廖曉燕+王晨露+彭驚鴻+楊雨青+鐘琇+梁淑彩+肖玉秀

摘要：目的 建立膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法測定鼻淵舒口服液中梔子苷含量的方法。方法 以對(duì)乙酰氨基酚為內(nèi)標(biāo)，采用未涂層融硅石英毛細(xì)管柱（52 cm×50 μm ID，有效長度42 cm），以50 mmol/L硼砂溶液+100 mmol/L十二烷基硫酸鈉+15%乙腈為運(yùn)行緩沖液（pH=10），分離電壓25 kV，壓力進(jìn)樣0.5 psi×10 s，檢測波長238 nm。結(jié)果 梔子苷在15.02～320.48 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 5）；低、中、高濃度樣品測定結(jié)果的RSD均小于1.77%，中間精密度RSD=2.01%。鼻淵舒口服液中梔子苷低、中、高濃度樣品平均回收率為97.50%，RSD=4.43%，梔子苷的膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法測定結(jié)果與HPLC測定結(jié)果相符。結(jié)論 本研究建立的膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法簡便、快速、準(zhǔn)確度高、精密度好，可用于測定鼻淵舒口服液中梔子苷的含量。

關(guān)鍵詞：鼻淵舒口服液；梔子苷；膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法；含量測定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.017

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）12-0068-04

Content Determination of Geniposide in Biyuanshu Oral Liquid by Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography LIAO Xiao-yan， WANG Chen-lu， PENG Jing-hong， YANG Yu-qing， ZHONG Xiu， LIANG Shu-cai， XIAO Yu-xiu （School of Pharmaceutical Science of Wuhan University， Wuhan 430071， China）

Abstract： Objective To establish a micellar electrokinetic capillary chromatography method for content determination of geniposide in Biyuanshu Oral Liquid. Methods Acetaminophen was used as an internal standard， and the separation was performed on an uncoated fused silica capillary of 52 cm × 50 ?m ID （42 cm effective length） with the separation voltage of 25.0 kV. The running buffer contained 50 mmol/L borax， 100 mmol/L sodium dodecyl sulfate and 15% acetonitrile （pH=10）. The sample was injected by pressure （10 s， 0.5 psi） and detected at 238 nm. Results Geniposide was in good linearity range of 15.02–320.48 μg/mL （r=0.999 5）. The repeatability （low， medium and high concentration of samples） and intermediate precision assays gave satisfactory RSD values of less than 1.77% and 2.01%， respectively. The average recovery of geniposide in Biyuanshu Oral Liquid was 97.50% and the RSD was 4.43%. The contents of geniposide determined by micellar electrokinetic capillary chromatography were in accordance with the results of HPLC analysis. Conclusion The method is simple， fast， accurate and precise， which can be used for the content determination of geniposide in Biyuanshu Oral Liquid.

Key words： Biyuanshu Oral Liquid； geniposide； micellar electrokinetic capillary chromatography； content determination

梔子苷為梔子的主要活性成分?，F(xiàn)已有一些梔子苷的毛細(xì)管電泳檢測方法研究[1-5]，直接用區(qū)帶毛細(xì)管電泳法或利用外標(biāo)法進(jìn)行檢測，存在結(jié)果易受其他未知成分干擾和定量檢測誤差較大的缺點(diǎn)。采用膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法（MEKC），利用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行檢測，可在一定程度上克服上述缺點(diǎn)。鼻淵舒口服液收載于

基金項(xiàng)目：武漢大學(xué)教學(xué)改革研究項(xiàng)目（JG201469、JG201670）；武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)項(xiàng)目（WHU-2014-SYJS-07）；武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部教學(xué)改革研究項(xiàng)目（2016017）

通訊作者：肖玉秀，E-mail：yuxiuxiao2011@whu.edu.cn

2015年版《中華人民共和國藥典》（一部），由蒼耳子、辛夷、薄荷、白芷、黃芩、梔子等13味藥組成，成分復(fù)雜。其為解表劑，具有疏風(fēng)散熱、祛濕通竅功效，廣泛應(yīng)用于臨床[6-9]。梔子苷是配方中梔子的主要活性成分[10]，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用HPLC測定其含量，也有文獻(xiàn)采用HPLC對(duì)其他單一有效成分進(jìn)行含量測定[11-13]。本試驗(yàn)建立鼻淵舒口服液中梔子苷含量測定的MEKC檢測方法。endprint

