李 月，王 昀，羅永會，陳貴元，左紹遠，2*

（1．大理大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，云南大理 671000；2．云南省昆蟲醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000）

紅花蜂花粉多糖提取工藝的研究

李 月1，王 昀1，羅永會1，陳貴元1，左紹遠1，2*

（1．大理大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，云南大理 671000；2．云南省昆蟲醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000）

目的：研究紅花蜂花粉多糖的最佳分離提取工藝。方法：以多糖提取率為考察指標，用水提醇沉法和微波提取法分離提取紅花蜂花粉多糖。通過單因素試驗和L9（34）正交試驗，比較兩種方法對多糖得率的影響。結(jié)果：工藝驗證實驗結(jié)果表明，微波提取法最佳提取工藝為料液比1：18 g∕mL、功率500 W、時間7 min，多糖提取率為34．60%；水提醇沉法最佳提取工藝為：料液比1：18 g∕mL、時間10 h、溫度80℃、提取次數(shù)4次，多糖提取率為38．00%。結(jié)論：水提醇沉法比微波提取法的多糖得率高，工藝路線穩(wěn)定可行，可作為紅花蜂花粉多糖分離提取的最佳工藝路線。

紅花蜂花粉多糖；正交試驗；工藝優(yōu)化；水提醇沉法；微波提取法

紅花（Carthamus tinctorius L．）為菊科紅花屬草本植物，味辛、性溫，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛等功效，是一種傳統(tǒng)中藥〔1-2〕。蜂花粉（bee pollen）是蜜蜂從蜜源植物花蕊內(nèi)采集的花粉粒，并加入了特殊的腺體分泌物（花蜜和唾液）混合而成的一種不規(guī)則扁圓形或淡黃色團狀物，為傳統(tǒng)天然營養(yǎng)食品。含有多糖等多種生物活性物質(zhì)，具有多種生物學活性和藥理作用〔3〕。研究表明，不同來源的蜂花粉多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種生物學活性〔4-8〕。

目前有關(guān)其他蜂花粉來源的多糖研究較多，但紅花蜂花粉多糖的研究少見報道〔9〕。為綜合開發(fā)利用云南豐富的紅花蜂花粉資源，本實驗采用兩種方法對其提取工藝路線進行研究，以期探索出最佳提取工藝路線，從而為紅花蜂花粉多糖的后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料

破壁紅花蜂花粉，購于云南滇峰蜂業(yè)有限責任公司產(chǎn)品（批號：20140712），為黃色粉末狀；D-無水葡萄糖（含量≥99%，批號：110833-201506，中國食品藥品檢定研究院）；水為去離子水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器：FST-Ⅲ-20普力菲爾超純水機（上海富詩特儀器設備有限公司）；SHA-C恒溫水浴箱（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；AG135電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞東生化儀器廠）；FD-1型冷凍干燥機（北京博醫(yī)康技術(shù)有限公司）；722E可見光分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；LD4-2A低速離心機（北京市醫(yī)用離心機廠）；SHZ-3循環(huán)水多用真空泵（上海青浦滬西儀器廠）；PD70D20P-TD（W0）格蘭仕微波爐（輸出功率700 W，廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司）。

2 方法

2．1葡萄糖標準曲線的繪制準確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標準品0．1 g于100 mL的容量瓶中，加水定容。取10 mL于另一100 mL容量瓶中，加水定容，得100 μg∕mL的葡萄糖標準溶液〔10〕。取干燥試管10支，分別加入葡萄糖標準溶液0．05、0．10、0．20、0．30、0．40、0．50、0．60、0．70、0．80、0．90 mL，各管加水補至2 mL，迅速加入質(zhì)量分數(shù)6．0%苯酚溶液1．0 mL及濃硫酸5．0 mL，搖勻，室溫靜置30 min。另取水2．0 mL同法操作，加入6．0% 苯酚溶液1．0 mL和濃硫酸5．0 mL，此為空白對照管，在490 nm處測吸光度值（A），以A為縱坐標，葡萄糖濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線回歸方程為A=0．016 07C-0．013 97（r=0．999 82），顯示在 2．5～45．0 μg∕mL 的葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2．2紅花蜂花粉多糖提取率的測定水提后，離心取上清液，定容至250 mL，取50 μL，稀釋至2 mL，用苯酚-硫酸比色法測定吸光度值代入標準曲線方程中，得其多糖的含量。紅花蜂花粉多糖的提取率按下式計算。

