譚春江，張佳慧，曾建偉，吳巖斌，陳文列

·藥理毒理·

心水通膠囊中藥水提物的急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

譚春江，張佳慧，曾建偉，吳巖斌，陳文列

目的：通過(guò)心水通膠囊中藥水提物小鼠灌胃實(shí)驗(yàn), 研究該藥物的毒理學(xué)反應(yīng)。方法：分別以心水通膠囊中藥水提物最大濃度和動(dòng)物的最大胃容納灌服給藥，連續(xù)觀察14 d，正常飲食組為對(duì)照組。觀察小鼠毛色體征、活動(dòng)情況、體重變化、尿量及尿液成分變化，檢測(cè)血電解質(zhì)、心肝腎功能以及部分內(nèi)臟組織病理學(xué)變化。結(jié)果：心水通膠囊中藥水提物的最大耐受量為204.24 g?kg-1，按60 kg人計(jì)算，相當(dāng)于成人臨床用量的近400倍。從第二天起，給藥各組小鼠的尿量比對(duì)照組明顯增多，且呈劑量依賴性；而外觀行為，飲食體重、大小便和分泌物、血電解質(zhì)、心肝腎功能與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異；給藥各組心、肝、脾、肺、腎的病理切片未發(fā)現(xiàn)典型的炎癥、增生或萎縮等病理學(xué)改變，形態(tài)與對(duì)照組相似。結(jié)論：心水通膠囊中藥水提物對(duì)受試動(dòng)物未出現(xiàn)無(wú)明顯急性毒理學(xué)反應(yīng)，可安全用于臨床。

心水通膠囊水提物;急性毒性;灌胃給藥;小鼠;最大耐受量

慢性心力衰竭?？杀鏋樾年?yáng)不振，或心氣不足，或痰瘀互結(jié)，或水飲凌心等癥候，臨床上往往表現(xiàn)為虛實(shí)夾雜。心水通膠囊（XST）是由筆者的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有溫補(bǔ)心陽(yáng)、活血祛瘀，行氣利水之功。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)， XST對(duì)于慢性心力衰竭尤其是伴有利尿劑抵抗患者療效顯著，而且能有效改善患者心功能、提高生活質(zhì)量, 但該藥物未經(jīng)毒理實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)。為了明確該方藥對(duì)人體健康的影響, 我們對(duì)其進(jìn)行了安全毒理學(xué)評(píng)價(jià),為臨床用藥提供可靠的科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 受試藥物

為XST組成藥材的中藥飲片，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院中藥房提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠40只, 雌雄各半，體重20±2 g, 由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 主要器材

灌胃器、燒杯、量筒、天平、北京DT5-1離心機(jī)、美國(guó)貝克曼Cx7全自動(dòng)生化分析儀、URIT-500B尿液分析儀等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 中藥提取液的制備

按照XST膠囊的中藥配方比例購(gòu)買(mǎi)中藥飲片，將總重量為2400 g的中藥飲片水煎煮，過(guò)濾，收集濾液轉(zhuǎn)至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，將其濃縮至最大濃度（恰能通過(guò)灌胃針頭）為470 mL，每1 mL相當(dāng)于生藥5.106 g,備用。

2.2 急性毒性實(shí)驗(yàn)

