聶斌英，關(guān)愛國，袁波

（1.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春 336000；2.江西科技職業(yè)學(xué)院，江西南昌 330200；3.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春 336000）

亞香棒蟲草內(nèi)生真菌C-10轉(zhuǎn)化多糖發(fā)酵工藝探討

聶斌英1，關(guān)愛國2，袁波3

（1.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春 336000；2.江西科技職業(yè)學(xué)院，江西南昌 330200；3.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春 336000）

以亞香棒蟲草中分離出的內(nèi)生真菌C-10為試驗菌種，利用培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)C-10，用來轉(zhuǎn)化多糖，通過單因素試驗，探討pH、光照情況、營養(yǎng)因子、振蕩、金屬離子對蟲草多糖的影響。試驗表明，亞香棒蟲草內(nèi)生真菌C-10在pH 6.2條件下發(fā)酵液中多糖較多，含量為0.3723mg/mL；pH 5.7條件下菌絲體中多糖量較多，含量為0.2909mg/mL。避光條件下菌絲體中多糖較多，含量為0.5035mg/mL；不避光條件下發(fā)酵液中多糖較多，含量為0.036mg/mL。正常搖蕩條件下菌絲體中多糖較多，含量為0.3409mg/mL；前2d搖蕩、后3d靜置條件下發(fā)酵液中多糖較多，含量為0.0456mg/mL。加入甲硫氨酸的條件下，菌絲體和發(fā)酵液中的多糖都較多，菌絲體中多糖含量為0.7758mg/mL，發(fā)酵液中多糖含量為0.0478mg/mL；加入錳離子的培養(yǎng)條件下，發(fā)酵液中和菌絲體中多糖含量較多，分別為 0.6072mg/mL、0.1989mg/mL。

亞香棒蟲草；內(nèi)生真菌；多糖；發(fā)酵工藝

亞香棒蟲草（Cordyceps hawkesiiGray）屬植物界真菌門蟲草菌屬，藥性甘，有益精止血、補益肺腎的功效，主治身體虛弱、肺結(jié)核。它生長于林中落葉層下的鱗翅目幼蟲上，主要分布于湖南、貴州，也有少量分布于廣西、廣東、四川、湖北、安徽、云南等地[1]。亞香棒蟲草含有氨基酸、多糖、麥角甾醇、甘露醇、生物堿、有機(jī)酸、煙酸、煙酰胺、維生素C、鐵、銅、鋅、錳、鉻和鈷等營養(yǎng)成分，因為有抗氧化、抗腫瘤、降低血液中三油甘酯和膽固醇含量等較多的藥理作用而倍受關(guān)注[2]。

內(nèi)生真菌是在宿主植物的莖和葉內(nèi)生存并完成生活周期的真菌。這類真菌中，有許多種類很少形成孢子，或者在宿生植物上形成的孢子（或者孢子果）不容易識別。真菌感染植物組織，菌絲存在于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間。與病原菌不同的是這些真菌對宿主植物幾乎沒有害處，它們和植物之間或者是相互依存的共生關(guān)系，或者是不太密切的共生關(guān)系。內(nèi)生真菌生長在宿主植物的根莖葉等組織內(nèi)部，最開始是在紅豆杉的韌皮部位分離到安德氏紫杉霉，能夠產(chǎn)生紫杉醇，由此引起了微生物學(xué)家、植物學(xué)家、生態(tài)學(xué)家對內(nèi)生真菌的廣泛興趣。

蟲草多糖具有抗腫瘤、抗傳染病、增強性功能、補腎壯陽、益精氣、防衰老、延年益壽，對老年人慢性支氣管炎、肺源性心臟病有顯著的功效，能提高肝臟的解毒能力，起到護(hù)肝、降血糖、降血脂的作用。貧血的患者可用于補血、增強脾臟的營養(yǎng)性血流量。蟲草多糖生物活性強、適應(yīng)性廣，還具耐缺氧、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等作用[3]。

