李文武

（大理大學第四附屬醫(yī)院神經內一科，云南楚雄 675000）

MTHFR C677T基因多態(tài)性與云南省楚雄地區(qū)彝族青年腦梗死相關性

李文武

（大理大學第四附屬醫(yī)院神經內一科，云南楚雄 675000）

目的：探討MTHFR C677T基因多態(tài)性與云南省楚雄地區(qū)彝族青年腦梗死的相關性。方法：用位點特異性PCR+瓊脂糖凝膠電泳方法分別檢測腦梗死組68例和對照組30例MTHFR C677T基因型，同時檢測血漿Hcy濃度。結果：腦梗死組MTHFR C677T基因TT純合型、CT雜合型及T等位基因頻率均顯著高于對照組，且與性別無關；TT純合型血漿Hcy濃度明顯高于CT雜合型及CC野生型，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。結論：MTHFR C677T等位基因T突變直接影響血漿Hcy濃度；MTHFR C677T基因多態(tài)性T等位基因可能是云南省楚雄地區(qū)彝族青年腦梗死遺傳易感基因。

MTHFR C677T基因；楚雄彝族；青年腦梗死

青年腦梗死是指45歲下成年人發(fā)生的腦梗死，約占腦梗死的9．77%。血漿同型半胱氨酸（Homocystcine，Hcy）水平增高是腦梗死重要的獨立危險因素〔1〕，目前國內外相關研究認為腦梗死其發(fā)病有眾多而復雜的遺傳和環(huán)境因素，基因變異是腦血管病的重要發(fā)病因素之一。亞甲基四氫葉酸還原酶（methylene tetrahydrofolate reduc-tase，MTHFR）是Hcy代謝的關鍵酶，MTHFR C677T基因錯義突變可引起此酶缺乏或活性降低，引起高同型半胱氨酸血癥，其中C677T位堿基突變最為常見，且TT突變型可能是缺血性腦血管病的獨立危險因素〔2〕，且受種族、性別、地區(qū)分布、飲食習慣及居住環(huán)境等多因素的影響。我國是一個多民族的國家，其飲食習慣、居住環(huán)境各不相同，云南省楚雄地區(qū)作為全國彝族聚居地區(qū)之一，其飲食習慣、居住環(huán)境大致相同。本文對云南省楚雄地區(qū)68例彝族青年腦梗死患者及30例健康彝族青年進行血漿Hcy含量的測定及MTHFR C677T基因多態(tài)性檢測，探討MTHFR C677T基因多態(tài)性與楚雄地區(qū)彝族青年腦梗死相關性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1．1一般資料病例均選自我科2013年1月至2016年10月收治的彝族青年腦梗死患者68例，年齡18～45歲，平均年齡（40±2．8）歲，男38例，女30例，所有患者均符合第四屆全國腦血管病學術會議制定的“腦梗死”診斷標準，并經顱腦CT或MRI檢查證實，既往無高血壓、糖尿病、高脂血癥、心臟病病史及吸煙、喝酒史，并排外甲狀腺、免疫系統(tǒng)、凝血功能異常、嚴重肝病及腎功能不全等疾病，近2周內無特殊藥物服用史。另選同期健康彝族青年30例作為對照組，平均年齡（39±3．2）歲，男17例，女13例。兩組年齡、性別構成差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），具有可比性。

1．2方法

1．2．1 血漿Hcy監(jiān)測 所有受檢者清晨空腹采集靜脈血3 mL，待全血凝固3 000 r∕min離心10 min，分離血清，采用奧林巴斯AU5400全自動生化分析儀測定Hcy（正常值5～15 μmol∕L）。所有操作嚴格按照試劑盒標準操作程序進行，試劑全部在有效期內。

1．2．2 MTHFR C677T基因多態(tài)性檢測 提取DNA基因組后，以位點特異性PCR+瓊脂糖凝膠電泳方法檢測MTHFR C677T基因多態(tài)性。引物序列設計以NCBI序列為準，基因參考序列號：NC_000001．10，由Invitrogen公司合成。

