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        微小RNA21和TGF—β1在正常皮膚和增生性瘢痕組織中的表達研究

        2017-12-09 23:18:28地里夏提·庫爾班
        中國美容醫(yī)學 2017年10期
        關鍵詞:瘢痕皮膚基因

        地里夏提·庫爾班

        [摘要]目的:探討微小RNA-21(miRNA-21)基因與轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)基因在正常皮膚組織和增生性瘢痕組織中的表達,并分析其相關性。方法:選取本院燒傷整形科收治的16例燒傷整形患者的增生性瘢痕組織及其臨近的正常皮膚組織,提取組織中的總RNA,采用實時熒光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)技術分別檢測增生性瘢痕組織和正常組織中miRNA-21與TGF-β1基因表達量,對檢測結果進行分析比較,并行相關性分析。結果:增生性瘢痕組織中miRNA-21基因表達明顯上調,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其表達水平是正常皮膚組織的2.18倍;增生性瘢痕中TGF-β1的表達量多于正常皮膚組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其表達水平是正常皮膚組織的2.31倍;增生性瘢痕組織中miRNA21基因表達量與TGF-β1基因表達量呈正相關(r=0.836,P<0.01)。結論:增生性瘢痕組織中miRNA-21和TGF-β1基因表達異常,可能與瘢痕組織形成相關。

        [關鍵詞]增生性瘢痕;微小RNA21;TGF-β1

        [中圖分類號]R619+.6 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455(2017)10-0068-03

        Abstract: Objective To investigate the expression of microRNA-21 (miRNA-21) gene and transforming growth factor-β(TGF-β1) gene in normal skin and hypertrophic scar tissue, and to analyze its correlation. Methods Collected from 16 hypertrophic scar tissues and adjacent normal skin tissues formed by burn and plastic surgery department in our hospital, total RNA was extracted from normal tissues and Hypertrophic scar tissue. The expressions of miRNA-21 and TGF-β1 gene in hypertrophic scar tissue and normal tissue were detected by RT-qPCR. The detection results were analyzed and compared, and the correlation analysis was carried out. Results The expression of miRNA-21 gene in hypertrophic scar tissue was significantly up-regulated, the difference was statistically significant(P<0.05), its expression level was 2.18 times of normal skin tissue. The expression of TGF-β1 in hypertrophic scar was higher than that in normal skin tissue(P<0.05). The expression level of TGF-β1 was 2.31 times higher than that of normal skin tissue. There was a positive correlation between the expression of miRNA-21 gene and the expression of TGF-β1 gene in hypertrophic scar tissue(r=0.836, P<0.01). Conclusion The abnormal expression of miRNA-21 and TGF-β1 gene in hypertrophic scar tissue may be related to the formation of scar tissue.

        Key words: hypertrophic scar; microRNA-21; TGF-β1

        增生性瘢痕是傷口表皮愈合過程中組織過度增生而引起的病理性瘢痕,不具備正常皮膚結構和生理功能。嚴重創(chuàng)傷、燒傷及外科手術后常并發(fā)程度不等的增生性瘢痕,影響外貌美觀,甚至可導致嚴重畸形及功能障礙,降低患者生活質量。具體發(fā)病機制尚未完全明確。但有研究表明,增生性瘢痕主要與成纖維細胞異常增殖及凋亡抑制、分泌和釋放的正向及負向細胞因子調節(jié)機制的異常,以及細胞外基質膠原合成與降解的失平衡有關,包括整合素、TGF-β和miRNA的異常表達[1-2]。在增生性瘢痕與正常皮膚組織微小RNA芯片及基因芯片檢測研究中發(fā)現(xiàn),miRNA-21和TGF-β1在增生性瘢痕與正常皮膚組織中存在差異表達,可能與增生性瘢痕組織的發(fā)生、發(fā)展及演化密切相關[3]。但關于miRNA-21與TGF-β1基因在增生性瘢痕形成過程中是否起協(xié)同作用,目前相關研究報道尚罕見。且以往關于TGF-β1的研究多局限于免疫組化、原位雜交或半定量水平的研究。本研究通過熒光定量PCR法測定增生性瘢痕組織和正常組織中miRNA-21與TGF-β1的基因表達水平,了解miRNA-21與TGF-β1在增生性瘢痕組織與正常組織中的表達差異,分析兩者與增生性瘢痕組織病理發(fā)展的相關性。endprint