菌絲體多糖具有和子實體多糖同樣的藥理活性，傳統(tǒng)的真菌多糖提取多采用子實體為材料，但由于子實體栽培周期長、勞動強度大，受氣候、環(huán)境的影響，產(chǎn)量及質(zhì)量不穩(wěn)定，且子實體木質(zhì)化程度高[4]，多糖提取利用率較低。與之相反，采用生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)菌絲體，周期短、成本低、產(chǎn)量大，且有工業(yè)化生產(chǎn)前景，因此，利用生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)真菌多糖已是大勢所趨，有助于保護(hù)蟲草資源。本試驗探討了pH、光照情況、營養(yǎng)因子、振蕩、金屬離子這幾個因素對蟲草內(nèi)生真菌生產(chǎn)多糖的影響，旨在對蟲草內(nèi)生真菌產(chǎn)多糖的培養(yǎng)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，使其能夠產(chǎn)更多更優(yōu)質(zhì)的多糖。

1 材料與設(shè)備

1.1 供試菌株

亞香棒蟲草內(nèi)生真菌C-10（菌絲細(xì)長緊密，顏色是鵝黃色），宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院提供。

1.2 儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱，LRH-250；循環(huán)水真空泵，SHZ-3型；臺式離心機(jī)，TDL-40B；快速混勻器，SK-1；超凈工作臺，SW-CJ-2D；搖床，ZWY-211B；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，LX-B35L型；數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-4；紫外可見分光光度計，UV-2800AH型；電子天平，YP1201N，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；海爾冰箱，BCD-211BSA，青島海爾股份有限公司。

1.3 試劑

瓊脂、氨芐青霉素、維生素B1、豆粕、麩皮、玉米粉、葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、甲硫氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、蛋白胨、酵母粉，以上為生化級試劑。

磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硝酸銨、硫酸鋅、磷酸氫二鉀、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸、乙醇、乙醚、苯酚、蒽酮，以上為分析純試劑。

2 試驗方法

2.1 操作流程圖

操作流程圖見圖1。

圖1 操作流程圖

2.2 操作要點

2.2.1 菌種活化

根據(jù)所需配制成的體積數(shù)，計算出各成分的含量，稱取200g去皮馬鈴薯切碎，在鍋中煮沸，煮沸后按馬鈴薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨1%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.1%、瓊脂2.2%的配方加入溶解。為抑制細(xì)菌的污染需加入一定的抗生素，同時為了防止殺菌后的污染，往100mL的培養(yǎng)基中加0.1g氨芐青霉素，搖勻并分裝成10根試管，把所有器具培養(yǎng)基接種環(huán)放入立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器中，121℃殺菌30min，在超凈工作臺上分別向裝有300mL培養(yǎng)基的三角瓶中加200mg/L的氨芐青霉素。將試驗材料亞香棒蟲草內(nèi)生真菌C-10菌種接種到活化培養(yǎng)基上，接種時一定要防止染菌，接種后包扎好放入生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并設(shè)定溫度25℃，培養(yǎng)7d。

2.2.2 種子液擴(kuò)大培養(yǎng)

稱取馬鈴薯200g，煮制馬鈴薯溶液，加入葡萄糖2%、蛋白胨1%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.1%。水浴加熱并不斷攪拌，直至蛋白胨和葡萄糖完全溶解后，加水定容至2000mL，加入200mg/L氨卡青霉素，用250mL三角瓶按150mL裝液量分裝，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌20min，冷卻后，在超凈工作臺上，從活化培養(yǎng)基中挑選活化最好的菌絲，接種到種子液培養(yǎng)基上，菌絲接種4個培養(yǎng)基，接種時一定要防止染菌，放入搖床中，設(shè)置溫度25℃，轉(zhuǎn)速150r/min，時間 168h（7d）。

2.2.3 發(fā)酵轉(zhuǎn)化

馬鈴薯溶液，加入玉米粉10g/L、麩皮3g/L、半乳糖10g/L、葡萄糖 7g/L、麥芽糖 20g/L、硝酸銨 2g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨 4g/L、豆粕 4g/L、硫酸鎂 0.5g/L、維生素 B10.1g/L、硫酸鋅0.5g/L、磷酸二氫鉀0.4g/L、磷酸氫二鉀0.4g/L、硫酸鐵0.2g/L、氨卡青霉素，制成溶液備用。在不同條件下，在生化培養(yǎng)箱中挑選培養(yǎng)最好的C-10菌種的種子液進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，設(shè)定搖瓶條件25℃、150r/min，培養(yǎng) 5d。