外周血中DNA提?。篍DTA抗凝血采集后按照試劑盒操作說明提取外周血中的全基因組DNA。提取后的DNA經微量核酸定量儀測定其濃度和純度后進行PCR擴增（2×Taq PCR Master Mix（Tiangen Biotech））。

PCR擴增：提取后DNA經過PCR擴增獲取PCR產物。采用9700熱循環(huán)儀（Applied Biosystems），條件為：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40個循環(huán)；72℃5 min。擴增片段為chr1：11856205-11856401 197 bp ；chr4：88035964+88036363 400 b進行擴增。擴增反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳（Power300電泳儀BIO-RAD）；BIORAD凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）檢測。

MTHFR基因分型結果判讀：共對7個樣本進行MTHFR基因分型，分別進行667C及667T檢測，每個反應均設置了內參基因片段的擴增（擴增條帶為400 bp），內參基因片段成功擴增時根據(jù)對應管中有無目的擴增條帶進行MTHFR基因型的判讀；每個樣本重復檢測（對應4個泳道）結果一致時接受，結果不一致時重新檢測，7個樣本內參基因片段（400 bp條帶）均成功擴增，重復檢測結果一致時，根據(jù)所得結果將所有患者分為CC野生型、CT雜合型、TT純合型。

1．3統(tǒng)計學處理應用SPSS 17．0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，所有計量資料均采用卡方檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1血漿Hcy水平檢測結果腦梗死組血漿Hcy水平明顯高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。見表1。

表1 腦梗死組與對照組血漿Hcy比較

2．2 MTHFR C677T基因多態(tài)性及T等位基因頻率分布腦梗死組TT突變型、CT雜合型和T等位基因頻率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。見表2。不同性別腦梗死組TT突變型、CT雜合型和T等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。見表 3。

表2 腦梗死組與對照組MTHFR C677T基因頻率比較［n（%）］

表3 腦梗死組不同性別MTHFR C677T基因頻率比較［n（%）］

2．3 MTHFR C677T基因多態(tài)性與血漿Hcy濃度的關系分析所有受檢者MTHFR C677T基因型及血漿Hcy濃度，結果顯示TT純合型血漿Hcy濃度明顯高于CT雜合型及CC野生型，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；CT 雜合型血漿Hcy濃度明顯高于CC 野生型，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。見表4。

表4 MTHFR C677T基因多態(tài)性不同基因型血漿Hcy濃度比較［n（%）］

2．4 MTHFR基因分型結果根據(jù)電泳結果將所有患者分為CC野生型、TT純合型，CT雜合型。見圖1～2 。

圖1MTHER基因分型結果Ⅰ

圖2MTHER基因分型結果Ⅱ

3 討論

腦梗死是高致殘率疾病，中國腦血管病防治指南指出，只有做好一級預防，才能有效降低腦梗死的發(fā)病率，因此應高度重視并積極開展腦梗死一級預防的相關性研究。國內外研究表明〔3-6〕腦梗死的獨立危險因素包括除了可干預的高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙等因素外，還包括了不可干預的年齡、性別、種族差異、遺傳性因素等危險因素，因此積極開展不可干預危險因素的相關性研究，認真做好一級預防便能顯著降低腦梗死的患病率。

高Hcy血癥是腦梗死的獨立危險因素，其機制目前認為Hcy可直接破壞血管壁彈力層和膠原纖維最終導致血管內皮細胞損傷。Hcy及其衍生物能影響血小板的聚集性，同時促進血栓調節(jié)因子的表達，激活蛋白C及凝血因子，促使血小板聚集形成血栓〔7〕。目前研究認為MTHFR C677T基因第4外顯子677位點上存在等位基因C和T多態(tài)現(xiàn)象，認為等位基因C為野生型，T為突變型。C與T對應氨基酸殘基分別為丙氨酸和纈氨酸，纈氨酸取代丙氨酸后使MTHFR穩(wěn)定性和活性下降，影響了Hcy再甲基化，從而導致Hcy升高〔3〕。本研究MTHFR C677T基因多態(tài)性及血漿Hcy濃度檢測結果顯示，TT純合型血漿Hcy濃度明顯高于CT雜合型及CC野生型；CT雜合型血漿Hcy濃度明顯高于CC野生型，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。國內研究〔8-9〕認為我國北方人群的MTHFR C677T基因多態(tài)性及血漿Hcy水平明顯高于南方人群，且與種族、遺傳背景、生活方式等不同有關，本研究結果與國內〔5-6，9〕和國外〔10〕研究結果報道基本一致，提示MTHFR C677T等位基因T突變直接影響血漿Hcy濃度，這可能是楚雄地區(qū)彝族青年腦梗死發(fā)生的重要機制之一；楚雄地區(qū)彝族青年腦梗死患者MTHFR C677T基因多態(tài)性、等位基因T突變率及血漿Hcy濃度是否與其他民族存在種族及地區(qū)差異，需要今后進一步完善其他民族的相關研究資料進行對比分析總結。

