠(yuǎn)桂，等.增生性瘢痕與正常皮膚微小RNA的差異表達(dá)譜分析[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2012，92（10）：692-694.

[4]丁鳳云，蘭建云，劉洪，等.病理性瘢痕組織中轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2011，27（10）：1120-1121.

[5]胡洋紅，劉德伍，胡楊柳，等.微小RNA21和程序性細(xì)胞死亡因子4在人增生性瘢痕中的表達(dá)[J].中華燒傷雜志，2013，29（5）：479-481.

[6]Guo L，Xu K，Yan H，et al.MicroRNA expression signature and the therapeutic effect of the microRNA-21 antagomir in hypertrophic scarring[J].Mol Med Rep，2017，15（3）：1211-1221.

[7]Crea F，Clermont PL，Parolia A，et al.The non-coding transcriptome as a dynamic regulator of cancer metastasis[J].Cancer Metastasis Rev，2014，33（1）：1-16.

[8]Cheng Q，Yi B，Wang A，et al.Exploring and exploiting the fundamental role of microRNAs in tumor pathogenesis[J].Onco Targets Ther，2013，6：1675-1684.

[9]Volinia S，Calin GA，Liu CG，et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2006， 103（7）：2257-2261.

[10]梁剛，侯春，冀航，等.miR-21在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖及青蒿琥酯等藥物作用下表達(dá)情況的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2017，26（3）：80-83.

[11]Gao Y，Lu J，Zhang Y，et al.Baicalein attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats through inhibition of miR-21[J].Pulm Pharmacol Ther，2013，26（6）：649-654.

[12]胡洋紅，胡楊柳，劉德伍，等.增生性瘢痕與正常皮膚組織差異表達(dá)基因的篩選與生物信息學(xué)分析[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，34（7）：939-944.

[13]Linares HA.From wound to scar[J].Burns，1996，22：339-352.

[14]Lian N，Li T.Growth factor pathways in hypertrophic scars： Molecular pathogenesis and therapeutic implications[J].Biomed Pharmacother，2016，84：42-50.

[15]Schuman J，Chen Y，Podd A，et al.A critical role of TAK1 in B-cell receptor-mediated nuclear factor kappaB activation[J].Blood，2009， 113（19）：4566-4574.

[16]Sakurai H.Targeting of TAK1 in inflammatory disorders and cancer[J].Trends Pharmacol Sci，2012，33（10）：522-530.

[17]邱林，金先慶，田曉菲，等.正常皮膚和瘢痕組織TGF-β1的表達(dá)及膠原構(gòu)成與年齡相關(guān)性研究[J].中華小兒外科雜志，2006，27（8）：393-396.

[18]張奇，王琛.microRNA-21調(diào)控TGF-β通路促進(jìn)增生性瘢痕形成的機(jī)制研究[J].組織工程與重建外科，2014，10（6）：318-323.

[19]鄭金絢，吳莉萍.微小RNA21與干細(xì)胞之間的關(guān)系[J].國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2014，41（6）： 716-719.

[收稿日期]2017-08-21 [修回日期]2017-09-04

編輯/朱婉蓉endprint