2.2.4 發(fā)酵液多糖的分離提純

取出發(fā)酵培養(yǎng)基，逐個真空抽濾出固體菌絲體保存并貼好標(biāo)簽，將過濾液進(jìn)行離心處理，離心裝置設(shè)置為4000r/min離心15min，取上清液濃縮，加入3倍于液體的95%乙醇（醇解多糖），沉淀10h過濾得到粗糖固體。用乙醚洗除去脂肪，再次過濾得到除去脂肪蛋白質(zhì)的多糖，加水溶解得到多糖溶液，定容。

2.2.5 胞內(nèi)多糖的分離提純

將上面過濾出的固體菌絲體用等電點鹽析法去除蛋白質(zhì)，加水離心，取沉淀菌體再用30mL、80%乙醇溶解，放入三角瓶中超聲30min，過濾得到固體沉淀，水浴超聲10min，加20mL乙醚，再次過濾，得到上清液，定容。

2.3 測定指標(biāo)與方法

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

葡萄糖制成濃度0.1g/L，精密吸取0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL置于比色管中補充水到 2mL，在冰水中加蒽酮硫酸溶液（稱取0.2g蒽酮，加入100mL硫酸溶解即得）5mL，注意保持混合物冷卻，加完后密封，搖勻，于沸水浴中加熱10min取出后用自來水冷卻，同樣方法處理空白對照，621nm下測吸光度。測得數(shù)據(jù)制成萄萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 樣液的多糖測定

準(zhǔn)確量取提取液0.1mL于10mL比色管中，加入1.9mL蒸餾水，再加入濃度2g/L的蒽酮硫酸溶液2mL，搖勻，迅速加入5mL濃硫酸搖勻靜置10min，以0管為空白，于621nm波長測定得吸光度。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 結(jié)果與分析

3.1 pH對蟲草多糖產(chǎn)量的影響

pH對微生物的生命活動有很大的影響，能使蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子所帶電荷發(fā)生變化，從而影響其生物活性；還能引起細(xì)胞膜電荷變化，導(dǎo)致微生物細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)能力改變；甚至改變環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的可給性及有害物質(zhì)的毒性[5]。蟲草多糖內(nèi)生真菌液體深層培養(yǎng)要求適宜的pH。為考察不同的初始pH對亞香棒蟲草內(nèi)生真菌產(chǎn)多糖的影響，取馬鈴薯溶液，分裝到6個250mL錐形瓶內(nèi)，兩兩分別調(diào)節(jié)pH至5.2、5.7、6.2，其他條件相同，并定容至100mL，在溫度25℃、150r/min的條件下，培養(yǎng)5d，測定多糖含量。測定結(jié)果見表1。

表1 pH對于蟲草多糖產(chǎn)量的影響

在pH 5.2的條件下，菌絲體內(nèi)的多糖測得為0.1872mg/mL，發(fā)酵液多糖含量0.0658mg/mL。pH5.7的條件下，菌絲體內(nèi)多糖測得為0.2909mg/mL，發(fā)酵液多糖含量0.036mg/mL。pH 6.2的條件下，菌絲體內(nèi)多糖測得為0.1794mg/mL，發(fā)酵液多糖含量0.3723mg/mL。3個pH中，pH為6.2的條件下發(fā)酵液中多糖較多，pH為5.7時菌絲體產(chǎn)多糖較多。

3.2 振蕩對于蟲草多糖產(chǎn)量的影響

發(fā)酵液中溶氧量對于蟲草內(nèi)生真菌的生長有一定影響，振蕩能夠增加發(fā)酵液中的溶氧量，但振蕩增加的發(fā)酵液中的氧氣含量是否能夠促進(jìn)蟲草內(nèi)生真菌C-10產(chǎn)多糖，有待試驗。由此設(shè)置以下試驗條件。試驗結(jié)果如表2。

