黃 明，胡熙耀，彭 敏，朱克剛

青藤堿對家兔骨質(zhì)疏松壓縮性骨折模型骨生長分化因子2和血清白介素-1β及白介素-17的影響

黃 明1，胡熙耀2，彭 敏2，朱克剛3*

目的研究青藤堿對骨質(zhì)疏松壓縮性骨折模型家兔骨生長分化因子2(GDF2)和血清白介素-1β(IL-1β)及IL-17的影響，并探討其作用機(jī)制。方法先將36只雌性家兔去卵巢建立骨質(zhì)疏松模型，4周后再采用剪斷L1-L5節(jié)段椎體前緣的方法建立骨質(zhì)疏松壓縮性骨折模型，成模后分為模型組，青藤堿A組、B組。青藤堿A組、B組用10%青藤堿分別按2、4 mL/(kg·d)劑量灌胃，模型組灌胃等體積生理鹽水，三組均治療1個月。采用雙抗體夾心法檢測耳緣靜脈炎性因子IL-1β/IL-17的含量；采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測椎間盤組織GDF2表達(dá)水平；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測椎間盤組織GDF2 mRNA表達(dá)。結(jié)果青藤堿可提高青藤堿A組、B組家兔GDF2、GDF2 mRNA表達(dá)水平，降低血清IL-1β/IL-17含量，與模型組和同組治療前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但青藤堿A組、B組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論青藤堿可改善低IL-1β/IL-17介導(dǎo)的炎性反應(yīng)及骨退行性變，提高GDF2誘導(dǎo)成骨分化和骨形成能力，加速骨折愈合。

青藤堿；骨質(zhì)疏松壓縮性骨折；骨生長分化因子2；IL-1β/IL-17；家兔

0 引言

骨質(zhì)疏松屬體內(nèi)鈣調(diào)節(jié)激素分泌失調(diào)的全身代謝性疾病，尤以50歲以上的絕經(jīng)婦女最為嚴(yán)重，患者因鈣、磷、維生素及蛋白質(zhì)等攝入不足，成骨和破骨代謝失衡，骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)改變、骨強(qiáng)度下降且脆性增加，在外力的作用下較易發(fā)生壓縮性骨折，嚴(yán)重影響患者的生活及生存質(zhì)量[1-2]。在骨折愈合病理過程中，炎性因子IL-1β、IL-17等常影響骨折局部微環(huán)境。IL-1β在誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的同時，還會誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-17，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，降解軟骨細(xì)胞基質(zhì)，降低成骨細(xì)胞活性，減緩骨痂形成[3]。而因子IL-17由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，可增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性并最終導(dǎo)致骨侵蝕[4]。骨生長分化因子2(Growth differentiation factor 2，GDF2)具有誘導(dǎo)成骨分化和骨形成能力，在骨折愈合過程中起重要作用，GDF2對促進(jìn)骨痂形成具有重要意義[5]。本文旨在研究青藤堿(Sinomenine，SIN)對骨質(zhì)疏松壓縮性骨折模型家兔骨折GDF2和血清IL-1β/IL-17的影響，探討青藤堿的作用機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 SPF級雌性家兔36只，7月齡左右，體重(3.0±0.1)kg，隨機(jī)分為3組(模型組,青藤堿A組、B組)，每組12只。實驗動物由十堰市太和醫(yī)院實驗動物中心提供(合格號：4200593344)。

1.2 試劑及藥品 水合氯醛(揚州市奧鑫助劑廠，批號：015102913)，鹽酸青藤堿腸溶片(煙臺魯銀藥業(yè)有限公司，批號：2016122603)；IL-1β、IL-17、OPG和GDF2檢測ELISA試劑盒均由上海信則生物科技有限公司提供。