        1 材料和方法

        1.1 標本來源:收集本院2016年1月到2017年5月收治的16例燒傷整形患者術中切取的增生性瘢痕組織和臨近正常皮膚組織。其中男9例,女7例,年齡18~60歲;致傷部位:頜面部6例,上臂4例,膝關節(jié)2例,大腿4例;瘢痕面積:4.0cm×3.0cm~6.0cm×5.5cm。納入標準:①瘢痕增生時間為9~18個月,局部皮膚色澤鮮紅,質地較硬;②發(fā)病后未長時間服用瘢痕增生抑制藥物,包括放射或注射治療;③無全身系統(tǒng)性纖維化、腫瘤等病史,術前1個月內未使用激素類藥物;④患者均知情同意,自愿簽署知情同意書。本次研究獲得本院醫(yī)學倫理委員會批準同意。

        1.2 試劑:Trizol試劑購自日本Takara公司;PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購自日本Takara公司;微小RNA分離試劑購自ABI公司;實時定量RT-qPCR儀購自美國ABI公司。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 RNA制備:從液氮中取出標本約100mg,用移液器吸取1ml Trizol溶液加入到組織中,于冰上研磨攪勻,后續(xù)RNA提取步驟參照Trizol試劑盒說明??俁NA在紫外分光光度計上檢測260nm、280nm波長處的吸光度(A)值,并計算A260/A280比值,采用1.8~2.0者進行下一步實驗操作。cDNA的合成嚴格按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進行,將產物cDNA凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.2 RT-qPCR檢測mRNA表達水平:采用美國ABI公司RT-PCR儀檢測mRNA表達水平。建立總體積20μl反應體系:包括10μl SYBR熒光(定量)染料,2μl cDNA,0.4μl ROX 染料,7.1μl ddH2O,上下游引物各為0.25μl,引物序列見表1。定量PCR的反應條件:95℃ 10min,95℃ 15s,60℃ 1min,共40個循環(huán)。結果以每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環(huán)數(shù)用Ct值表示。每份標本均作復孔,反應結束后作熔解曲線。ΔCt=目的基因Ct值-減去內參Ct值,2-ΔΔCt值表示目的基因mRNA表達水平的高低。

        1.4 統(tǒng)計學分析:采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù),以均數(shù)±標準差(x?±s)表示miRNA-21與TGF-β1 mRNA表達水平,行配對t檢驗,變量間相關關系采用Pearson相關分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 miRNA-21基因表達量測定結果:增生性瘢痕組織中miRNA-21的2-ΔΔCt值為2.88±0.15,正常皮膚組織miRNA-21的2-ΔΔCt值為1.32±0.23,表明增生性瘢痕組織中miRNA-21的表達量高于正常皮膚組織,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.12,P=0.03);且增生性瘢痕組織與正常皮膚的miRNA-21比值為2.18,表明增生性瘢痕組織中miRNA-21基因表達量是正常皮膚組織的2.18倍。見表2。

        2.2 TGF-β1基因表達量測定結果:增生性瘢痕組織TGF-β1的2-ΔΔCt值為0.827±0.085,正常皮膚組織TGF-β1的2-ΔΔCt值為0.357±0.079,表明增生性瘢痕組織中TGF-β1的表達量高于正常皮膚組織,差異有統(tǒng)計學意義(t=2.17,P=0.04);增生性瘢痕組織與正常皮膚的TGF-β1比值為2.31,表明增生性瘢痕組織中TGF-β1基因表達量是正常皮膚組織的2.31倍。見表2。

        2.3 增生性瘢痕組織中miRNA-21和TGF-β1的關系:增生性瘢痕組織中miRNA-21基因表達量與TGF-β1基因表達量呈正相關(r=0.836,P<0.01)。

