丁桂春，李冰心，劉 倩，張玲玲

(揚(yáng)州市婦幼保健院 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 揚(yáng)州 225000)

循環(huán)miRNA-210的表達(dá)與胎兒生長受限的相關(guān)性分析

丁桂春，李冰心，劉 倩，張玲玲

(揚(yáng)州市婦幼保健院 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 揚(yáng)州 225000)

目的分析miRNA-210與胎兒生長受限的相關(guān)性，闡明循環(huán)中miRNA-210在胎兒生長受限發(fā)病機(jī)制中的作用，為胎兒生長受限的早期診斷及病理機(jī)制提供新的生物學(xué)標(biāo)志物。方法選擇2015年1月至2016年1月在揚(yáng)州市婦幼保健院分娩的產(chǎn)婦，采取隨機(jī)原則，選取符合胎兒生長受限孕足月分娩(包括順產(chǎn)及剖宮產(chǎn))的30例孕婦為胎兒生長受限組，選取同期足月分娩正常體重新生兒的孕婦30例為對照組，采集兩組孕婦外周血，提取RNA采用Trizol法，Real Time-PCR分別測定胎兒生長受限組和對照組循環(huán)中miRNA-210的表達(dá)水平與選擇內(nèi)參基因U6表達(dá)的相對值，分析miRNA-210與胎兒生長受限的相關(guān)性。結(jié)果胎兒生長受限組與對照組產(chǎn)婦年齡、孕前體重、孕周比較無明顯差異(t值分別為0.84、0.74、0.48，均Pgt;0.05)，但胎兒生長受限組新生兒體重明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.56，Plt;0.01)。胎兒生長受限組miRNA-210的表達(dá)水平為4.58，與對照組相比，表達(dá)明顯增加(t=7.43，Plt;0.01)。miRNA-210可作為一個潛在的生物學(xué)標(biāo)志物來區(qū)分胎兒生長受限及正常發(fā)育兒。結(jié)論胎兒生長受限組循環(huán)中miRNA-210的表達(dá)水平明顯升高，miRNA-210可能參與了胎兒生長受限的發(fā)病，循環(huán)中miRNA-210可作為胎兒生長受限診斷的生物標(biāo)志物。

胎兒生長受限；循環(huán)；生物標(biāo)志物；miRNA-210

胎兒生長受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)是足月胎兒出生體重小于2 500g或胎兒體重低于同孕齡平均體重的兩個標(biāo)準(zhǔn)差，或低于同孕齡正常體重的第10百分位數(shù)[1-2]。胎兒生長受限對圍生兒在近期及遠(yuǎn)期都可能造成不可逆轉(zhuǎn)的不良影響，是產(chǎn)科常見的、嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，導(dǎo)致圍生兒患病率增高，是圍生兒死亡的主要原因之一[3]。胎兒生長受限的病因多且復(fù)雜，迄今其病因尚不明確，且胎兒生長受限早期診斷困難。目前產(chǎn)科的研究熱點(diǎn)之一是胎兒生長受限的早期診斷及其發(fā)病機(jī)制的研究。

miRNA是一類非編碼單鏈小RNA，參與多種疾病過程，研究表明可通過檢測患者外周血漿中miRNA來進(jìn)行疾病的診斷[4-5]。近年來發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA可作為診斷妊娠性疾病的潛在生物標(biāo)記物[6]。目前miRNA與胎兒生長受限的研究僅限于少數(shù)miRNA，且缺乏血漿中miRNA表達(dá)譜的發(fā)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)中miRNA-210的差異表達(dá)與胎兒生長受限相關(guān)，通過探討循環(huán)中miRNA-210與胎兒生長受限的相關(guān)性，從而闡明miRNA-210在胎兒生長受限中的作用，對胎兒生長受限的發(fā)病機(jī)制、病因研究及早期診斷有重要意義。

1對象與方法

1.1研究對象

選擇2015年1月至2016年1月在揚(yáng)州市婦幼保健院分娩的產(chǎn)婦，采取隨機(jī)原則，選取符合胎兒生長受限孕足月分娩(包括順產(chǎn)及剖宮產(chǎn))的30例孕婦為胎兒生長受限組，選取同期足月分娩正常體重新生兒的孕婦30例為對照組。所有研究對象既往無特殊病史。胎兒生長受限納入標(biāo)準(zhǔn)參考第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》：①足月胎兒出生體重小于2 500g；②胎兒出生體重低于同孕齡平均體重的兩個標(biāo)準(zhǔn)差或低于同孕齡正常體重的第10百分位數(shù)[2]。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集