1.3 骨質(zhì)疏松動物模型及骨質(zhì)疏松壓縮性骨折模型建立 家兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用10%水合氯醛(0.2 mL/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉后俯臥位固定，8%硫化退毛，于家兔髂嵴頂部上方和腰椎骶棘肌兩側(cè)采用雙切口方法切開家兔背肌，分離出腹腔脂肪團(tuán)中包埋的卵巢和子宮角。先結(jié)扎子宮角上部，然后摘除卵巢，摘除干凈后納入脂肪團(tuán)，分層縫合背肌和皮膚，用雙氧水消毒。術(shù)后肌肉注射地塞米松(1 mg/kg)，2次/周，共4周[6]。術(shù)后自由攝食、飲水，恒溫20～22 ℃，相對濕度40%～70%。4周后參照文獻(xiàn)[7]方法建立骨質(zhì)疏松壓縮性骨折模型。建模時用10%水合氯醛(0.2 mL/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉，雙氧水消毒，切開兔L1-L5皮膚，分離家兔背闊肌、棘間肌及韌帶，從椎體側(cè)前方剪斷L1-L5節(jié)段椎體前緣，術(shù)后椎體不用做內(nèi)固定，2周后動物可成模。成模依據(jù)[8]：2周內(nèi)強(qiáng)迫活動(每天6 h)，因家兔的前肢不發(fā)達(dá)，后肢及脊柱背側(cè)肌群、腹側(cè)肌群比較發(fā)達(dá)，且生活體位多以半直立屈曲位為主，負(fù)重集中在后肢，動物清醒后，其覓食活動、強(qiáng)迫運動均會使椎體受壓，脊柱在此負(fù)重狀態(tài)下最終會出現(xiàn)壓縮狀態(tài)而形成骨質(zhì)疏松壓縮性骨折。本實驗在術(shù)后2周時拍攝CR，發(fā)現(xiàn)椎體均有明顯壓縮變短等病理改變，證實建模成功，符合骨質(zhì)疏松壓縮性骨折模型病理特征。

1.4 治療方法 骨質(zhì)疏松壓縮性骨折模型成功后，青藤堿A組、B組用事先配制好的10%鹽酸青藤堿腸溶片混懸液，每只家兔按2、4 mL/(kg·d)的劑量灌胃，模型組按2 mL/(kg·d)灌生理鹽水，三組均治療1個月。

1.5 觀察指標(biāo) 治療前和治療后，取耳緣靜脈血0.1 mL，采用雙抗體夾心法檢測炎性因子IL-1β/IL-17的含量；取血后各組處死7只，取椎間盤組織制成勻漿液，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測椎間盤組織GDF2表達(dá)水平；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測椎間盤組織GDF2 mRNA表達(dá)。以上操作嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 青藤堿對家兔GDF2和GDF2 mRNA的影響 模型組家兔治療前后GDF2和GDF2 mRNA無明顯變化(P>0.05)。治療前，青藤堿A組、B組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，治療后，兩組GDF2和GDF2 mRNA均高表達(dá)(P<0.05)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 青藤堿對家兔IL-1β和IL-17的影響 模型組家兔治療前后IL-1β和IL-17無明顯變化(P>0.05)。治療前，青藤堿A組、B組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后，兩組IL-1β和IL-17均降低(P<0.05)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

3 討論

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)有15個成員，其中BMP9又稱GDF2，具有誘導(dǎo)成骨分化和骨形成的能力，屬于轉(zhuǎn)化生長因子，因其可誘導(dǎo)骨形成而得名[9]。Kimelman-Bleich等[10]在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，GDF2具有誘導(dǎo)成骨活性的作用，具有明顯的促成骨作用。IL-1β和IL-17作為炎癥因子，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)。從理論上講，抑制IL-1β和IL-17的合成，增強(qiáng)GDF2均有利于骨折愈合。青藤堿是從中醫(yī)青風(fēng)藤的干燥根莖中提取的裝模單體生物堿，因其具有抗腫瘤、免疫抑制、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風(fēng)濕等作用，臨床常用于類風(fēng)濕、風(fēng)濕及骨性關(guān)節(jié)炎等的治療[11-12]。在本實驗中，我們首先用雌性家兔去卵巢建立家兔骨質(zhì)疏松模型，再在此基礎(chǔ)上建立椎體壓縮性骨折模型，目的是真實模擬老年女性骨質(zhì)疏松椎體壓縮性骨折，研究青藤堿在骨折愈合過程中是否可以通過影響GDF2和GDF2 mRNA表達(dá)及炎癥因子IL-1β和IL-17合成而加速愈合。

表1 各組治療前后GDF2和GDF2 mRNA比較(n=8)

注：與治療前比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表2 各組治療前后IL-1β和IL-17比較(pg/mL，n=8)