紅花蜂花粉多糖提取率=［（多糖質(zhì)量分數(shù)×2×體積倍數(shù)）∕紅花蜂花粉質(zhì)量］×100%

2．3紅花蜂花粉多糖提取工藝流程紅花蜂花粉→萃取回流（2倍體積石油醚，無水乙醇脫脂2次，每次2 h）→水提、離心→減壓濃縮、醇沉→離心、沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌→冷凍干燥→紅花蜂花粉多糖粗品（本實驗中著重考察水提過程中的相關(guān)因素）。

2．4水提醇沉法單因素實驗

2．4．1 料液比對紅花蜂花粉多糖得率的影響 稱取等量（1．0 g）紅花蜂花粉7份，在提取時間8 h，提取次數(shù)1次，提取溫度75℃條件下，考查不同料液比（1：3、1：6、1：9、1：12、1：15、1：18、1：21 g∕mL）對紅花蜂花粉多糖提取率的影響。

2．4．2 提取時間對紅花蜂花粉多糖得率的影響 稱取等量（1．0 g）紅花蜂花粉6份，在料液比1：18 g∕mL，提取次數(shù)1次，提取溫度75℃條件下，考查不同提取時間（4、6、8、10、12、14 h）對紅花蜂花粉多糖提取率的影響。

2．4．3 提取溫度對紅花蜂花粉多糖得率的影響 稱取等量（1．0 g）紅花蜂花粉6份，在料液比1：18 g∕mL，提取次數(shù)1次，提取時間10 h條件下，考查不同提取溫度（60、65、70、75、80、85 ℃）對紅花蜂花粉多糖提取率的影響。

2．4．4 提取次數(shù)對紅花蜂花粉多糖得率的影響 稱取等量（1．0 g）紅花蜂花粉5份，在料液比1：18 g∕mL，提取溫度80℃，提取時間10 h條件下，考查不同提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）對紅花蜂花粉多糖提取率的影響。

2．4．5 水提醇沉法正交試驗設計 以紅花蜂花粉多糖提取率為評價指標，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選定L9（34）4因素3水平進行正交試驗，以確定最優(yōu)紅花蜂花粉多糖提取工藝參數(shù)。見表1。

表1 正交試驗因素與水平

2．5微波法單因素實驗

2．5．1 料液比對紅花蜂花粉多糖得率的影響 稱取等量（1．0 g）紅花蜂花粉7份，在提取時間3 min，提取功率400 W條件下，考查不同料液比（1：3、1：6、1：9、1：12、1：15、1：18、1：21 g∕mL）對紅花蜂花粉多糖提取率的影響〔11〕。

2．5．2 提取功率對紅花蜂花粉多糖得率的影響 稱取等量（1．0 g）紅花蜂花粉5份，在提取時間3 min，料液比1：21 g∕mL條件下，考查不同提取功率（300、400、500、600、700 W）對紅花蜂花粉多糖提取率的影響。

2．5．3 提取時間對紅花蜂花粉多糖得率的影響 稱取等量（1．0 g）紅花蜂花粉6份，在料液比1：21 g∕mL，提取功率500 W條件下，考查不同提取時間（2、3、4、5、6、7 min）對紅花蜂花粉多糖提取率的影響。

2．5．4 微波法正交試驗設計 以紅花蜂花粉多糖提取率為評價指標，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選定L9（33）3因素3水平進行正交試驗，以確定最優(yōu)紅花蜂花粉多糖提取工藝參數(shù)。見表2。

表2 正交試驗因素與水平

2．6統(tǒng)計分析以紅花蜂花粉多糖提取率為評價指標，同等條件下每組實驗平行3次，以降低實驗中所出現(xiàn)的誤差，采用SPSS 21．0軟件對實驗結(jié)果進行分析，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義，以優(yōu)選出紅花蜂花粉多糖的最佳提取工藝。

3 結(jié)果與結(jié)論

3．1水提醇沉法單因素試驗結(jié)果

3．1．1 料液比對紅花蜂花粉多糖提取率的影響料液比在1：（3～18）g∕mL之間，紅花蜂花粉多糖的提取率逐漸增加，料液比1：18 g∕mL時提取率達到最大值；當水量繼續(xù)增加后提取率呈下降的趨勢。其原因可能為料液比較小時，隨提取液的增加有利于紅花蜂花粉多糖的溶出；但料液比超過1：18 g∕mL時，紅花蜂花粉多糖提取率趨于平穩(wěn)，基本不再增加。所以最佳料液比為1：18 g∕mL。見圖1。