研究結果顯示，腦梗死組和對照組MTHFR基因多態(tài)性TT純合型基因突變率分別為33．82%、13．33%；T等位基因頻率分別為60．29%、33．33%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），其結果與國內〔9，11-12〕和國外〔10〕報道結果比較相對偏低；導致該研究結果偏低可能與本研究樣本量相對較少以及檢測方法不同有關，需今后擴大樣本量進一步深入研究。研究結果表明不同性別腦梗死組TT突變型、CT雜合型和T等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），提示MTFHR基因多態(tài)性及等位基因T突變率與楚雄地區(qū)彝族青年腦梗死患者性別無關。其研究結果表明MTHFR C677T基因多態(tài)性T等位基因可能是楚雄地區(qū)彝族青年腦梗死遺傳易感基因。

亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是葉酸代謝過程中的關鍵酶，在葉酸代謝過程中起到重要的作用，在臨床工作中通過MTHFR C677T基因多態(tài)性檢測，對于攜帶MTHFR C677T基因突變型（TT純合型和CT雜合型）的人群建議補充一定劑量的葉酸和B族維生素早期進行干預，提高酶活性，維持正常的血漿Hcy代謝濃度，不僅可以降低由于高Hcy血癥所致的血管壁損害導致腦梗死并發(fā)癥的發(fā)生，而且還為楚雄地區(qū)彝族青年腦梗死一級預防及臨床個體化治療方案的確立提供了重要的理論基礎依據(jù)。

綜上所述，MTHFR C677T等位基因T突變直接影響血漿Hcy濃度；MTHFR C677T基因多態(tài)性T等位基因可能是楚雄地區(qū)彝族青年腦梗死遺傳易感基因；該基因檢測為楚雄地區(qū)彝族青年腦梗死一級預防及臨床個體化治療方案的確立提供了重要的理論基礎依據(jù)。

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（責任編輯 董 杰）

Association between MTHFR C677T Gene Polymorphism and Cerebral Infarctino in the Yi Nationality Youth in Chuxiong

Li Wenwu
（Department of Neurology,The Fourth Affiliated Hospital of Dali University,Chuxiong,Yunnan 675000,China）

Objective：To study the relationship between MTHFR C677T gene polymorphism and cerebral infarctino in the Yi nationality youth in Chuxiong．Methods:The site-specific DNA Nnogxing method was used to detect MTHFR C667T gene in the experimental group of 68 cases with cerebral infarctino and the control group of 30 cases．Plasma Hcy concentrations were also measured．Results:The homozygous MTHFR C677T gene of TT and CT allele frequency of T in the group of cerebral infarcation was significantly higher than that of the control group,and the result had nothing to do with gender．TT plasma Hcy concentration was significantly higher than that of CT heterozygous and wild-type CC．The differences were statistically significant（P＜0．05）．Conclusion:MTHFR C677T allele T mutation directly affects plasma Hcy concentration;MTHFR C667T gene polymorphism T allele may be a genetic susceptibility gene of cerebral infarction in the young Yi people in Chuxiong area．

MTHFR C667T gene;Yi people Chuxiong;the youth cerebral infarction

R743．32

A

2096-2266（2017）10-0039-04

10．3969 ∕j．issn．2096-2266．2017．10．010

2017-03-21

李文武，副主任醫(yī)師，主要從事神經內科臨床研究．