收集胎兒生長受限組及對照組產(chǎn)婦外周抗凝血5mL，室溫下1 200r/min離心10min，分離的血漿樣本于-80℃保存待測。采集標(biāo)本前的器具進(jìn)行防RNA酶污染處理。

1.2.2檢測循環(huán)中miRNA-210的相對表達(dá)量

采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(poly-merasechainreaction，PCR)檢測循環(huán)中miRNA-210的相對表達(dá)量。

1.2.2.1抽提血漿中的RNA 每200μL血漿加入5倍體積Trizol，劇烈震蕩30s，室溫放置5min。按Trizol法提取各個血漿中的RNA(使用miRNeasy Mini Kit試劑盒)，按說明書操作。提取的RNA先用分光光度計定量，隨后用凝膠電泳試驗(yàn)質(zhì)檢RNA的質(zhì)量是否合格。

1.2.2.2逆轉(zhuǎn)錄 將下述各種反應(yīng)物加入八聯(lián)管后輕柔混勻，在冰上放置5min，再放入PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：16℃ 30min，42℃ 30min，85℃ 5min，4℃ 5min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入5μL去核糖核酸酶水，使其終體積為20μL。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于-20℃保存。逆轉(zhuǎn)錄體系如表1所示：

表1 逆轉(zhuǎn)錄體系

1.2.2.3實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 將反應(yīng)體系配制成5μL，加在96孔板中，混勻后進(jìn)行定量聚合酶鏈反應(yīng)。實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)的反應(yīng)條件：50℃ 2min，95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min進(jìn)行40個循環(huán)。 所有樣本均做3次重復(fù)，反應(yīng)體系配制如表2所示。

表2 聚合酶鏈反應(yīng)體系

1.2.2.4 PCR反應(yīng)引物 所用引物由試劑公司設(shè)計合成。采用U6 RNA作為內(nèi)參照，見表3。

表3 引物序列

1.2.2.5定量聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果分析 用溶解曲線分析PCR產(chǎn)物的單一性，是否具有引物二聚體的存在。采用SDS 2.3軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。用U6作為內(nèi)參對照基因，用公式2-△△CT計算miRNA-210的相對表達(dá)量。miRNA-210的相對含量=2-△△CT。

△△CT=(CtmiRNA-210-CtU6)胎兒生長受限組-(CtmiRNA-210-CtU6)對照組

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1研究對象的基本資料

胎兒生長受限組與對照組孕產(chǎn)婦年齡、孕期體重、孕周比較無明顯差異(Pgt;0.05)，但胎兒生長受限組新生兒體重明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.56，Plt;0.01)，見表4。

表4 兩組一般臨床資料的比較

2.2循環(huán)中miRNA-210的表達(dá)水平比較

本研究采用實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測循環(huán)中miRNA-210表達(dá)水平。結(jié)果顯示，胎兒生長受限組miRNA-210的表達(dá)水平為4.58，與對照組相比，表達(dá)明顯增加(t=7.43，Plt;0.01)，見圖1。

圖1 FGR組與對照組循環(huán)中miRNA-210表達(dá)水平

Fig.1 Expression level of miRNA-210 in FGR group and control group

2.3通過miRNA-210的表達(dá)構(gòu)建ROC曲線

ROC曲線的構(gòu)建，設(shè)定對照組循環(huán)中miRNA-210表達(dá)的95%參考區(qū)間為風(fēng)險值，通過計算ROC曲線下面積(AUC)來劃分對照組與胎兒生長受限組的靈敏度和特異度。miRNA-210可作為診斷胎兒生長受限的一個潛在生物學(xué)標(biāo)志物，其AUC為0.708，靈敏度為88.20%，特異度為67.80%，見圖2。