圖1 料液比對多糖提取率的影響

3．1．2 提取時間對紅花蜂花粉多糖提取率的影響隨提取時間的延長紅花蜂花粉多糖的提取率也相應增加，當提取時間為12 h時，提取率達到最大值；提取時間繼續(xù)增加時，提取率呈下降趨勢。其原因可能為在一定時間范圍內(nèi)，隨提取時間的增加，紅花蜂花粉多糖的溶出逐漸增加；當提取時間為12 h時，樣品中的紅花蜂花粉多糖已基本全部溶出，而后隨提取時間的繼續(xù)增加，紅花蜂花粉多糖的提取率趨于平穩(wěn)。提取時間10 h與12 h、12 h與14 h相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）（n=4），對提取率無明顯差異，而提取時間過長將導致費時費力，成本增加，因此綜合考慮，選擇10 h較為經(jīng)濟可行。見圖2。

圖2 提取時間對多糖提取率的影響

3．1．3 提取溫度對紅花蜂花粉多糖提取率的影響在60～80℃之間，紅花蜂花粉多糖的提取率隨溫度的升高而大幅升高，當提取溫度達到80℃時，提取率達到最大值；當提取溫度進一步升高時，提取率明顯下降。其原因可能為溫度較低時，紅花蜂花粉中多糖與其他物質(zhì)結(jié)合緊密，使得紅花蜂花粉多糖不易溶出，因而提取率偏低；當提取溫度超過80℃時，會導致紅花蜂花粉多糖部分水解，從而影響紅花蜂花粉多糖的提取率。所以最適提取溫度為80℃。見圖3。

圖3 提取溫度對多糖提取率的影響

3．1．4 提取次數(shù)紅花蜂花粉多糖提取率的影響隨提取次數(shù)的增加紅花蜂花粉多糖的提取率呈上升趨勢，當提取次數(shù)5次時，提取率達到最大值。其原因可能為次數(shù)較少時，紅花蜂花粉多糖僅部分溶出，因而紅花蜂花粉多糖提取率偏低；當次數(shù)增加到5次時，紅花蜂花粉多糖已基本全部溶出，紅花蜂花粉多糖的提取率也趨于平穩(wěn)。提取次數(shù)3次與4次、4次與5次之間，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）（n=4），提取率無明顯差異，提取次數(shù)增加，使后續(xù)減壓濃縮、醇沉等工藝的成本增加，所以最佳提取次數(shù)為4次。見圖4。

圖4 提取次數(shù)對多糖提取率的影響

3．2水提醇沉法正交試驗結(jié)果與方差分析據(jù)表3中的R值可以得出，各因素對多糖提取率的影響程度依次為料液比（A）＞提取次數(shù)（D）＞提取溫度（C）＞提取時間（B）。由表4的方差分析結(jié)果可知，各因素對提取率的影響均具有統(tǒng)計學意義（P＜0．001），各因素對紅花蜂花粉多糖提取率的影響順序與極差分析結(jié)果相吻合。紅花蜂花粉多糖水提醇沉法最優(yōu)工藝為A1B3C2D3，即料液比1：15 g∕mL、提取時間12 h、提取溫度80℃、提取次數(shù)4次。見表3～4。

表3 L9（34）正交試驗結(jié)果

3．3微波法單因素實驗結(jié)果

3．3．1 料液比對紅花蜂花粉多糖提取率的影響紅花蜂花粉多糖的提取率隨料液比的增大而增加，料液比1：21 g∕mL時提取率達到最大值。其原因可能為料液比較小時，隨提取液的增加有利于紅花蜂花粉多糖的溶出；料液比1：21 g∕mL時，紅花蜂花粉多糖提取率趨于平穩(wěn)，基本不再增加。所以最佳料液比為1：21 g∕mL。見圖5。

圖5 料液比對多糖提取率的影響

3．3．2 提取功率對紅花蜂花粉多糖提取率的影響在功率300～500 W之間，紅花蜂花粉多糖提取率隨功率的增大而增加，功率為500 W時提取率達到最大值；當功率繼續(xù)增大時，提取率反而下降。其原因可能為功率較低時，紅花蜂花粉多糖不易溶出，因而提取率偏低；當提取功率超過500 W時，會導致紅花蜂花粉多糖部分水解，從而影響紅花蜂花粉多糖的提取率。所以最佳功率為500 W。見圖6。

圖6 提取功率對多糖提取率的影響

3．3．3 提取時間對紅花蜂花粉多糖提取率的影響紅花蜂花粉多糖提取率隨時間的增加而增加，在7 min時達到最大值。其原因可能為隨提取時間的增加，紅花蜂花粉多糖的溶出逐漸增加；當提取時間為7 min時，樣品中的紅花蜂花粉多糖已基本全部溶出，紅花蜂花粉多糖的提取率趨于平穩(wěn)。所以最佳時間為7 min。見圖7。

