孫佳彬，覃藝，張紅玲，范潤(rùn)勇，黃勤挽*,2

·炮制制劑·

發(fā)酵對(duì)半夏毒性和刺激性的影響

孫佳彬1，覃藝1，張紅玲1，范潤(rùn)勇1，黃勤挽*1,2

目的：比較發(fā)酵前后半夏的毒性和刺激性變化，為臨床用藥的安全性提供依據(jù)。方法：采用單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)法、家兔眼結(jié)膜刺激性實(shí)驗(yàn)方法和高效液相色譜法，測(cè)定半夏發(fā)酵前后的最大給藥量（MLD）、刺激性和草酸鈣針晶的含量。結(jié)果：半夏MLD為45.47 g?kg-1?d-1，相當(dāng)于臨床人用量的252.61倍，發(fā)酵后的半夏MLD為39.42 g?kg-1?d-1，相當(dāng)于臨床人用量的218.96倍；發(fā)酵后的半夏較半夏對(duì)家兔眼結(jié)膜的刺激性明顯減弱，草酸鈣針晶含量相對(duì)的減少。結(jié)論：臨床規(guī)定項(xiàng)下的半夏及半夏曲用量不會(huì)導(dǎo)致中毒死亡，發(fā)酵可以緩和半夏的刺激性。

半夏；發(fā)酵；刺激性；草酸鈣針晶

半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternate(Thunb.)Breit的干燥塊莖，具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結(jié)的功效[1]。半夏生品有毒，對(duì)口腔、喉頭和消化道黏膜有強(qiáng)烈的刺激性，可導(dǎo)致失音、嘔吐、水瀉等副作用，嚴(yán)重的喉頭水腫可致呼吸困難、窒息等癥狀，嚴(yán)重者甚至引起死亡[2]。目前對(duì)半夏的毒性成分研究存在爭(zhēng)議，認(rèn)為主要的毒性成分為草酸鈣針晶、蛋白類和生物堿類。其中草酸鈣針晶為半夏的主要刺激性成分，蛋白類中的凝集素蛋白為主要的至炎性成分，生物堿類即是抑制相關(guān)腫瘤細(xì)胞增殖的有效成分，又是能夠產(chǎn)生急性毒性的有毒成分[3-6]。半夏炮制后可以緩和半夏的毒性，目前對(duì)半夏發(fā)酵制曲后可以緩和半夏毒性的研究未見(jiàn)報(bào)道，所以本課題擬采用單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)方法、家兔眼結(jié)膜刺激性實(shí)驗(yàn)方法和高效液相色譜法對(duì)半夏發(fā)酵前后的毒性變化進(jìn)行研究，為半夏發(fā)酵制曲可以緩和毒性提供理論支撐，為半夏臨床安全用藥提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

半夏購(gòu)買于成都市荷花池藥材市場(chǎng)，由成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本中心盧先明教授鑒定為正品天南星科植物半夏Pinellia ternate（Thunb.）Breit的干燥塊莖；半夏曲：取半夏適量粉碎成細(xì)粉，加水適量，制成軟硬適宜的小塊或顆粒，發(fā)酵產(chǎn)生白色霉菌時(shí)，取出，干燥，即得。

1.2 動(dòng)物

昆明種小鼠，18～22 g，雌雄兼有，SPF級(jí)動(dòng)物，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（川）2015-30

1.3 試劑

生理鹽水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：T16090101-2）；草酸對(duì)照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)160821），鹽酸（四川西隴化工有限公司，批號(hào)：140320）；磷酸（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：2016050401）

1.4 儀器

DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）； L550臺(tái)式低速離心機(jī)（長(zhǎng)沙儀器有限公司）；HWS型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；BS200S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；UPH-I-10T優(yōu)普超純水器（成都超純科技有限公司）；HHS-8S電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；Agilent 1200高效液相色譜儀：儀器包括G1322A(四元泵)，G1329A/B（自動(dòng)控溫自動(dòng)進(jìn)樣器），G1316A(柱溫箱)，G1315B/D(二極管陣列檢測(cè)器)，Agilent Chemstation工作站；Agilent Zorbax SB-Aq C18（4.6*250mm，5μm，美國(guó)Agilent公司）