1 儀器與試藥

P/ACE MDQ型高效毛細(xì)管電泳儀（32 Karat工作站8.0，美國貝克曼），島津LC-20AD高效液相色譜儀（配SPD-20A檢測器、LC solution工作站），SB-3200DTN超聲波清洗器（寧波新芝生物科技），ME55電子天平（梅特勒-托利多），未涂層彈性融硅石英毛細(xì)管柱（52 cm×50 μm ID，有效長度42 cm，河北永年）。

梔子苷對(duì)照品（阿拉丁公司，批號(hào)J1226047），鼻淵舒口服液（成都華神集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)140609、141211、140721），對(duì)乙酰氨基酚（武漢銀河化工有限公司，批號(hào)y06092661）。乙腈、37%鹽酸、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉（SDS），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硼砂，武漢市江北化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 內(nèi)標(biāo)貯備液 精密稱取對(duì)乙酰氨基酚15.00 mg，置于100 mL量瓶中，加50%乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，制成150 ?g/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液。

2.1.2 對(duì)照品溶液 精密稱定梔子苷對(duì)照品20.03 mg，置50 mL量瓶中，加50%乙腈溶液溶解稀釋至刻度，制成400.6 ?g/mL的溶液，作為對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液2 mL，加入內(nèi)標(biāo)貯備液2 mL，加50%乙腈溶液溶解稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液 精密量取本品1 mL，置于50 mL量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)貯備液10 mL，加50%乙腈溶液溶解稀釋至刻度，搖勻，用0.45 ?m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液 取鼻淵舒口服液處方中除梔子外的其余藥材，按供試品溶液配制方法制成不含梔子的陰性對(duì)照溶液。

2.1.5 運(yùn)行緩沖液 精密稱取硼砂3.81 g，SDS 5.76 g，置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。量取上述貯備液50 mL，加乙腈15 mL于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，調(diào)節(jié)pH=10，用0.45 ?m微孔濾膜過濾，作為運(yùn)行緩沖液。

2.2 電泳條件

采用未涂層彈性融硅石英毛細(xì)管柱（52 cm×50 ?m ID，有效長度42 cm），運(yùn)行緩沖液50 mmol/L硼砂溶液+100 mmol/L SDS+15%乙腈（pH=10），分離電壓為25 kV，壓力進(jìn)樣為0.5 psi×10 s，檢測波長為238 nm，溫度為25 ℃。毛細(xì)管柱在使用前用1 mol/L氫氧化鈉溶液沖洗20 min，水、運(yùn)行緩沖液各沖洗10 min。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，按“2.2”項(xiàng)下電泳條件，分別進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖1，其他成分對(duì)梔子苷的峰無干擾，表明本方法專屬性良好。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 精密量取一定量的梔子苷對(duì)照品貯備液和內(nèi)標(biāo)貯備液，加50%乙腈溶液稀釋成梔子苷濃度分別為15.02、20.03、40.06、60.08、80.12、160.24、320.48 ?g/mL，內(nèi)標(biāo)濃度為30 ?g/mL的溶液，分別進(jìn)樣，以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.006 34C+0.019 33（r=0.999 5），表明梔子苷在15.02～320.48 ?g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 由3名分析人員按“2.1.3”項(xiàng)下方法配制供試品溶液3份，進(jìn)樣分析，結(jié)果對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD=2.01%，表明中間精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密量取鼻淵舒口服液樣品0.5、1.0、1.5 mL各3份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法配制得50%、100%、150%濃度的供試品溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD分別為0.57%、0.75%、1.77%，表明重復(fù)性較好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批號(hào)鼻淵舒口服液，按“2.1.3“項(xiàng)下方法配制供試品溶液共1份。分別于放置0、2、4、6、8、24 h時(shí)進(jìn)樣分析，對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD=3.85%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取同一批號(hào)鼻淵舒口服液1 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法配制低、中、高濃度供試品溶液，共9份，分為3組。精密吸取上述各組溶液5.0 mL于10 mL容量瓶中，3組分別精密加入“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.5、1、1.5 mL，并加入“2.1.1”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)貯備液2 mL，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，用0.45 ?m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，進(jìn)樣分析。結(jié)果平均回收率為97.50%，RSD=4.43%，見表1。

2.4 樣品含量測定

取3批不同批號(hào)的鼻淵舒口服液，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液與對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下電泳條件分別進(jìn)樣分析，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算梔子苷的含量，并與藥典法HPLC測定結(jié)果比較。結(jié)果較為滿意，且3個(gè)批號(hào)供試品均滿足藥典中梔子苷含量>2.0 mg/mL的要求。

