陶明寶，鄢玉芬，陳林，劉友平，陳鴻平

·品種品質(zhì)·

瓦楞子及其混偽品成分的比較分析研究

陶明寶，鄢玉芬，陳林，劉友平，陳鴻平

目的：探討瓦楞子及其混偽品在成分上的差異性，為市售瓦楞子的合理安全用藥提供依據(jù)。方法：本實驗擬對所有樣品的碳酸鈣含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量、水浸液pH值及水解后樣品中的總氨基酸含量進行測定。結(jié)果：所有樣品的碳酸鈣含量為90.55 %～99.22 %、水煎液Ca2+含量為0.101 %～0.157 %、水溶性浸出物含量為0.16%～0.59 %、水浸液pH值為9.25～9.52、總氨基酸含量為0.020 %～0.099 %。結(jié)論：瓦楞子及其混偽品碳酸鈣含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量、水浸液pH值及總氨基酸含量無明顯差異。

瓦楞子；混偽品；碳酸鈣；總氨基酸

瓦楞子為蚶科動物毛蚶Arca subcrenataLischke、泥蚶Arca granosaLinnaeus或魁蚶Arca in fl ataReeve的貝殼。別名蚶子殼、毛蛤、瓦垅等[1]，具有消痰化瘀，軟堅散結(jié)，制酸止痛的功效，主治頑痰膠結(jié)、黏稠難咯、癭瘤、瘰疬、癥瘕痞塊、胃痛泛酸。藥材藥效明確，應(yīng)用廣泛，但其混偽品較多，質(zhì)量控制尚不完善。瓦楞子及其混偽品主要由無機成分和有機成分組成，其中以無機成分為主，主要由碳酸鈣組成，有機成分以含量不等的蛋白質(zhì)為主。文獻報道，瓦楞子以碳酸鈣為主[2-4]，含有14～16種氨基酸[5-6]。

目前，蚶科同屬不同種及不同屬的品種較多，由于偽品與瓦楞子極為相似，不易區(qū)別，各地經(jīng)銷使用常有混偽現(xiàn)象，從而造成了瓦楞子入藥品種的混亂。本實驗共收集到舟蚶、密肋粗飾蚶、結(jié)蚶、異毛蚶、球蚶五種偽品，均混合在瓦楞子中銷售使用，瓦楞子用藥的安全性、有效性及合理性難以保障。因此，本研究以瓦楞子及其混偽品的主要成分為研究目標(biāo)，從碳酸鈣含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量、水浸液pH值及總氨基酸含量五個方面進行系統(tǒng)的比較研究。通過比較分析研究，以期為瓦楞子臨床用藥的安全性、合理性提供基礎(chǔ)，同時為瓦楞子擴大藥源提供一定的依據(jù)。

1 材料

UV-2600紫外分光光度計(日本島津)；QT-1旋渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；85-2控溫磁力攪拌器(江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；十萬分之一BP211D電子天平，萬分之一BP121S9電子天平（德國Sartouris股份有限公司）；SB25-12D 超聲清洗機（上海冠特超聲儀器有限公司）；UPT-I-10T 優(yōu)普系列超純水機（成都超純科技有限公司）。

甘氨酸對照品(140689-200401)購自中國藥品生物制品檢定所；基準(zhǔn)氧化鋅(2016042101)、茚三酮、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸、苯酚、氫氧化鉀、氯化銨、乙二胺四乙酸二鈉、鈣黃綠素、甲基紅、氯化鈉、氯化鉀、氨水(氫氧化銨)、鉻黑T均為分析純，購自成都市科龍化工試劑廠。

所有藥材均為市售品及產(chǎn)地收集，共收集56批，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院盧先明教授鑒定，其中分離鑒定出毛蚶8批、泥蚶18批、魁蚶8批、舟蚶3批、密肋粗飾蚶4批、結(jié)蚶4批、異毛蚶8批、球蚶3批，樣品收集信息見表1。