注：與治療前比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

本研究表明，青藤堿可提高A組、B組GDF2、GDF2 mRNA表達(dá)水平，降低血清IL-1β/IL-17含量。研究表明，IL-1β是一種較強(qiáng)的刺激骨吸收的因子，隨著絕經(jīng)后婦女雌激素分泌量降低，機(jī)體對于IL-1β啟動因子的拮抗作用降低，故IL-1β促使骨吸收，加速骨質(zhì)疏松的形成[13]。另外，在骨質(zhì)疏松形成的過程中，炎癥因子IL-17也可以調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收，影響破骨細(xì)胞活性，破骨細(xì)胞分泌大量水解酶溶解骨質(zhì)，使骨小梁變薄、斷裂，最終形成骨質(zhì)疏松[14-15]。IL-1β與IL-17在炎癥反應(yīng)中有聯(lián)動關(guān)系，IL-1β首先激活一氧化氮合酶而產(chǎn)生一氧化氮，一氧化氮誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，并能抑制軟骨細(xì)胞增殖和合成蛋白多糖[16]。同時，IL-1β還會使T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-17而降解軟骨細(xì)胞基質(zhì)，降低成骨細(xì)胞活性而破壞骨微結(jié)構(gòu)[17]。T細(xì)胞活化后產(chǎn)生的因子IL-17還可增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，并最終導(dǎo)致骨侵蝕而加重骨質(zhì)疏松病理進(jìn)程[18]。因此，抑制IL-1β與IL-17所造成炎性反應(yīng)成為防治骨質(zhì)疏松時骨質(zhì)破壞及可能發(fā)生椎體壓縮性骨折的關(guān)鍵。在本實驗中，青藤堿通過抑制IL-1β合成和T細(xì)胞活化，間接抑制IL-17表達(dá)及分泌而產(chǎn)生抗炎作用，降低軟骨細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性而加速骨折愈合[19]。本實驗還觀察到青藤堿可明顯提高GDF2表達(dá)。目前關(guān)于GDF2對骨質(zhì)疏松的研究較少。GDF2能夠誘導(dǎo)鈣鹽結(jié)節(jié)沉積，并可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為骨、軟骨[20-21]。本實驗中，GDF2和GDF2 mRNA高表達(dá)，提示青藤堿可通過誘導(dǎo)骨鈣沉積，提高成骨細(xì)胞活性，并有可能抑制已經(jīng)成熟的破骨細(xì)胞誘導(dǎo)骨吸收，促成新骨及骨痂形成而加速修復(fù)動物骨質(zhì)疏松椎體壓縮性骨折。

綜上所述，青藤堿可以通過影響GDF2和GDF2 mRNA表達(dá)及炎癥因子IL-1β和IL-17合成而加速骨質(zhì)疏松椎體壓縮性骨折愈合，具有肯定的治療作用，其意義在于青藤堿可能成為治療老年女性骨質(zhì)疏松椎體壓縮性骨折的新藥物。

[1] 吳小川.鹿瓜多肽注射液對高齡骨質(zhì)疏松性骨折愈合的影響[J].實用藥物與臨床,2014,17(3):356-358.

[2] 李翔,張樹桐,王翔,等.骨質(zhì)疏松或骨轉(zhuǎn)移瘤致椎體壓縮性骨折患者的 MRI鑒別研究[J].吉林醫(yī)學(xué),2017,38(1):44-45.

[3] 楊惠琴,陳禮榮.青藤堿對膝骨性關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)液及血清白細(xì)胞介素1β含量的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報,2008,6(12):1275-1279.

[4] 姚金丹,韓光紅,胡敏.IL-17對破骨細(xì)胞中MMP-9表達(dá)水平的影響及其意義[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2016,42(3):462-466,后插1.

[5] 羅進(jìn)勇.骨形態(tài)發(fā)生蛋白9促成骨的分子機(jī)制[J].重慶醫(yī)學(xué),2016,45(9):1153-1155,1162.

[6] 盧其騰,農(nóng)小連,吳家昌,等.去勢聯(lián)合地塞米松建立大鼠骨質(zhì)疏松模型的研究[J].中國骨質(zhì)疏松雜志,2015,21(1):34-38.

[7] 張淑嫻,郭新全,邱玉金,等.兔椎體骨折動物模型制備的初步探討[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,34(7):131-134.

[8] 崔健超,江曉兵,楊志東,等.胸腰椎椎體骨折動物模型的研究進(jìn)展[J].中國脊柱脊髓雜志,2015,25(7):666-669.

[9] Luo J,Tang M,Huang J,et al.TGFβ/BMP Type I receptors ALK1 and ALK2 are essential for BMP9-induced osteogenic signaling in mesenchymal stem cells[J].J Biol Chem,2010,285(38):29588-29598.