        3 討論

        曾有研究報道,增生性瘢痕與miRNA的異常表達密切相關[4]。通過對人增生性瘢痕組織中miRNA表達譜進行研究,發(fā)現(xiàn)其中一部分miRNA表達與正常皮膚組織中存在顯著差異,其中miRNA-21表達差異較明顯,且較多研究已證實miRNA-21在增生性瘢痕組織中表達異常高于正常組織[5]。相關動物實驗結果表明,miRNA-21拮抗劑可以顯著減少增生性瘢痕的瘢痕面積和瘢痕厚度[6]。miRNA-21廣泛存在于植物、線蟲和人類細胞中,其作為內源性調控性RNA,通過基因調節(jié)參與生命中的重要進程,如早期胚胎發(fā)生、細胞增殖、細胞生存及凋亡、細胞代謝、能量平衡等[7-8],在腫瘤、增生性瘢痕形成與發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用[9-10]。細胞核內miRNA-21是由RNA多聚酶Ⅱ、Ⅲ催化轉錄生成初始微小RNA,再經核酸Dicer酶加工成前體miRNA,然后被轉運到細胞質經Dicer酶剪切為成熟的miRNA-21。成熟miRNA-21的單鏈可以選擇性結合RNA,誘導沉默復合體生成,結合靶基因,導致靶基因mRNA裂解或抑制靶基因蛋白翻譯,參與轉錄后基因和蛋白表達水平調節(jié)[11]。本次研究結果顯示,miRNA-21在增生性瘢痕組織中的表達顯著高于正常皮膚組織,即miRNA-21在人增生性瘢痕中表達上調,其表達量是正常皮膚組織的2.18倍。miRNA-21作為一種可調控基因表達的內源性小分子RNA,可能通過調節(jié)增生性瘢痕的靶基因或蛋白來影響細胞的發(fā)育、增殖、分化、凋亡等過程。這與胡洋紅等研究結論基本一致[12],即miRNA-21在增生性瘢痕與正常皮膚組織中存在差異表達,且增生性瘢痕組織中表達顯著高于正常皮膚組織。

        皮膚真皮層是由大量作為支架的細胞外基質及少量細胞、表皮等構成。其中Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維是細胞外基質的重要組成部分,增生性瘢痕組織主要是由機體修復細胞——成纖維細胞,在創(chuàng)傷修復時,大量合成Ⅰ型膠原而形成。TGF-β1參與創(chuàng)面修復的各個階段和瘢痕形成期[13-14]。研究表明,TGF-β1可通過激活轉移生長因子β激化激酶(transforming growth factor-beta-activated kinase 1,TAK1),啟動下游一系列的信號反應,主要包括細胞凋亡、周期調控、細胞分化、纖維化、纖維疾病的病理生理過程[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1在增生性瘢痕組織表達顯著高于正常皮膚組織,且增生性瘢痕組織中TGF-β1基因表達量是正常皮膚組織的2.31倍。而近年來研究表明,TGF-β1在增生性瘢痕組織中表達顯著高于正常皮膚組織[3,17],這與本研究結果一致。endprint

        通過對增生性瘢痕組織中miRNA-21和TGF-β1的表達量進行相關性分析發(fā)現(xiàn),增生性瘢痕組織中miRNA-21基因表達量與TGF-β1基因表達量呈正相關。miRNA-21可能通過調節(jié)TGF-β1而在增生性瘢痕組織中發(fā)揮作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導成纖維細胞增生,導致miRNA-21表達量增加,加速纖維化進程,促使增生性瘢痕組織形成,這也與本研究結論基本一致[18]。有研究發(fā)現(xiàn),miRNA-21還可以通過調節(jié)TGF-β-Smad信號轉導通路促進間質干細胞向成脂細胞分化和抑制人脂肪源干細胞增殖,推測也可能通過次信號通路參與增生性瘢痕組織的形成和發(fā)展過程[19]。

        綜上,增生性瘢痕組織中miRNA-21與TGF-β1基因表達量異常,顯著高于正常皮膚組織,可能與瘢痕組織形成相關。但其具體機制尚需在成纖維細胞中進行miRNA21的沉默表達實驗加以完善。

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        [收稿日期]2017-08-21 [修回日期]2017-09-04

        編輯/朱婉蓉endprint

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