王 暢，張蕊多，王仁廣，郭 靜，賈艾玲*

榛苓顆粒質(zhì)量標準研究

王 暢1,2，張蕊多1，王仁廣1，郭 靜1,2，賈艾玲1,2*

目的為榛苓顆粒建立質(zhì)量標準。方法薄層色譜法對榛苓顆粒中的大黃、人參、陳皮、穿山甲四味藥材進行定性分析；高效液相色譜法測定大黃中大黃素和大黃酚的含量。填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液(85∶15)；檢測波長254 nm。理論塔板數(shù)按大黃素峰計算應(yīng)高于3 000。流速：1 mL/min。結(jié)果大黃、人參、陳皮、穿山甲四味藥的薄層色譜圖斑點清楚可見，有很好的分離效果。當(dāng)大黃素濃度在0.321 6～25.728 μg/mL范圍內(nèi)，大黃酚濃度在0.303 2～24.256 0 μg/mL范圍內(nèi)時，線性關(guān)系良好。精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性試驗的RSD<3%。大黃素的加樣回收率為101.17%，RSD值為1.39%；大黃酚的加樣回收率為101.39%,RSD值為1.30%。加樣回收率良好。結(jié)論此方法簡單可行，重現(xiàn)性好，針對性強，可以很好地控制榛苓顆粒的質(zhì)量。

榛苓顆粒；質(zhì)量標準；高效液相色譜法；薄層色譜法；大黃素

0 引言

榛苓顆粒由長春國家生物產(chǎn)業(yè)基地醫(yī)藥中試平臺生產(chǎn)研究，經(jīng)榛花、土茯苓、益母草、丹參、大黃、陳皮、蟬蛻、血竭粉、人參、穿山甲粉、枸杞子11味中藥提取純化而得，具有活血化瘀、通絡(luò)止渴的功效，對糖尿病腎病有很好的治療作用。該制劑為我校南征教授用于治療糖尿病腎病的方劑，其劑型穩(wěn)定、療效可靠，在臨床上卓有成效?，F(xiàn)代藥理研究證明，該制劑中君藥榛花的水提液可以提高肝糖原含量，降低血糖，具有保護肝臟的功能。大黃的首要有效成分為蒽醌類化合物[1-4],臨床上用于治療慢性腎功能衰竭等病癥。人參的主要化學(xué)成分為人參皂苷及多糖，具有止渴生津、調(diào)和營衛(wèi)、補脾益肺、通絡(luò)活血等作用[5-7]。為了更好地控制榛苓顆粒的成品質(zhì)量，筆者用薄層色譜法對組方中的大黃、人參、陳皮、穿山甲四味藥材進行定性分析，用高效液相色譜法對大黃中大黃素、大黃酚進行含量測定，為進一步開發(fā)新藥奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-10AT型島津高效液相色譜儀(日本島津公司)、DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒實驗儀器總廠)、TP-150超聲波清洗機(天鵬電子新技術(shù)有限公司)、BP211D電子分析天平(德國Sartorius公司)、EL-204電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2 試藥 榛苓顆粒(長春國家生物產(chǎn)業(yè)基地醫(yī)藥中試平臺提供，每袋含5 g，批號：20160701、20160702、20160703、20160715、20160716、20160717、20160801、20160802、20160803、20160804)，大黃素(批號:110756-200110，質(zhì)量分數(shù)≥98%)、大黃酚(批號：110796-201118，質(zhì)量分數(shù)≥98%)、丹參酮ⅡA(批號：110766-200518，質(zhì)量分數(shù)≥98%)、人參皂苷Rg1(批號：110703-201027，質(zhì)量分數(shù)≥98%)、橙皮苷(批號：110721-201316，質(zhì)量分數(shù)≥98%)，以上對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供。環(huán)己烷、冰醋酸、三氯甲烷、石油醚(30～60 ℃)(北京化工廠)，乙醇、丙酮、甲醇(北京北化精細化學(xué)品有限公司)、色譜甲醇(美國Fisher公司)、薄層層析硅膠(青島海洋化工有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 大黃薄層鑒別[8]榛苓顆粒(批號：20160701)研成細粉(過六號篩)，取1.0 g粉末置錐形瓶中，加20 mL甲醇后靜置1 h，過濾，精密吸取5 mL續(xù)濾液置蒸發(fā)皿中，揮干溶劑后加入10 mL水溶解剩余殘渣，水液置于錐形瓶中，加入1 mL鹽酸加熱回流30 min，待冷卻后用40 mL乙醚液平均分2次萃取，合并乙醚層溶液后水浴揮干溶劑，加入1 mL甲醇溶解剩余殘渣作為供試品溶液[9]。取除去大黃的其他10種藥材制備的陰性對照品粉末(過六號篩)0.5 g，同樣方法制備陰性對照品溶液。取0.1 g大黃藥材制備大黃對照藥材溶液。取大黃素及大黃酚對照品適量，加甲醇溶解制成1 mg/mL的混合標準品溶液。參照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取2 μL標準品溶液、5 μL大黃對照藥材溶液、10 μL供試品溶液、10 μL陰性對照品溶液，分別點于同一硅膠H薄層板上(羧甲基纖維素鈉為黏合劑)，展開劑為石油醚(30～60 ℃)∶甲酸∶甲酸乙酯(15∶1∶5)的上層溶液，置于展開缸內(nèi)展開，取出晾干后置紫外燈(365 nm)下檢視。從薄層色譜圖可以看出，供試品與對照藥材及標準品色譜圖相對應(yīng)位置，顯相同顏色熒光斑點，且無陰性干擾。見圖1。