SPF級(jí)ICR小鼠40只, 體重18～22 g，雌雄各半，置于小鼠代謝籠觀察，每籠2只飼育1 周，觀察各組動(dòng)物活動(dòng)、進(jìn)食、糞便等情況均無(wú)異常后，采用臨床給藥途徑灌胃給藥，隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組(無(wú)任何處理) 和不同劑量藥物三組：第一組每天給藥1次, 第二組每天給藥2次, 第三組每天給藥3次, 按照小鼠每次灌胃給藥濃度為5106 mg?mL-1的中藥懸濁液0.4 mL/10 g給藥, 連續(xù)觀察14 d。同時(shí)觀察小鼠外觀、行為活動(dòng)、呼吸、分泌物、排便、死亡及出現(xiàn)的癥狀,每2d稱一次體重。末次給藥后，每組取6只小鼠，雌雄各半，禁食不禁水16 h，將小鼠摘除眼球取血，分別檢測(cè)血電解質(zhì)：鈉（Na）、鉀（K）、氯（Cl）、鈣（Ca）、磷（P）；腎功能：血清尿素氮( BUN) 、血肌酐（CRE）、血尿酸（UA）；肝功能：總蛋白（TP）總膽紅素( TBIL) 、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶( AST)、總膽紅素（TBIL）、堿性磷酸酶（ALP）；心功能：肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶(CKMB)和心肌肌鈣蛋白（TnI）。頸椎脫臼處死小鼠,對(duì)臟器進(jìn)行全面肉眼尸檢，解剖稱取心、肝、脾、肺、腎的濕重，求出臟器系數(shù)(臟器重/體重，mg?g-1) ，將上述器官用甲醛溶液固定，常規(guī)病理切片，進(jìn)行組織學(xué)檢查。余下的動(dòng)物停藥1周后，按上述方法進(jìn)行檢測(cè)，觀察有無(wú)藥物所致的延遲性變化。采用改良寇氏法計(jì)算LD50和95% 的可信區(qū)間，測(cè)定LD50; 若無(wú)法測(cè)定LD50，則測(cè)量最大耐受量。

3 結(jié)果

第一、二、三劑量各組小鼠的外觀皮毛光滑、行為活動(dòng)自如，飲食正常, 體重增加, 大小便正常, 無(wú)異常分泌物, 無(wú)任何不良反應(yīng)。觀察14 d后, 四組小鼠均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。表1可見(jiàn)，在同一組別內(nèi)，第2 d小鼠體重與第14 d小鼠體重比較有所增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；同一日內(nèi)，給藥各組小鼠的體重變化與對(duì)照組沒(méi)有組間差異（P＞0.05）。表2所示，在同一日內(nèi)，3個(gè)給藥組明顯比對(duì)照組增多，而且小鼠尿量呈劑量依賴性增多，尿中的紅/白細(xì)胞個(gè)數(shù)、尿蛋白和尿隱血4個(gè)組別之間沒(méi)有明顯差異，也不呈時(shí)間、劑量依賴性變化。給藥各組中腎功能、肝功能和心功能的指標(biāo)與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三個(gè)劑量組之間各指標(biāo)也未見(jiàn)顯著差異（見(jiàn)表3、表4，P＞0.05）。解剖稱取各組小鼠心、肝、脾、肺、腎的濕重，各給藥組與對(duì)照組，或給藥組間比較，其臟器系數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（數(shù)據(jù)略）。此外，觀察給藥2周和停藥后1周( 恢復(fù)期) 各給藥組的心、肝、脾、肺、腎的病理切片，均未見(jiàn)典型的炎癥、增生或萎縮等病理學(xué)改變，與對(duì)照組比較均未見(jiàn)異常改變。

表1 心水通膠囊對(duì)小鼠體重的影響(±s) g

表1 心水通膠囊對(duì)小鼠體重的影響(±s) g

注∶ 同一日中，給藥物各組小鼠體重與對(duì)照組小鼠體重比較無(wú)差異（P＞0.05）

第三組（n=10）第2d25.88±2.4025.17±2.3325.70±2.1725.53±2.232第4d25.60±2.5025.52±2.3126.42±2.9725.88±2.931第6d25.98±2.8224.91±1.9625.97±2.09426.64±2.97第8d26.20±2.6726.30±2.7227.39±3.1326.91±2.95第10d26.90±3.1126.87±2.8928.00±2.88727.75±3.17第12d27.63±2.7127.17±2.6828.23±3.1428.06±3.14第14d27.93±3.1427.85±2.6129.14±3.1729.06±3.29時(shí)間對(duì)照組（n=10）第一組（n=10）第二組（n=10）

表2 心水通膠囊對(duì)小鼠尿液的影響(±s)

表2 心水通膠囊對(duì)小鼠尿液的影響(±s)

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注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

表3 心水通膠囊對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)的影響( ± s)

表3 心水通膠囊對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)的影響( ± s)

注：對(duì)照組與各藥物干預(yù)組之間或藥物組之間比較，各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)差異（P＞0.05）