2 方法與結(jié)果

2.1 半夏發(fā)酵前后單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)[7]

2.1.1 藥液的制備 取半夏和半夏曲粉末適量，分別加純水溶解，直到混懸液濃稠至恰好能通過(guò)灌胃針為止，即為藥液的最大濃度。

2.1.2 半夏發(fā)酵前后最大給藥量（MLD）的測(cè)定 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果小鼠大劑量灌胃（藥液濃縮至較大濃度或以能通過(guò)灌胃針的最大濃度）半夏及半夏曲混懸液，均不會(huì)出現(xiàn)動(dòng)物死亡的情況，無(wú)法測(cè)出半數(shù)致死量（LD50）和最大耐受量（MTD），故對(duì)其進(jìn)行1日內(nèi)最大給藥量（MLD）測(cè)定。將小鼠按體重，性別隨機(jī)分為3組，每組20只。分別為空白組，半夏組和半夏曲組。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h，按40 ml?kg-1給藥劑量分別給予相應(yīng)的藥液。因混懸液濃稠且濃度較低，所以對(duì)藥物組動(dòng)物給藥兩次，空白組給予等體積的水，時(shí)間間隔10 h。給藥后密切觀察記錄各組小鼠反應(yīng)，第二次給藥后2 h后恢復(fù)進(jìn)食，常規(guī)飼養(yǎng)14 d，從給藥后第1 d起每天觀察小鼠兩次，記錄異常情況。分別于給藥后1，7，14 d稱量各組小鼠體重，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后頸椎脫臼處死小鼠進(jìn)行解剖檢查，觀察其臟器變化。

半夏組較空白組第一次給藥后15 min內(nèi)比較煩躁，隨后的2 h內(nèi)出現(xiàn)活動(dòng)減少、困倦、扎堆的現(xiàn)象，4 h內(nèi)全部恢復(fù)正常活動(dòng)；第二次給藥后1 h內(nèi)比較安靜，2 h內(nèi)逐漸恢復(fù)正常，恢復(fù)正常飲食后飲食量較少，給藥1 d后飲食恢復(fù)正常。半夏曲組較空白組第一次給藥后15 min內(nèi)活動(dòng)較少，喜歡扎堆，2 h內(nèi)恢復(fù)正常；第二次給藥后15 min內(nèi)較安靜，1 h內(nèi)逐漸恢復(fù)正常，恢復(fù)正常飲食后飲食減少，給藥1 d后飲食恢復(fù)正常。14 d后解剖檢查各組小鼠均無(wú)明顯臟病變。各組小鼠第1，7，14 d體重變化與空白組比較均無(wú)顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 半夏和半夏曲組MLD實(shí)驗(yàn)小鼠體重變化（±s，n=20）

表1 半夏和半夏曲組MLD實(shí)驗(yàn)小鼠體重變化（±s，n=20）

組別給藥劑量/(g?kg-1)最大給藥量/(g?kg-1?d-1)相當(dāng)于50 kg人日用量的倍數(shù)給藥1 d后體重/g給藥7 d后體重/g給藥14 d后體重/g空白組------23.15±2.75 30.70±3.73 32.01±3.94半夏組22.7345.47252.61 23.15±1.79 29.62±3.22 31.44±3.22半夏曲組19.7139.42218.96 23.19±1.77 29.44±3.17 31.32±3.08

2.2 半夏發(fā)酵前后對(duì)家兔眼結(jié)膜刺激性的比較

2.2.1 樣品制備 分別稱取半夏和半夏曲粉末（200目）各1 g，用生理鹽水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)20 %的混懸液；取過(guò)200目篩的藥用淀粉以生理鹽水配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)20 %的混懸液。上述各樣品溶液調(diào)節(jié)PH值，使其呈中性。