表2 振蕩對于蟲草多糖產(chǎn)量的影響

振蕩條件下，菌絲體內(nèi)多糖測得為0.3409mg/mL，發(fā)酵液多糖含量0.036mg/mL。前2d振蕩后、3d靜置條件下，菌絲體內(nèi)多糖測得為0.2909mg/mL，發(fā)酵液多糖含量0.0456mg/mL。靜置條件下，菌絲體內(nèi)多糖測得為0.2533mg/mL，發(fā)酵液多糖含量0.0151mg/mL。由表2可知，正常搖蕩下，蟲草內(nèi)生真菌菌絲體產(chǎn)生多糖最多，前2d振蕩、后3d靜置條件下，發(fā)酵液中多糖量較多。

3.3 遮光對于蟲草多糖產(chǎn)量的影響

光照強度對于蟲草內(nèi)生真菌的生物學(xué)效率和物質(zhì)轉(zhuǎn)換效率有影響[6]。為了考察光照對于蟲草內(nèi)生真菌產(chǎn)多糖的影響，對培養(yǎng)基進(jìn)行遮光處理，作對比試驗。試驗結(jié)果如表3。

表3 避光對于蟲草內(nèi)生真菌產(chǎn)多糖的影響

遮光條件下，菌絲體內(nèi)多糖測得為0.5035mg/mL，發(fā)酵液多糖含量0.0239mg/mL。不避光條件下菌絲體內(nèi)多糖測得為0.2909mg/mL，發(fā)酵液多糖含量0.0360mg/mL。由數(shù)據(jù)可得，遮光條件下蟲草真菌菌絲體多糖較多。不避光條件下，發(fā)酵液中多糖含量較多。

3.4 營養(yǎng)因子對于蟲草多糖產(chǎn)量的影響

氨基酸作為有機(jī)氮源，是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)最最基礎(chǔ)的物質(zhì)，與生物體的活動有著密切聯(lián)系，是生物體內(nèi)不可缺少的營養(yǎng)成分之一[7]。為考察氨基酸對亞香棒蟲草內(nèi)生真菌產(chǎn)多糖的最佳氨基酸種類，另取馬鈴薯溶液，分裝到8個250mL錐形瓶里；兩兩分別加入0.1g甲硫氨酸、0.1g甘氨酸、0.1g苯丙氨酸，另外兩個加入0.033g甲硫氨酸、0.033g甘氨酸、0.033g苯丙氨酸，其他條件相同，定容到100mL，在其他培養(yǎng)條件一致的情況下，培養(yǎng)5d，測定多糖產(chǎn)量。測定結(jié)果如表4。

表4 營養(yǎng)因子對于蟲草多糖產(chǎn)量的影響

加入甲硫氨酸的條件下菌絲體內(nèi)多糖為0.7757mg/mL，發(fā)酵液多糖含量0.0478mg/mL。加入苯丙氨酸的條件下菌絲體內(nèi)多糖測得為0.2494mg/mL，發(fā)酵液多糖含量0.0210mg/mL。加入甘氨酸的條件下菌絲體內(nèi)多糖測得為0.3560mg/mL，發(fā)酵液多糖含量0.0313mg/mL。加入3種氨基酸平均量的條件下菌絲體內(nèi)多糖測得為0.742mg/mL，發(fā)酵液多糖含量0.0398mg/mL。明顯，加有甲硫氨酸的培養(yǎng)基蟲草多糖顯著增加，所以培養(yǎng)基中加入甲硫氨酸可以提高多糖的產(chǎn)量。

3.5 錳離子對蟲草多糖產(chǎn)量的影響

錳離子對亞香棒蟲草內(nèi)生真菌有富集和耐受特性，能促進(jìn)菌絲體對微量元素的吸收和抑制Mg的吸收[8]。因此，為了考察錳離子對亞香棒蟲草內(nèi)生真菌的影響，取馬鈴薯溶液，分裝到4個250mL錐形瓶里，其中兩個加入0.1g硫酸錳，另外兩個不加，其他條件相同，定容至100mL，得到優(yōu)化錳離子對蟲草內(nèi)生真菌產(chǎn)多糖的培養(yǎng)基。相同條件下，做加錳離子和不加錳離子的對比試驗，試驗結(jié)果如表5。