表1 樣品信息

in fl ata Reeve）東山KH-17魁蚶（Arca in fl ata Reeve）福建省廈門市福建廈門2016/11/18

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所收集的樣品中，瓦楞子偽品混在其中，少則一種多達五種以上，其混偽品主要有密肋粗飾蚶、結(jié)蚶、舟蚶、球蚶、異毛蚶，混偽品在樣品中比重較大，外觀性狀與瓦楞子極為相似；所收集的樣品中，魁蚶中多混有密肋粗飾蚶，毛蚶中多混有異毛蚶，泥蚶中多混有結(jié)蚶；目前市面上主要流通的偽品為異毛蚶和球蚶，其次是密肋粗飾蚶，流通較少的是結(jié)蚶和舟蚶。瓦楞子的三個基源具有明顯的地域特征，泥蚶主要產(chǎn)自福建，魁蚶主要產(chǎn)自山東、廣東，毛蚶主要產(chǎn)自廣西。

2 方法與結(jié)果

2.1 總鈣含量測定

2.1.1 EDTA-2Na滴定液標(biāo)定 取于約800 ℃灼燒至恒重的基準(zhǔn)物氧化鋅0.12 g，精密稱定5份，加稀鹽酸3 mL使溶解，加水25 mL，加0.025 %甲基紅的乙醇溶液1滴，滴加氨試液至溶液顯微黃色，加水25 mL與氨-氯化銨緩沖液（pH=10.0）10 mL，再加鉻黑T指示劑少量，用本液滴定至溶液由紫色變?yōu)榧兯{色，并將滴定的結(jié)果用空白試驗校正。每1 mL EDTA-2Na（0.05 moL?L-1）相當(dāng)于4.069 mg的氧化鋅。結(jié)果表明，EDTA-2Na溶液平均消耗量為29.41 mL，經(jīng)計算本滴定液濃度為0.0503 moL?L-1，每1 mL此滴定液相當(dāng)于5.030 mg的碳酸鈣。

計算公式：C=0.05*m/[0.004069*(V1-V2)]

（C為EDTA-2Na滴定液濃度moL?L-1；m為基準(zhǔn)氧化鋅的質(zhì)量g；V1為EDTA-2Na滴定液用量mL；V2為空白試驗EDTA-2Na滴定液用量mL）

2.1.2 含量測定 參照《中國藥典》2015年版[7]，蛤殼項下碳酸鈣含量測定方法，取本品細粉約0.12 g，精密稱定，置錐形瓶中，加稀鹽酸3 mL，加熱至微沸使溶解，加水100 mL與甲基紅指示液1滴，滴加氫氧化鉀試液至顯黃色，繼續(xù)多加10 mL，再加鈣黃綠素指示劑少量，用乙二胺四醋酸二鈉滴定液(0.05 moL?L-1)滴定至溶液黃綠色熒光消失而顯橙色。按上述方法對收集的樣品進行碳酸鈣含量測定，計算公式：總鈣含量（%）=（耗EDTA-2Na量（mL）*5.030）*10-3/藥材質(zhì)量（g）*100 %，結(jié)果見表3。

2.2 水煎液Ca2+含量測定

將供試品粉碎過60目篩，取粉末2 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加水50 mL，回流煮沸0.5 h，冷卻后用水補足失重，搖勻，濾過，濾液備用。精密吸取濾液10 mL于250 mL錐形瓶中，加稀鹽酸1 mL，加水50 mL，加甲基紅指示劑1滴，滴加氫氧化鉀試液呈黃色，再加氫氧化鉀試液10 mL，加鈣黃綠素指示劑少許，用乙二胺四醋酸滴定液滴定至溶液黃綠色熒光消失而顯橙色[8-9]。按上述方法對收集的樣品進行水煎液Ca2+含量測定，計算公式：水煎液Ca2+含量（%）=水煎液Ca2+的量（g）/藥材質(zhì)量（g）*100 %，結(jié)果見表3。