2.2.2 半夏發(fā)酵前后對(duì)家兔眼結(jié)膜刺激性的測(cè)定[6]隨機(jī)取體重約1.5 kg的家兔10只，分為2組，每組5只，分別為半夏組和半夏曲組。分別滴加半夏、半夏曲各樣品混懸液2滴到家兔左眼中，兔右眼同樣滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的淀粉混懸液2滴作為對(duì)照，然后用手輕輕閉合家兔上下眼瞼，避免藥液溢出家兔眼睛，緊接著輕輕揉家兔的眼睛，使藥液與整個(gè)眼結(jié)膜充分接觸，左右眼均揉3 min后，立即用30～40 mL生理鹽水沖洗家兔眼睛，直到眼中無(wú)藥物殘留，并且沒(méi)有任何異物，隨后觀察0.5～2 h內(nèi)家兔左右眼的情況，每0.5 h觀察一次，并拍照記錄家兔左右眼的刺激反應(yīng)情況，按照家兔眼結(jié)膜評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]從血管充血情況，是否水腫和有無(wú)分泌物情況三個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知半夏對(duì)家兔眼結(jié)膜表現(xiàn)為輕度刺激，發(fā)酵后的半夏曲可以緩和半夏的刺激性毒性對(duì)家兔眼結(jié)膜無(wú)刺激性作用。

表2 家兔眼結(jié)膜評(píng)分結(jié)果（n=5）

2.3 半夏發(fā)酵前后草酸鈣含量的測(cè)定[9]

2.3.1色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) Agilent Zorbax SB-Aq C18（4.6*250 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相0.5%磷酸水，流速0.5 mL?min-1，柱溫28 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL，在此色譜條件下對(duì)照品峰與樣品峰分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于2000，見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 草酸對(duì)照品HPLC圖

圖2 半夏發(fā)酵前后樣品HPLC圖

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取草酸對(duì)照品適量，置10 mL容量瓶中，加純水溶解定容至刻度，精密移取2 mL置10 mL容量中加純水定容至刻度，搖勻，用0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 分別精密稱取半夏和半夏曲藥材粉末（40目）各0.1 g,置玻璃容器中，加入3 mL蒸餾水混勻，振蕩5 min，然后置60 ℃水浴加熱并攪拌10 min,，3 000 r/min離心5 min，殘?jiān)詿峒兯礈?次,每次2 mL，混勻離心，取藥材殘?jiān)?.2 mLHCl(1：1)溶液, 3 mL純水混勻,置70 ℃水浴,，加熱并攪拌10 min，離心，條件同上，分離沉淀與上清液,沉淀用0.1 mol?L-1的HCl同上法處理2次，每次2 mL，離心，合并上清液，置10 mL量瓶，純水定容至刻度，即得供試品溶液。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液1，2，4，6，10，15，20 μl，按上述色譜條件，進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，以進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，草酸的的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：A=898.82C-24.926（γ=0.9995），表明草酸質(zhì)量在0.188～3.760 μg線性良好。

2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液10 μl按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄草酸對(duì)照品的峰面積并計(jì)算RSD值，其峰面積的RSD為0.10 %，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批半夏樣品，按“2.3.3”項(xiàng)下的供試品溶液制備方法平行制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣10 μl，測(cè)定草酸峰面積,計(jì)算并折算成樣品中草酸鈣含量，其草酸鈣含量的RSD為1.79%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取取半夏粉末0.1 g，按“2.3.3”供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別于 0，2，4，6，12，24 h等6個(gè)時(shí)間點(diǎn)吸取供試品溶液10 μL進(jìn)樣，測(cè)定草酸峰面積，其峰面積的RSD為1.12%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的半夏藥材粉末6份，每份0.05 g，每份精密加入草酸對(duì)照品適量，按“2.3.3”供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10μl，測(cè)定草酸峰面積,計(jì)算并折算成樣品中草酸鈣含量，計(jì)算回收率結(jié)果見(jiàn)表3。半夏供試品溶液中草酸鈣的回收率在97.01 %～101.69 %范圍內(nèi)，平均回收率為98.40 %，RSD＜3 %，表明測(cè)定陳皮中橙皮苷含量的方法準(zhǔn)確度良好。

表3 半夏中草酸鈣加樣回收實(shí)驗(yàn)

2.3.9 樣品含量測(cè)定 精密稱取半夏發(fā)酵前后樣品，按“2.3.3”供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μl，測(cè)定草酸峰面積,計(jì)算并折算成樣品中草酸鈣含量，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，半夏發(fā)酵后藥材中草酸鈣含量降低，表明發(fā)酵可以緩和半夏的刺激性毒性。

表4 半夏發(fā)酵前后樣品中草酸鈣含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 結(jié)論與討論