CRE(mmol?L-1)組別BUN(mmol?L-1)UA(mmol?L-1)TBIL(mmol?L-1)TP(g?L-1)AST(U?L-1)ALT(U?L-1)ALP(U?L-1)CK(U?L-1)CKMB(U?L-1)TnI(μg?L-1)對(duì)照組n=108.15±1.219.2±1.1111.9±3.73.25±1.255.1±3.2112.9±2.343.7±2.2137±5.81170.80±20.4530.5±12.30.2±0.01第一組n=108.32±1.123.5±1.7113.2±7.23.12±1.155.7±3.5127.5±2.141.2±3.2145±6.71150.10±17.5593.3±14.50.3±0.02第二組n=108.03±1.515.9±2.188.2±5.32.12±1.153.2±5.285±2.241.1±4.2143±8.81122.43±12.3578.1±10.30.2±0.01第三組n=107.65±1.218.21±2.286.5±4.52.20±1.251.4±4.2111.7±3.228.8±2.7139±5.61155.30±11.2501.3±7.80.2±0.01

表4 心水通膠囊對(duì)小鼠血電解質(zhì)的影響( ± s)

表4 心水通膠囊對(duì)小鼠血電解質(zhì)的影響( ± s)

注：對(duì)照組與各藥物干預(yù)組之間或藥物組之間比較，各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)差異（P＞0.05）

檢測(cè)項(xiàng)目（mmoL?L-1）對(duì)照組（n=10）第一組（n=10）第二組（n=10）第三組（n=10）Na 123.22±11.40123.22±11.40118.17±12.33118.17±12.33125.11±11.34125.11±11.34120.17±13.22120.17±13.22 K 4.21±2.504.21±2.503.52±1.313.52±1.314.12±1.114.12±1.113.92±1.233.92±1.23 Cl 102.23±2.50102.23±2.5098.62±7.3198.62±7.3192.22±6.2192.22±6.21100.23±7.56100.23±7.56 Ca 2.11±2.822.11±2.822.91±0.962.91±0.962.11±0.762.11±0.762.55±0.372.55±0.37 P 2.72±2.672.72±2.673.30±1.723.30±1.723.10±1.523.10±1.522.89±1.242.89±1.24

4 討論

XST是筆者的臨床驗(yàn)方，于2013年12月4日授予國(guó)家發(fā)明專利（專利號(hào)：ZL201210197892X）。該藥物具有溫陽(yáng)益氣，活血祛瘀，利水消腫之功。前期臨床證實(shí)，該藥物能顯著改善慢性心力衰竭患者的心功能。不僅具有利水消腫，改善慢性心力衰竭癥狀，提高患者生存質(zhì)量，改善預(yù)后。而且能顯著改善利尿劑抵抗現(xiàn)象，恢復(fù)利尿劑的敏感性，取得了較好的近期和遠(yuǎn)期的臨床效果[1]。此外，我們課題組在缺氧誘導(dǎo)的人心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，XST水提物能提高心肌細(xì)胞缺氧的耐受性，藥物干預(yù)組細(xì)胞的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)比對(duì)照組細(xì)胞有明顯改善。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該藥物能降低脂質(zhì)過(guò)氧、抑制自由基產(chǎn)生，改善細(xì)胞缺氧再灌注損傷，提高細(xì)胞抗氧化能力，提高細(xì)胞的存活率[2]。近期發(fā)現(xiàn)，該藥物水提物能上調(diào)心肌細(xì)胞的水通道蛋白-1 ( aquaporin-1)，改善細(xì)胞膜的通透性，緩解缺血區(qū)心肌細(xì)胞的水腫，心肌細(xì)胞對(duì)缺血的耐受性明顯增強(qiáng)，心肌細(xì)胞的損傷減少，對(duì)缺氧損傷性細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用[3]。近期我們?cè)谂R床研究中發(fā)現(xiàn)，該藥物還能作用于腎小管中水通道蛋白-2 ( aquaporin-2) ，抑制水的重吸收，從而起到利尿效果，改善鈉水潴留癥狀[4]。

本次實(shí)驗(yàn)采用模擬臨床口服給藥途徑，最高藥物濃度( 能順利通過(guò)灌胃針頭) 和最大胃容納量0.4 mL/10g給小鼠灌胃，連續(xù)觀察14 d，未見(jiàn)死亡，未測(cè)出LD50。急性毒性試驗(yàn)表明，XST的最大耐受量為204.24 g?kg-1，相當(dāng)于成人臨床用量的400 倍，該藥物最大劑量未見(jiàn)毒性及動(dòng)物死亡現(xiàn)象。