2.3 水溶性浸出物含量測定

按《中國藥典》2015年版四部通則浸出物測定法測定[10]，取供試品約2～4 g，精密稱定，置100～250 mL的錐形瓶中，精密加水50～100 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 °C干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量。按上述方法對收集的樣品進行水溶性浸出物的測定，計算公式：水溶性浸出物含量（%）=水溶性浸出物重量（g）/藥材質(zhì)量（g）*100 %，結(jié)果見表3。

2.4 水浸液pH值測定

將供試品粉碎過80目篩，取粉末0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入20 mL煮沸的蒸餾水，振搖10 min，放置30 min，濾過，濾液用精密pH計測其pH值[11]。按上述方法對收集的樣品進行水浸液pH值的測定，結(jié)果見表3。

2.5 總氨基酸測定

2.5.1 對照品溶液的制備 精密稱取甘氨酸對照品5 mg于100 mL量瓶中，加蒸餾水適量溶解，定容至刻度，搖勻，即得(每1 mL含甘氨酸0.05 mg)。

2.5.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末0.5 g，精密稱定，加人2 mL乙醇，混勻，置磁力攪拌器上攪拌，緩慢加入稀鹽酸溶液5 mL，攪拌至反應(yīng)完全，離心，棄去上清，揮干乙醇即得殼角蛋白。將得到的殼角蛋白轉(zhuǎn)移至10 mL安瓿瓶中，加人5 mL 6 moL?L-1鹽酸溶液，加人2～3滴苯酚，充N2封口，置110 ℃烘箱中水解24 h后取出，放冷，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加入6 moL?L-1氫氧化鈉溶液5 mL定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過后即得。取一定量水解樣品，加入1 mL pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液混勻，加入1.5 mL 2 %茚三酮溶液，于100 ℃沸水浴中反應(yīng)20 min后，取出放冷，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶，以蒸餾水洗滌試管3次后，定容至刻度，混勻，于568 nm處測定吸光度。

2.5.3 總氨基酸含量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密移取不同濃度的甘氨酸對照品溶液1 mL于具塞試管中，按顯色方法顯色，于568 nm進行測定。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=229.15X-0.003，相關(guān)系數(shù)r為0.9994，甘氨酸在0.0101～0.0455 mg線性關(guān)系良好。

準(zhǔn)確度

精密移取瓦楞子樣品溶液0.5 mL于具塞試管中，平行制備6份，分別加入甘氨酸對照品溶液（0.056 mg?mL-1）0.5 mL，按顯色方法顯色，于568 nm處測定吸光度值，按公式計算回收率。結(jié)果顯示，6份樣品的回收率均在95 %～105 %，平均回收率為101.8 %，RSD為3.1 %，表明該方法準(zhǔn)確度良好，見表2。

表2 總氨基酸加樣回收率

重復(fù)性試驗

按照供試品制備方法，平行制備六份供試品溶液進行測定，計算結(jié)果的RSD，結(jié)果顯示RSD為3.5%，表明重復(fù)性良好。

精密度試驗

按供試品制備方法，平行制備6份供試品溶液進行測定，結(jié)果顯示RSD為0.09 %，表明該方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0、15、30、45、60 min時測定吸光度，結(jié)果顯示RSD為0.35 %，供試品在1 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.4 樣品測定 按實驗方法，對所有樣品水解液中的總氨基酸進行測定，計算公式：總氨基酸含量（%）=總氨基酸的量（g）/藥材質(zhì)量（g）*100%，結(jié)果見表3。

表3 所有樣品成分含量比較

JH-0196.670.101 0.369.36 0.039 JH-0697.780.106 0.389.38 0.043 JH-1895.630.104 0.259.37 0.057 JH-2197.750.101 0.169.38 0.063 YH-1896.310.123 0.229.40 0.041 YH-1995.230.136 0.289.41 0.074結(jié)蚶（Arcanodifera）