表5 錳離子對蟲草多糖產(chǎn)量的影響

加了錳離子的條件下菌絲體內(nèi)多糖測得為0.6072mg/mL，發(fā)酵液多糖含量0.1989mg/mL。不加錳離子的條件下菌絲體內(nèi)多糖測得為0.2909mg/mL，發(fā)酵液多糖含量0.0360mg/mL。由此可以看出，培養(yǎng)基中適當(dāng)加入錳離子，蟲草多糖相比沒有加錳離子的明顯增加，所以建議在培養(yǎng)基中加錳離子。

4 結(jié)論

亞香棒蟲草內(nèi)生真菌C-10在pH 6.2條件下發(fā)酵液中多糖較多，含量為0.3723mg/mL，pH 5.7條件下菌絲體中多糖量較多，含量為0.2909mg/mL。避光條件下菌絲體中多糖較多，含量為0.5035mg/mL，不避光條件下發(fā)酵液中多糖較多，含量為0.0360mg/mL。正常搖蕩條件下菌絲體中多糖較多，含量為0.3409mg/mL、，前2d搖蕩、后3d靜置條件下發(fā)酵液中多糖較多，含量為0.0456mg/mL。加入甲硫氨酸的條件下，菌絲體和發(fā)酵液中的多糖都較多，菌絲體中多糖含量為0.7758mg/mL，發(fā)酵液中多糖含量為0.0478mg/mL。加入錳離子的培養(yǎng)條件下，發(fā)酵液中和菌絲體中多糖含量較多，含量分別為0.6072mg/mL、0.1989mg/mL。所以，pH 6.2，不避光，加入甲硫氨酸，加入錳離子，前2d搖蕩、后3d靜置條件下對蟲草內(nèi)生真菌發(fā)酵液中多糖含量提升有促進(jìn)作用。pH 5.7，避光，加入甲硫氨酸，加入錳離子，正常搖蕩條件下能提高蟲草內(nèi)生真菌菌絲體中多糖產(chǎn)量。

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Study on Fermentation Technology of Polysaccharides from Cordyceps Militaris Endophytic Fungus C-10

NIE Bin-ying1,GUANAi-guo2,YUANBo3

(1.School ofChemistryand Bioengineering,Yichun University,Yichun 336000,China;2.Jiangxi University ofScience and Technology,Nanchang 330200,China;3.College ofChemistryand Biological Engineering,Yichun University,Yichun 336000,China)

The endophytic fungus C-10 isolated from Cordyceps militaris was used as the test strain,and the endophytic fungi were cultured in medium to convert polysaccharide.Through single factor test,the effects of pH,light,nutritional factors,oscillation,and metal ions on Cordyceps polysaccharide were investigated.Test showed that polysaccharide in the fermented liquid produced by endophytic fungi C-10 under the condition of pH 6.2 was more,and the content was 0.3723mg/mL.Under the condition of pH 5.7 mycelium polysaccharide in quantity was more,and the content was 0.2909mg/mL.Under the condition of avoiding light conditions,the content of polysaccharides in the mycelium,was 0.5035mg/mL.The content of polysaccharide in fermented liquid was more,which was 0.036mg/mL under the condition of light.Under the condition of normal oscillation,the content of polysaccharides in the mycelium was more,which was 0.3409mg/mL.Under the condition of two days swing and three days static,the content of polysaccharide in the fermented liquid was more,which was 0.0456mg/mL.Under the condition of methionine,there were more polysaccharides in mycelia and fermentation broth,and mycelium polysaccharide content was 0.7758mg/mL,and the polysaccharide content in the fermented liquid was 0.0478mg/mL.Under the condition of adding manganese ion,the content of polysaccharide in the fermentation broth and in the mycelia was more,and the content was 0.6072mg/mL,0.1989mg/mL.

Cordyceps hawkesiiGray;endopHytic;polysaccharide;fermentation technology

Q815

A

1008-1038(2017)11-0006-05

10.19590/j.cnki.1008-1038.2017.11.002

2017-08-27

聶斌英（1969—），女，副教授，主要從事生物工程方面的科研和教學(xué)工作