3 討論

將梔子苷對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)238 nm處有較好的吸收且不受溶劑的干擾，基線平滑，故選擇238 nm作為檢測波長。

梔子苷易溶于水，而內(nèi)標(biāo)對(duì)乙酰氨基酚難溶于水，本試驗(yàn)考察了50%甲醇和50%乙腈作為樣品溶劑的分離效果，結(jié)果50%乙腈作為溶劑時(shí)溶劑干擾小，并具有較好的峰形與分離度。

本試驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法定量來克服毛細(xì)管電泳重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)。間硝基苯甲酸、3，5-二硝基苯甲酸、對(duì)乙酰氨基酚、布洛芬、尼莫地平、甲氧芐啶等物質(zhì)在238 nm有較好吸收，因此作為內(nèi)標(biāo)候選物進(jìn)行考察。間硝基苯甲酸、3，5-二硝基苯甲酸、布洛芬、尼莫地平不出峰或遷移時(shí)間較長，甲氧芐啶被溶劑峰干擾。綜合出峰時(shí)間及分離度，選擇對(duì)乙酰氨基酚為內(nèi)標(biāo)。endprint

本試驗(yàn)的電泳條件優(yōu)化了運(yùn)行緩沖液的種類、電解質(zhì)濃度、乙腈的添加量、SDS濃度和分離電壓。梔子苷在不加SDS的緩沖溶液中易受到溶劑峰干擾，因此采用MEKC，加入SDS以更好地分離待測物質(zhì)。緩沖溶液考察了磷酸鹽-甲醇、硼砂-甲醇、硼砂-乙腈等緩沖體系，發(fā)現(xiàn)在磷酸鹽-甲醇緩沖體系中梔子苷不出峰，在硼砂-甲醇體系中梔子苷峰形有明顯的前沿，而在硼砂-乙腈體系中梔子苷峰形較好，因此選擇硼砂-SDS-乙腈體系作為電泳緩沖液。當(dāng)SDS濃度及乙腈加入量一定時(shí)，考察不同濃度硼砂（40、45、50、55、60 mmol/L）對(duì)分離的影響，硼砂的濃度較低時(shí)梔子苷與溶劑有干擾，硼砂濃度過高時(shí)出峰時(shí)間較晚，綜合考察選擇使用50 mmol/L的硼砂，并調(diào)節(jié)緩沖液pH=10時(shí)分離效果最好。當(dāng)硼砂濃度及SDS濃度一定時(shí)，考察乙腈的加入量（5%、10%、15%、20%、25%）對(duì)分離的影響，綜合考慮遷移時(shí)間與分離度，選擇乙腈的加入量為15%。當(dāng)硼砂濃度及乙腈的加入量一定時(shí)，考察SDS的濃度（80、90、100、110、120 mmol/L）對(duì)分離的影響，SDS濃度較低時(shí)梔子苷與內(nèi)標(biāo)與樣品中其余未知成分有干擾，濃度過高時(shí)出峰時(shí)間較晚，易出現(xiàn)氣泡導(dǎo)致斷流現(xiàn)象，因此選擇使用100 mmol/L SDS。分離電壓升高，遷移速率變大，遷移時(shí)間變短，但部分峰重疊，且易產(chǎn)生放電現(xiàn)象；電壓過低，則出峰時(shí)間較晚。在緩沖體系為50 mmol/L硼砂溶液+100 mmol/L SDS+15%乙腈時(shí)，綜合基線平滑度、柱效、分離度、遷移時(shí)間、不對(duì)稱因子等因素選擇25 kV為分離電壓。

本試驗(yàn)建立了以對(duì)乙酰氨基酚為內(nèi)標(biāo)，以50 mmol/L硼砂溶液+100 mmol/L SDS+15%乙腈為運(yùn)行緩沖液的MEKC測定中藥制劑中梔子苷含量的方法。與文獻(xiàn)[14]測定梔子苷的MEKC相比，本試驗(yàn)避免采用價(jià)格相對(duì)昂貴的磺丁基-β-環(huán)糊精作為添加劑，更加經(jīng)濟(jì)方便。本方法與HPLC相比有機(jī)溶劑消耗少，與毛細(xì)管電泳法相比更加經(jīng)濟(jì)環(huán)保，同時(shí)簡單準(zhǔn)確，可作為鼻淵舒口服液的一種新型質(zhì)量控制技術(shù)。

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（收稿日期：2017-03-30）

（修回日期：2017-06-20；編輯：陳靜）endprint