在本次實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)劑量連續(xù)給小鼠灌胃14 d，也未見(jiàn)小鼠的外觀皮毛、行為變化，飲食情況出現(xiàn)異常, 大小便及分泌物也未見(jiàn)異常。XST水提物能增加小鼠尿液的排尿量，但對(duì)尿液性質(zhì)和血電解質(zhì)未見(jiàn)不良影響，對(duì)心肝腎功能，以及心、肝、脾、肺、腎等臟器系數(shù)及病理學(xué)組織也未發(fā)現(xiàn)異常影響。提示XST對(duì)上述器官無(wú)病理性損害。停藥1周后再次檢查上述各項(xiàng)目，3個(gè)劑量組之間以及與對(duì)照組之間無(wú)顯著差別，表明該藥物耐受性好，也無(wú)延遲毒性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明，該藥物在規(guī)定劑量下服用是安全可靠，為臨床安全性用藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 譚春江,陳文列,林久茂,等.心水通膠囊對(duì)慢性心力衰竭患者利尿劑抵抗的臨床研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2011,29(4)∶837.

[2] 蕭璐,譚春江,吳巖斌.心水通膠囊水提物對(duì)缺氧損傷性人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞LDH、MDA和SOD的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào).2013,41(6)∶47.

[3] Chunjiang Tan,Yanbin Wu,Wenlie Chen,et al. Xinshuitong capsule ameliorates hypertrophy of cardiomyocytes via aquaporin pathway in the ischemia–reperfusion rat hearts.International[J] .Journal of Cardiology, 2011,152∶ S54.

[4] Chunjiang Tan,Lu Xiao,Songming Chen.Xinshuitong Capsule via aquaporin-2 enhances Xinshuitong Capsule via aquaporin-2 enhances the diuretic effect in the chronic heart failure patients[J]. JACC.

Experimental research on the acute toxicology of the water-extracts of Xinshuitong Capsule

/TAN Chun-jiang, ZHANG Jia-hui, ZENG Jian-wei, WU Yan-bin, CHEN Wen-lie//(Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian)

Objective:The acute toxicology was investigated after intragastric administration of the water extract of Xinshuitong Capsule to mice.Method:The difference concentrations of water extract according to the maximum stomach volume were intragastricly administered for continuous 14 days. The normal diet group was used as the control group. The alterations of the hair color, activity, weight, urine volume and its compositions were observed. The blood electrolytes change, the functions of heart, liver and kidney and some visceral histopathology changes were detected.Result:The maximum tolerance dosage of the water extract of Xinshuitong Capsule was 204.24 g?kg-1, which was equivalent to nearly 400 times of adults (60 kg) clinical dosage. From the second day to the end of the experiments, the urine volume in the treated groups was significantly increased compared with that of the control group in a dose-dependent manner. However, the mice appearance, behavior, diet, weight, urine compositions, secretions, blood electrolytes, heart, liver and kidney functions showed no significance difference compared with the control group. No signs of typical in flammation, hyperplasia, shrink or other pathological changes in heart, liver, spleen, lung and kidney were found in each drug group. And the pathological condition was similar to the control group.Conclusion:The water extract of Xinshuitong Capsule has no obvious acute toxicological reactions which can be safely applied in clinic.

Water-extracts of Xinshuitong Capsule; acute toxicology; intragastric administration; mice; maximum tolerance of medicine

R 285.5

A

1674-926X(2017)06-014-03

福建省科技廳對(duì)外合作重點(diǎn)項(xiàng)目（2014I0012）；福建省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)（wzzy20131）；福建中醫(yī)藥大學(xué)校管重點(diǎn)學(xué)科專項(xiàng)（X2014137）

福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 福建350122

譚春江，男，副研究員，主要從事中西醫(yī)結(jié)合心血管疾病的研究Tel∶0591-22861166 Email∶tchunj@126.com

陳文列，男，研究員，主要從事中西醫(yī)結(jié)合研究Tel∶0591-22861166 Email∶chen.wl@163.com

2017-06-29

（責(zé)任編輯：陳思敏）