2.1.2 人參薄層鑒別 榛苓顆粒(批號：20160701)研成細粉(過六號篩)，取1.0 g粉末置于錐形瓶中，加入40 mL三氯甲烷，加熱回流1 h，過濾棄去濾液，藥渣揮干溶劑后加0.5 mL水?dāng)嚢?，再加?0 mL水飽和正丁醇溶液超聲提取30 min，精密吸取上層液體置于分液漏斗中，加入氨試液(3倍量)進行萃取，振搖均勻后放置，待分層后取上層溶液水浴揮干，加入1 mL甲醇溶解剩余殘渣作為供試品溶液[9]。取除去人參的其他10種藥材制備的陰性對照品粉末1 g，同樣方法制備陰性對照品溶液。取1 g人參藥材制備人參對照藥材溶液。取人參皂苷Rg1標準品適量，加甲醇溶解制成2 mg/mL的標準品溶液。參照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取2 μL標準品溶液、5 μL對照藥材溶液、5 μL供試品溶液、5 μL陰性對照品溶液，分別點于同一硅膠G薄層板(羧甲基纖維素鈉為黏合劑)，取放置于10 ℃以下的三氯甲烷∶甲醇∶水∶乙酸乙酯(15∶22∶10∶40)混合液的下層溶液作為展開劑，放入展開缸內(nèi)展開，取出薄層板晾干，10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，加熱板(105 ℃)加熱至斑點顯色清晰，置紫外燈(365 nm)下檢視。從薄層色譜圖可以看出，供試品與對照藥材及標準品色譜圖所對應(yīng)位置，都出現(xiàn)相同顏色熒光斑點，且無陰性干擾。見圖2。