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析急毒實(shí)驗(yàn)中半夏M L D為45.47 g?kg-1?d-1，相當(dāng)于臨床人用量的252.61倍，發(fā)酵后的半夏MLD為39.42 g?kg-1?d-1，相當(dāng)于臨床人用量的218.96倍，說(shuō)明半夏發(fā)酵前后在正常的臨床用藥范圍內(nèi)都是低毒，安全的；家兔眼結(jié)膜刺激實(shí)驗(yàn)中，半夏可引起家兔眼結(jié)膜紅腫并伴有分泌物排出，說(shuō)明半夏有刺激性，發(fā)酵后的半夏較半夏對(duì)家兔眼結(jié)膜的刺激性明顯減弱；草酸鈣含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵后的半夏草酸鈣針晶含量相對(duì)的減少，說(shuō)明發(fā)酵可以降低半夏中的刺激性成分，緩和半夏的刺激性。

半夏刺激性成分的研究比較多，最早認(rèn)為半夏的刺激性成分是尿黑酸（homengenstic acid）[10]，也有專家提出是草酸鈣[11]，現(xiàn)代認(rèn)為具有特殊晶型（細(xì)長(zhǎng)堅(jiān)韌，末端尖銳）的草酸鈣針晶是半夏的主要刺激性成分[12]。半夏中的草酸鈣針晶是由草酸鈣和蛋白組成的特殊晶體，正是其特殊的晶型和特殊組成才使得其具有刺激性，半夏中的凝集素蛋白可以增強(qiáng)針晶引起的刺激性[13,14]。

對(duì)于草酸鈣含量測(cè)定的方法目前多用滴定法和HPLC，都是將不溶的草酸鈣轉(zhuǎn)化為草酸的方法間接測(cè)定草酸鈣的含量，本實(shí)驗(yàn)選擇了操作簡(jiǎn)單，結(jié)果更準(zhǔn)確的HPLC，先用水將可溶性的草酸鹽去除，再通過(guò)強(qiáng)酸制弱酸的原理將草酸鈣轉(zhuǎn)化為草酸(CaC2O4+2HCl=CaCl2+H2C2O4)，按照生成1 moL草酸需要mol草酸鈣的量，將測(cè)得的樣品中草酸轉(zhuǎn)化成草酸鈣的含量。

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Effect of fermentation on the toxicity and the irritation of Banxia

/SUN Jia-bin1, QIN Yi1, ZHANG Hong-ling1, FAN Runyong1,HUANG Qin-wan1,2// (1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan;2. Key Laboratory TCM processing of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To compare the toxicity and the irritation of Banxia (before and after fermentation), so as to provide the basis for the safety of clinical medication.Method:The maximum dose (MLD) of Banxia (before and after fermentation)was investigated by the classical acute toxicity test. The irritation of Banxia(before and after fermentation) was investigated by stimulating test of eye conjunctiva in rabbits. HPLC method was used to detect the content of calcium oxalate crystals (before and after the fermentation) of Banxia .Result:The MLD of raw Banxia was 45.47 g?kg-1?d-1, which was equivalent to 252.61 times of the human clinical dosage. The MLD of the fermented Banxia was 39.42 g?kg-1?d-1, 218.96 times as much as the clinical dosage.After fermentation, the stimulation of Banxia on the conjunctiva of rabbit was significantly weakened, and the relative content of calcium oxalate crystal was decreased.Conclusion:The prescribed dosage of Banxia and the fermented Banxia under clinical conditions don’t lead to poisoning and death, and fermentation can alleviate the irritation of Banxia.

Banxia; fermentation ;irritation; calcium oxalate crystal

R 283.6

A

1674-926X(2017)06-008-04

國(guó)家中醫(yī)藥管理局2015年公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（201507004-03）

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術(shù)重點(diǎn)研究室，四川 成都 611137

孫佳彬（1992-），女（漢族），河北承德人，成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院在讀碩士研究生，學(xué)士學(xué)位，主要從事中藥炮制研究Tel∶13166506734 Email∶2270514478@qq.com.

黃勤挽，博士，副教授，研究方向：中藥炮制學(xué)，Tel∶028-61800231 Email∶36190587@qq.com.

2017-6-28

(責(zé)任編輯：傅舒)