圖2 miRNA-210劃分對照組與胎兒生長受限組的ROC曲線圖

Fig.2 ROC curves of miRNA-210 dividing control group and FGR group

3討論

3.1 miRNA與妊娠相關(guān)疾病的關(guān)系

有研究表明miRNA參與各種疾病如乳腺癌[7]，子癇前期[8]等的發(fā)病。也有研究表明miRNA在細(xì)胞分化、增殖和凋亡、胰島素分泌[9]、心臟病發(fā)生[10]、胚胎發(fā)育[11]等過程中發(fā)揮重要作用。miRNA-210在子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞上表達(dá)豐富，調(diào)控細(xì)胞分化、增殖，線粒體呼吸等[12]，在缺氧狀態(tài)下，miRNA-210的表達(dá)是上升的，表明miRNA-210參與妊娠期相關(guān)疾病的發(fā)病。研究表明妊娠早期可使用循環(huán)中C19MC篩查孕婦子癇前期的發(fā)病風(fēng)險[13]。循環(huán)中有些miRNA可作為妊娠相關(guān)疾病的潛在生物標(biāo)志物[14]。

3.2 miRNA-210在胎兒生長受限中的表達(dá)

目前國內(nèi)外未見循環(huán)血miRNA-210參與胎兒生長受限發(fā)病機(jī)制的研究，我們選擇miRNA-210作為本課題的研究目標(biāo)。本研究采用實(shí)時RCR方法分別檢測了胎兒生長受限組和對照組孕婦循環(huán)血中miRNA-210的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在胎兒生長受限組孕婦循環(huán)血中miRNA-210高表達(dá)，這與近期的國外報道一致[15]。本研究發(fā)現(xiàn)胎兒生長受限組孕婦循環(huán)血中miRNA-210的表達(dá)水平明顯高于對照組孕婦循環(huán)血，提示miRNA-210在胎兒生長受限中表達(dá)明顯升高，可能參與了胎兒生長受限的發(fā)生、發(fā)展。

目前的研究還不完善，本研究僅僅檢測了miRNA-210在胎兒生長受限孕婦循環(huán)血中呈明顯高表達(dá)，但miRNA-210如何參與胎兒生長受限的機(jī)制尚不明確，將進(jìn)一步進(jìn)行研究。通過miRNA-210的表達(dá)水平可以很好的區(qū)分胎兒生長受限組和對照組。因此，循環(huán)血中miRNA-210有可能成為一個較好的標(biāo)志物應(yīng)用于胎兒生長受限的臨床診斷。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：于學(xué)文]

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CorrelationanalysisofcirculatingmiRNA-210expressionlevelwithfetalgrowthrestriction

DING Gui-chun， LI Bing-xin, LIU Qian，ZHANG Ling-ling,

(GynecologyandObstetricsDepartment,YangzhouMaternalandChildHealthHospital,AffiliatedwithYangzhouMedicalUniversity,JiangsuYangzhou225000,China)

ObjectiveTo study the relationship between miRNA-210 and fetal growth restriction (FGR) and clarify the effect of circulating miRNA-210 in the pathogenesis of FGR, so as to provide new biomolecular maker for early diagnosis and pathogenesis of FGR.MethodsFrom January 2015 to January 2016 random principle was adopted to select 30 prenant women delivering full-term neonates with FGR in FGR group and 30 cases of normal controls in control group. RNA was extracted and Trizol reagent and Real Time-PCR were used to determine circulating miRNA-210 expression level and relative value of reference gene U6 to analyze the correlation of miRNA-210 with FGR.ResultsThere was no obvious difference between FGR group and normal control group in maternal age, pre-pregnancy weight and gestational age (tvalue was 0.84，0.74 and 0.48, respectively, allPgt;0.05), but neonatal weight of FGR group was remarkably lower than that of the control group with statistical difference (t=8.56,Plt;0.01). The level of circulating miRNA-210 was 4.58 in FGR group, which increased significantly compared to the control group (t=7.43，Plt;0.01). MiRNA-210 might be used as a potential biological marker to distinguish neonates with FGR from normal ones.ConclusionThe expression level of miRNA-210 is significantly increased in FGR group, and miRNA-210 may be involved in the pathogenesis of FGR. Circulating miRNA-210 can be used as biomarker in early diagnosis of FGR.

fetal growth restriction (FGR); circulation; biomarker; miRNA-210

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.11.003

R714.5

A

1673-5293(2017)11-1325-03

2017-06-20

揚(yáng)州市科技計劃項目(YZ2014214)

丁桂春(1982—)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事妊娠期高血壓及胎兒生長受限的研究。

張玲玲，副主任醫(yī)師。