圖1 大黃的TLC鑒別圖譜注:1.大黃素、大黃酚對照品，2.大黃對照藥材，3～5.供試 品，6.大黃陰性對照

圖2 人參的TLC鑒別圖譜注:1.人參Rg1對照品，2.人參對照藥材，3～5.供試品， 6.人參陰性對照

2.1.3 穿山甲薄層鑒別 榛苓顆粒(批號：20160701)研成細粉(過六號篩)，取1.0 g粉末置于錐形瓶中，加60 mL三氯甲烷液加熱回流4 h，過濾揮散濾液，加1 mL三氯甲烷溶解剩余殘渣作為供試品溶液。取除去穿山甲的其他10種藥材制成的陰性對照品粉末1 g，同樣方法制成陰性對照品溶液[9]。取1 g穿山甲藥材制備穿山甲對照藥材溶液。參照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取2 μL穿山甲對照藥材溶液、2 μL陰性對照品溶液、2 μL供試品溶液，分別點于同一硅膠G薄層板(羧甲基纖維素鈉為黏合劑)，展開劑為丙酮∶甲苯(1∶20)，置于展開缸內(nèi)展開，取出薄層板晾干，噴以醋酐-硫酸(9∶1)的混合溶液，在80 ℃加熱數(shù)分鐘，置紫外燈(365 nm)下檢視。從薄層色譜圖可以看出供試品與對照藥材相對應(yīng)位置，顯相同顏色熒光斑點，且無陰性干擾。見圖3。

圖3 穿山甲的TLC鑒別圖譜注:1.穿山甲對照藥材，2～4.供試品，5穿山甲陰性對照

2.1.4 陳皮薄層鑒別 榛苓顆粒(批號：20160701)研成細粉(過六號篩)，取1.0 g粉末置于錐形瓶中，加入50 mL甲醇加熱回流20 min，濾過，取濾液5 mL，濃縮至1 mL，作為供試品溶液。取除去陳皮的其他10種藥材制備的陰性對照品粉末1 g，同樣方法制備陰性對照品溶液[9]。取1 g陳皮藥材制備陳皮對照藥材溶液。另取橙皮苷標準品適量，加甲醇溶解制成標準品溶液。參照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取2 μL橙皮苷標準品溶液、2 μL對照藥材溶液、2 μL供試品溶液、2 μL陰性對照品溶液，分別點于同一硅膠G薄層板(5%氫氧化鈉溶液制備)，乙酸乙酯∶甲醇∶水(100∶l7∶13)為展開劑，展至約3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶1)的上層溶液為展開劑，展至約8 cm，取出，晾干，三氯化鋁試液為顯色劑,置365 nm紫外燈下檢視。從薄層色譜圖可以看出，供試品與對照藥材及標準品色譜圖相對應(yīng)位置，顯相同顏色熒光斑點，且無陰性干擾。見圖4。

2.2 大黃素、大黃酚含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液(85∶15)；檢測波長為254 nm。理論塔板數(shù)按大黃素峰計算應(yīng)高于3 000。流速：1 mL/min，溫度為30 ℃。