[10]Kimelman-Bleich N,Pelled G,Zilberman Y,et al.Targeted gene-and-host progenitor cell therapy for nonunion bone fracture repair[J].Mol Ther,2011,19(1):53-59.

[11]陳偉毅,秦春宏,銀曉剛.青藤堿抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].中國藥師,2013,16(12):1902-1904.

[12]張欣悅,高永翔.青藤堿的免疫抑制和抗炎活性研究進(jìn)展[J].湖南中醫(yī)雜志,2016,32(3):193-194,199.

[13]孫曉婷,吳迎爽,朱亦堃,等.吡格列酮對去卵巢大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響[J].中國骨質(zhì)疏松雜志,2015,21(2):152-157.

[14]邵泓達(dá),湯光宇.去勢骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].上海醫(yī)學(xué),2014,37(1):94-96.

[15]Pineda B,Hermenegildo C,Tarín JJ,et al.Effects of administration of hormone therapy or raloxifene on the immune system and on biochemical markers of bone remodeling[J].Menopause,2012,19(3):319-327.

[16]朱書濤,劉洋,張明輝,等.去卵巢大鼠骨組織中腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1β及白細(xì)胞介素6水平與骨質(zhì)疏松的關(guān)系[J].中國組織工程研究,2016,20(15):2206-2211.

[17]羅浩,鄭潔,權(quán)志博,等.關(guān)節(jié)腔注射青藤堿對兔膝骨性關(guān)節(jié)炎血清NO等自由基代謝的影響[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2014,29(2):60-63.

[18]丁從珠,姚瑤,方蕓,等.青藤堿對膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠血清OPG/RANKL、lL-17含量的影響[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2012,28(4):330-333.

[19]陳光星,劉良,趙詩哲,等.青藤堿對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)大鼠滑膜細(xì)胞增殖及凋亡影響的研究[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2005,9(5):284-287.

[20]馬軍,孫崇毅,劉慶鵬,等.BMP9在脊柱融合過程中的作用及其相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2014,42(6):703-706.

[21]宿旭東,鄧鋒,湯寅虹,等.骨形態(tài)發(fā)生蛋白9促進(jìn)小鼠顱骨間充質(zhì)祖細(xì)胞成骨分化的實驗研究[J].軍事醫(yī)學(xué),2016,40(12):984-987,993.

Effectofsinomenineongrowthdifferentiationfactor2ofboneandseruminterleukin-1βand-17inmodelsofosteoporoticvertebralcompressionfracturesinrabbits

HUANG Ming1,HU Xi-yao2,PENG Min2,ZHU Ke-gang3*

(1.Shiyan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shiyan 442002,China;2.Taihe Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China;3.Department of Pharmacology, Basic Medical College of Hubei Medical College,Shiyan 442000,China)

ObjectiveTo study the effects of sinomenine on growth differentiation factor 2 (GDF2) and IL-1β and IL-17 in models of osteoporotic vertebral compression fractures in rabbits,and to explore the mechanism of action.MethodsFirst,36 female rabbits were ovariectomized to establish osteoporosis models,and after 4 weeks,the method of cutting former-edge of L1-L5 segments was used to establish fractures of vertebral compression with osteoporosis.After modeling,they were divided into model group,sinomenine group A and group B.Sinomenine group A and group B

intragastric administration of 10% sinomenine with 2 mL/(kg·d) and 4 mL/(kg·d) as dosages,model group was given normal saline,and the 3 groups were all treated for one month.Double antibody sandwich method was used to test the contents of factor IL-1β/IL-17 of ear vein inflammatory;enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used for the detection of expressions of GDF2 in intervertebral disc tissue;reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the expressions of GDF2 mRNA in intervertebral disc tissue.ResultsSinomenine could improve the expression level of GDF2 and GDF2 mRNA in group A and group B,and decrease the contents of IL-1β/IL-17 in serum (P<0.05),and there was statistically significant difference between sinomenine groups and model group (P<0.05),but there was no significant difference between group A and group B (P>0.05).ConclusionSinomenine can reduce the inflammatory reaction and bone degeneration induced by factor IL-1β/IL-17,increase the ability of GDF2 to induce osteogenic differentiation and bone formation,thus accelerating the healing of bone fractures.

Sinomenine;Osteoporotic compression fracture;Bone growth differentiation factor 2;IL-1β/IL-17;Rabbit

2017-03-23

1.湖北省十堰市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 十堰 442002；2.十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，湖北 十堰 442000

*

10.14053/j.cnki.ppcr.201711006