結(jié)果表明，所有樣品碳酸鈣含量為90.55%～99.22 %，水煎液Ca2+含量為0.101 %～0.157 %，水溶性浸出物含量為0.16 %～0.59 %，水浸液pH值為9.25～9.52，總氨基酸含量為0.020 %～0.099 %。所有樣品碳酸鈣含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量及水浸液pH值之間的微小差異可能與不同的種，不同的產(chǎn)地以及購買時藥材的清潔程度有關(guān)。所有樣品氨基酸含量的差異可能與不同的種、不同的產(chǎn)地、藥材殘肉的多少、藥材的清潔程度有關(guān)。藥材殘肉多，氨基酸含量則偏高，藥材殘肉少、清潔度低，氨基酸含量則偏低。因此，從總體上比較分析，瓦楞子及其混偽品的碳酸鈣含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量、水浸液pH值及總氨基酸含量無明顯差異。

3 討論

樣品收集過程中，發(fā)現(xiàn)瓦楞子偽品較多，且在樣品中比重較大，偽品主要有密肋粗飾蚶、結(jié)蚶、舟蚶、球蚶、異毛蚶；市面上主要流通的偽品為異毛蚶和球蚶，其次是密肋粗飾蚶，流通較少的是結(jié)蚶和舟蚶。瓦楞子的三個基源具有明顯的地域特征，泥蚶主要產(chǎn)自福建，魁蚶主要產(chǎn)自山東、廣東，毛蚶主要產(chǎn)自廣西，且有毛蚶的樣品中基本都混雜著異毛蚶。

本研究從5方面對瓦楞子及其混偽品共8個種進行了系統(tǒng)的比較分析研究，通過對碳酸鈣含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量及水浸液pH值的測定，結(jié)果表明瓦楞子正品（毛蚶、泥蚶、魁蚶）與偽品（結(jié)蚶、球蚶、異毛蚶、舟蚶、密肋粗飾蚶）之間無明顯差異；通過采用茚三酮顯色法對瓦楞子及其混偽品中總氨基酸的含量進行測定，分析結(jié)果顯示，瓦楞子正品與偽品間也無明顯差異。

本實驗主要對瓦楞子及其混偽品的碳酸鈣和氨基酸進行了比較分析研究，研究發(fā)現(xiàn)瓦楞子及其混偽品間在成分上無明顯差異，這為瓦楞子臨床用藥的安全性、合理性提供了一定的依據(jù)，同時本實驗也將繼續(xù)借助差熱分析、X-射線衍射和X-熒光分析等手段，進一步對瓦楞子及其混偽品的碳酸鈣晶型、元素種類等進行比較分析研究，以確保市售瓦楞子的安全性、合理性及有效性，同時為資源的充分利用及其臨床應(yīng)用提供可靠依據(jù)。

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Comparative analysis of composition of Walengzi and its counterfeit

/TAO Ming-bao, YAN Yu-fen, CHEN Lin, LIU You-ping, CHEN Hong-ping//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To discuss the differences in the composition of Walengzi and its counterfeit, and provide the basis for the rational use of the commercially available Walengzi.Method:The content of calcium carbonate in all samples, the content of Ca2+in water, the content of water soluble extract, the pH value of aqueous solution and the total amino acid content in the sample after hydrolysis were detected.Result:The content of calcium carbonate was 90.55 %～99.22 %. The content of Ca2+in the decoction was 0.101 %～0.157 %. The content of water soluble extract was 0.16 %～0.59 %. The pH value of the aqueous solution was 9.25～9.52. The total amino acid content was 0.020 %～0.099 %.Conclusion:No significant differences in the content of calcium carbonate, the content of Ca2+, the content of water soluble extract, the pH value and total amino acid content of water extract are found among Walengzi and its counterfeit.

Walengzi; counterfeit goods; calcium carbonate; total amino acid

R 282.6

A

1674-926X(2017)06-002-05

《全國中藥飲片炮制規(guī)范》研究項目(2015-YP-48)

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

陶明寶（1992-），女，在讀碩士，從事中藥化學(xué)成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究Tel∶18728431648 Email∶2587578725@qq.com

陳鴻平（1980-），女，博士，從事中藥炮制、中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究Tel∶13982283303 Email∶chenhongping@126.com

2017-07-20

（責(zé)任編輯：胡慧玲）