圖4 陳皮的TLC鑒別圖譜注:1.橙皮苷對照品，2.陳皮對照藥材，3～5.供試品， 6.陳皮陰性對照

2.2.2 標準品溶液的制備 精密稱取大黃素、大黃酚標準品適量，加甲醇溶解制成每毫升含大黃素16.08 μg、大黃酚15.16 μg的混合標準品溶液。

2.2.3 溶液的制備 供試品溶液的制備：榛苓顆粒(批號：20160701)研成細粉(過六號篩)，精密稱定0.6 g粉末置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇后稱定錐形瓶重量，加熱回流1 h，待溶劑冷卻后，再次稱定錐形瓶重量，用甲醇補足損失的重量，振搖均勻后過濾，精密吸取5 mL續(xù)濾液置錐形瓶中。揮散溶劑后加入10 mL鹽酸(8%)溶液，進行2 min超聲提取，再加入10 mL三氯甲烷加熱回流1 h，待溶液冷卻后置于分液漏斗中。用少量三氯甲烷液沖洗容器，倒入分液漏斗，振搖均勻后靜置分層。取三氯甲烷層溶液另器保存，剩余酸液用30 mL三氯甲烷平均分3次萃取，合并萃取液并減壓回收三氯甲烷，加少量甲醇溶解剩余殘渣轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，加適量甲醇定容，振搖均勻后過濾，其續(xù)濾液用0.22 μm微孔濾膜濾過后得供試品溶液。陰性對照品溶液的制備：取除大黃以外的其他10種藥材，按照處方比例及相應(yīng)的制法制備陰性樣品。與制備供試品溶液相同的方法制備陰性對照品溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗 取大黃的標準品溶液、供試品溶液、溶劑及陰性對照品溶液各10 μL，按照“2.2.1”項下的色譜條件進行含量測定，結(jié)果如圖5所示。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取大黃素、大黃酚標準品，加甲醇溶解制成每毫升含大黃素16.08 μg、大黃酚15.16 μg的混合標準品溶液，精密吸取0.1、0.5、1、2、5、8 mL的標準品溶液到5 mL容量瓶中，配制成不同濃度的標準品溶液，分別注入高效液相色譜儀測定，以濃度(μg/mL)為橫坐標、峰面積為縱坐標得到大黃素標準曲線Y=30 690 X-1 281.9，r2=0.999 9，大黃酚標準曲線Y=41 247 X-923.82，r2=0.999 9。結(jié)果表明，大黃素濃度在0.321 6～25.728 μg/mL范圍內(nèi)，大黃酚濃度在0.303 2～24.256 0 μg/mL范圍內(nèi)時，具有良好的線性關(guān)系。

圖5 大黃的薄層色譜圖注：A.對照品溶液，B.供試品溶液，C.甲醇溶液，D.陰性對照 溶液；1.大黃素對照品，2.大黃酚對照品

2.2.6 精密度試驗 取與上述濃度相同的大黃素(16.08 μg/mL)、大黃酚(15.16 μg/mL)混合標準品溶液，反復(fù)進樣6次，測定大黃素和大黃酚的峰面積，結(jié)果RSD值為1.14%，符合要求，表明精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取榛苓顆粒供試品溶液和大黃素、大黃酚混合標準品溶液各10 μL，在制備后0、2、4、8、12、24 h進樣，測定大黃素、大黃酚的峰面積值。標準品溶液在24 h內(nèi)峰面積的RSD值為1.26%，供試品溶液在24 h內(nèi)峰面積的RSD值為1.49%，表明穩(wěn)定性很好。

2.2.8 重現(xiàn)性試驗 精密稱定同一批次(20160701)的6份樣品，按“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液，每份供試品精密吸取10 μL注入液相色譜儀中，測定樣品中大黃素、大黃酚的峰面積并計算相應(yīng)含量，結(jié)果大黃素的平均含量為0.470 5 mg/g，大黃酚的平均含量為0.457 6 mg/g，重現(xiàn)性試驗結(jié)果表明，大黃素的RSD值為0.97%，大黃酚符合要求方法RSD值為1.37%，表明重現(xiàn)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取與重現(xiàn)性試驗同批次的榛苓顆粒9份，每份約0.3 g，精密稱定，分別精密加入樣品中大黃素、大黃酚含量80%、100%、120%的標準品，按照“2.2.3”項下供試品溶液的制備方法進行操作，9份供試品注入液相色譜儀中測定峰面積，分別計算大黃素和大黃酚的加樣回收率。結(jié)果大黃素的加樣回收率為101.17%，RSD值為1.39%。大黃酚的加樣回收率為101.39%,RSD值為1.30%。均符合藥典要求，加樣回收率良好。見表1、表2。

10批樣品的含量測定：分別取10批次榛苓顆粒，按照上述方法制備供試品溶液。測定10批榛苓顆粒中大黃素和大黃酚的總含量，結(jié)果見表3。

結(jié)果表明，10批樣品中大黃素和大黃酚總含量的平均含量為0.934 8 mg/g，在平均含量的基礎(chǔ)上，總含量下浮20%制定本制劑含量限度，故制劑的含量限度規(guī)定為本品每克以大黃中大黃素、大黃酚總和計不得少于0.75 mg。