圖7 提取時間對多糖提取率的影響

表4 正交試驗方差分析結(jié)果

3．4微波法正交試驗結(jié)果與方差分析根據(jù)表5中的R值可以得出，各因素對多糖提取率的影響程度依次為料液比（A）＞提取時間（B）＞提取功率（C）。由表6的方差分析結(jié)果可知，各因素對多糖提取率的影響差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0．05），各因素對多糖提取率的影響順序與極差分析結(jié)果相吻合。紅花蜂花粉多糖微波法最優(yōu)工藝為 A2B3C2，即料液比 1：18 g∕mL、提取時間7 min、提取功率500 W。見表5～6。

3．5提取工藝驗證選取3種方案進行試驗驗證，即微波提取法正交試驗最優(yōu)工藝A2B3C2，水提醇沉法單因素試驗組合：料液比1：18 g∕mL、時間10 h、溫度80℃、提取次數(shù)4次，水提醇沉法正交試驗最優(yōu)工藝A1B3C2D3。結(jié)果微波提取法正交試驗最優(yōu)工藝A2B3C2多糖平均提取率為34．60%（n=3，RSD=0．33%），水提醇沉法單因素試驗組合：料液比1：18 g∕mL、時間10 h、溫度80℃、提取次數(shù)4次的多糖平均提取率為38．00%（n=3，RSD=0．15%），水提醇沉法正交試驗最優(yōu)工藝A1B3C2D3多糖平均提取率為37．83%（n=3，RSD=0．45%）。3種方案工藝穩(wěn)定可行。其中水提醇沉法單因素試驗組合的多糖提取率最高。

表5 L9（33）正交試驗結(jié)果

表6 正交試驗方差分析結(jié)果

4 討論

由工藝驗證結(jié)果可知，水提醇沉法的多糖得率高，比微波提取法高3．4%，因此選擇水提醇沉法。同時又比較水提醇沉法的兩種方法，即：單因素試驗組合和正交試驗最優(yōu)工藝，雖然兩種工藝的多糖提取率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），但是單因素試驗組合的料液比為1：18 g∕mL、時間為10 h，比正交試驗最優(yōu)工藝省時且提取更完全。因此綜合考慮水提醇沉法最佳提取工藝為單因素試驗組合，即：料液比1：18 g∕mL、時間10 h、溫度80 ℃、提取次數(shù)4次，多糖平均提取率為38．00%。該提取方法更利于紅花蜂花粉多糖的提取，為其后續(xù)研究提供基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)。

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（責任編輯 李 楊）

Comparative Research on the two Extraction Processes of Polysaccharides from Bee Pollen of Carthamus tinctorius

Li Yue1,Wang Yun1,Luo Yonghui1,Chen Guiyuan1,Zuo Shaoyuan1,2*
（1．Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2．Key Laboratory of Pharmaceutical Ramp;D of Insects in Yunnan Province,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the best extracting technique of polysaccharides from bee pollen of Carthamus tinctorius．Methods:Taking the yield of polysaccharide as indicator,the polysaccharide of bee pollen of Carthamus tinctorius L was isolated by water extracting-alcohol precipitating method and microwave power method．Then by the use of orthogonal experiment and single factor test,the results of the two methods on the extraction yields of polysaccharides were compared．Results:The results of verification tests showed that the best extraction technology of microwave power method was 1∶18 g∕mL for the ratio of material to liquid,500 watts for microwave power and 7 min for extraction time．Under these process conditions,the yield of polysaccharide was 34．60%．And the best conditions of water extracting-alcohol precipitating method was 1∶18 g∕mL for the ratio of material to liquid,80 ℃ for extracting temperature,10 h for time and 4 times for extraction．The yield of polysaccharide was 38．00% ．Conclusion:The yield of polysaccharide of water extracting-alcohol precipitating method is better than the microwave power method．It is stable and feasible to use this method as the best extraction process of polysaccharides from bee pollen of Carthamus tinctorius．

polysaccharides from bee pollen of carthamus tinctorius;orthogonal experiment;extracting technology;extractingalcohol precipitating;microwave power

R284．2

A

2096-2266（2017）10-0024-05

10．3969 ∕j．issn．2096-2266．2017．10．006

國家自然科學基金資助項目（31460231）；云南省科技廳高新科技計劃資助項目（GX10-2004）；云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室資助項目（2014-10）

2016-12-06

2017-08-13

李月，碩士研究生，主要從事多糖的分離純化與生物學活性研究．*通信作者：左紹遠，教授．