3 討論

3.1 定性鑒別的確定 采用薄層色譜法對處方中的11味藥進行定性分析，最終確定大黃、人參、陳皮、穿山甲4味藥作為定性鑒別標準。本處方中的另外幾味藥，其中榛花為方中的君藥，但藥典中沒有此藥的相關(guān)記載，文獻中對此藥的報道也相對較少，總黃酮為其主要成分，所以用鑒別總黃酮的方法對其進行鑒別，在薄層色譜中，陰性與供試品、對照藥材相應(yīng)位置顯相同顏色斑點，存在陰性干擾，故不列入質(zhì)量標準。土茯苓為方中用量最多的藥，也是臣藥，但是在薄層色譜鑒別中，陰性與供試品、對照藥材和落新婦苷相對應(yīng)位置上，顯相同顏色斑點，存在陰性干擾，故不列入質(zhì)量標準。

表1 大黃素加樣回收率試驗結(jié)果

表2 大黃酚加樣回收率試驗結(jié)果

表3 榛苓顆粒中大黃素、大黃酚的含量測定結(jié)果

3.2 質(zhì)量控制指標成分的確定 本制劑處方中榛花為君藥，榛花的主要成分為總黃酮[10]，與方中其他藥有陰性干擾，所以不能作為含量測定的跟蹤指標。土茯苓在方中占比例最大，為方中臣藥，但其主要成分落新婦苷也與方中其他藥有陰性干擾，也不可作為含量測定的跟蹤指標。大黃為臣藥，實驗結(jié)果顯示，其主要成分中的蘆薈大黃素、大黃酸在樣品中與其他成分分離效果不好，大黃素甲醚的含量太少，其中大黃素、大黃酚的含量較高且分離度較好，不存在陰性干擾，保留時間合理。所以選擇大黃素、大黃酚作為本制劑的質(zhì)量控制成分。結(jié)果表明，選擇大黃素及大黃酚為指標成分，可以很好地控制榛苓顆粒的質(zhì)量，且結(jié)果穩(wěn)定準確，重復(fù)性好。

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ResearchinthequalitystandardofZhenlinggranule

WANG Chang1,2,ZHANG Rui-duo1,WANG Ren-guang1,GUO Jing1,2,JIA Ai-ling1,2*

(1.Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Changchun 130117,China;2.Changchun National Biological Industry Base Pharmaceutical Preparation Platform,Changchun 130117,China)

ObjectiveTo establish the quality standard of Zhenling granule.MethodsTLC was used for the qualitative identification of rheum rhubarb,ginseng,dried tangerine peel and pangolin.HPLC was used to determine the content of emodin and chrysophanol.The contents were measured in Phe-nomenex Luna C18column with methano-2% water-phosphoric acid(85∶15)as the mobile phase,and 254 nm detection wavelength and area-external standard method was used.According to Huang Sufeng calculation the number of theoretical plates should not be less than 3 000.Flow rate:1 mL/min.ResultsThe thin-layer chromatographic spots of rheum rhubarb,ginseng,dried tangerine peel,and pangolin were clear and well separated.Emodin showed good linearity in the range of 0.321 6～25.728 μg/mL.Chrysophanol showed good linearity in the range of 0.303 2～24.256 0 μg/mL.TheRSDvalues of precision,repeatability and stability tests were less than 3%.The average recovery of emodin and chrysophanol was 101.17% and 101.39%,and theRSDwas 1.39% and 1.30%,respectively.ConclusionThe method is simple with good reproducibility and strong specificity.The quality of Zhenling granules can be well controlled.

Zhenling granule;Quality standard;HPLC;TLC;Emodin

2017-03-26

1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117；2.長春國家生物產(chǎn)業(yè)基地醫(yī)藥中試平臺，長春 130117

吉林省中醫(yī)藥科技項目(2016164)

*

10.14053/j.cnki.ppcr.201711023