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(1.華東交通大學(xué)機(jī)電與車輛工程學(xué)院,江西南昌 330013;2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;3.贛州出入境檢驗(yàn)檢疫局,江西贛州 341000)

基于近紅外光譜和LSSVM方法的轉(zhuǎn)基因大米鑒別研究

郝勇1,2,溫欽華1,羅秋紅3,饒敏3,陳斌2

(1.華東交通大學(xué)機(jī)電與車輛工程學(xué)院,江西南昌 330013;2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;3.贛州出入境檢驗(yàn)檢疫局,江西贛州 341000)

采用近紅外漫反射光譜結(jié)合主成分分析(principal component analysis,PCA)和最小二乘支持向量機(jī)(least squares support vector machine,LSSVM)研究轉(zhuǎn)基因大米的鑒別方法。采用PCA方法分析大米樣品光譜空間分布;不同的光譜預(yù)處理方法:5點(diǎn)平滑、多元散射校正(multiplicative scatter correction,MSC)和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(standard normal variate transformation,SNV)結(jié)合LSSVM用于定性判別模型的建立和優(yōu)化;采用格點(diǎn)搜索方法對(duì)LSSVM模型的懲罰因子(c)和徑向基核函數(shù)寬度(g)進(jìn)行優(yōu)化;正確識(shí)別率(correct recognition rate,CRR)用于判別模型的評(píng)價(jià)。結(jié)果表明:MSC結(jié)合LSSVM可用于轉(zhuǎn)基因大米定性判別模型的建立,最優(yōu)模型的CRR為97.50%。該方法有望成為轉(zhuǎn)基因食品快速鑒別的一種輔助方法。

近紅外光譜,轉(zhuǎn)基因大米,主成分分析,最小二乘支持向量機(jī)

近些年,轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到迅猛發(fā)展,大量抗蟲、抗旱及品質(zhì)改良的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物品種問世。中國(guó)已成為世界上種植轉(zhuǎn)基因作物面積最大的國(guó)家之一[1-3],轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人類健康及生態(tài)環(huán)境的潛在影響也日益受到人們的普遍關(guān)注。世界各國(guó)都在加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的管理,我國(guó)政府相關(guān)監(jiān)管部門也在積極努力地修訂和完善轉(zhuǎn)基因食品安全政策,以加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品安全的管理,因此轉(zhuǎn)基因食品的快速檢測(cè)是十分重要的[4-6]。水稻是我國(guó)重要的糧食作物,為全國(guó)約2/3的人口提供食物,因此轉(zhuǎn)基因大米快速檢測(cè)方法的研究迫在眉睫。

目前轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)方法主要包括轉(zhuǎn)基因核酸檢驗(yàn)法-定性聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、適時(shí)PCR、熒光定量PCR、多重PCR、基因芯片、等溫核酸擴(kuò)增及蛋白檢驗(yàn)法等方法(含印跡法、酶聯(lián)免疫吸附、免疫試紙條法)[7-11]。在利用PCR進(jìn)行檢測(cè)時(shí),首先需提取所測(cè)目標(biāo)的高質(zhì)量DNA基因組并準(zhǔn)備合適的引物,再在適宜的反應(yīng)體系中培養(yǎng),最后進(jìn)行凝膠電泳,整個(gè)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)過程繁瑣、費(fèi)時(shí)、檢測(cè)成本高且極易造成交叉污染[12]。上述這些傳統(tǒng)檢測(cè)方法均存在類似耗時(shí)、高成本等不足,因此,急需探索一種準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便且成本低廉的檢測(cè)方法用于轉(zhuǎn)基因食品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

近紅外光譜的波長(zhǎng)范圍為780～2500 nm,主要記錄的是有機(jī)物分子中一些含氫基團(tuán)(C-H、O-H、N-H、S-H等)的倍頻和合頻吸收,容易獲得穩(wěn)定的特征譜圖[13-14]。不同的物質(zhì)在近紅外區(qū)域有特定的、豐富的吸收光譜[15],可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜物質(zhì)的定性鑒別和定量分析,具有測(cè)試方便、速度快、成本低和無(wú)損等優(yōu)點(diǎn)。近紅外光譜技術(shù)已在轉(zhuǎn)基因作物及轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)中得到了應(yīng)用。Aderval[16]等將近紅外光譜技術(shù)與SVM-DA(支持向量機(jī)-判別分析)和PLS-DA(偏最小二乘-判別分析)方法相結(jié)合用于轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆油的快速鑒別,其中SVM方法的轉(zhuǎn)基因樣本識(shí)別率為90%,PLS-DA方法的識(shí)別率為80%;謝麗娟[17]采用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合多種模式識(shí)別方法對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行檢測(cè),轉(zhuǎn)基因樣本的總體識(shí)別率為95.81%;翟亞鋒等[18]應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合仿生模式識(shí)別方法識(shí)別轉(zhuǎn)基因小麥,識(shí)別率達(dá)到了95.6%;張龍[19]使用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合偏最小二乘法識(shí)別轉(zhuǎn)基因大米(外來(lái)基因?yàn)镺sTCTP和Osmi166),識(shí)別率達(dá)到了100%;于燕波[20]利用近紅外光譜結(jié)合DPLS方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因水稻的識(shí)別,其中對(duì)稻種中含中作321和日本晴轉(zhuǎn)基因的樣本的識(shí)別率為100%,對(duì)稻種中含TP309基因樣本的識(shí)別率為93.4%。由以上研究可知,基于近紅外的轉(zhuǎn)基因作物的識(shí)別效果與選用的化學(xué)計(jì)量學(xué)算法及轉(zhuǎn)基因作物所植入的外來(lái)基因的類型有關(guān)。

本文采用近紅外漫反射光譜技術(shù)結(jié)合主成分分析法(principal component analysis,PCA)和最小二乘支持向量機(jī)(least squares support vector machine,LSSVM)進(jìn)行抗蟲轉(zhuǎn)基因大米(含BT基因)判別模型的建立和優(yōu)化,期望為轉(zhuǎn)基因大米的快速鑒別提供一種快速準(zhǔn)確的參考方法。

1 材料與方法

1.1材料及儀器

轉(zhuǎn)基因大米樣本:“Bt汕優(yōu)63”品系大米 該品系是在原有水稻中導(dǎo)入蘇云金芽胞桿菌(BT)基因使其具有抗蟲特性,由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院提供;轉(zhuǎn)基因大米的對(duì)照樣本 未導(dǎo)入抗蟲基因的原始品系“汕優(yōu)63”由市場(chǎng)收集所得;總共收集大米樣本120份,轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大米各60份。

MicroNIR 1700型便攜式微型近紅外光譜儀 美國(guó)JDSU公司生產(chǎn),用于大米漫反射光譜的采集。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 光譜采集 采用石英玻璃管盛放樣品,裝樣高度約為2 cm,玻璃管直徑與光譜儀圓形檢測(cè)窗口相同,檢測(cè)時(shí)直接將樣品放置于采集窗口進(jìn)行光譜采集,波長(zhǎng)范圍為900～1700 nm。每個(gè)樣品采用重復(fù)裝樣的方式采集三條光譜,平均光譜作為最終分析光譜。

1.2.2 樣品轉(zhuǎn)基因成分分析 兩類樣本由贛州出入境檢驗(yàn)檢疫局采用傳統(tǒng)PCR檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證。使用CTAB試劑提取樣本水稻基因組DNA,將含有CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子和Cry1Ac基因的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照,選用對(duì)應(yīng)的引物,然后進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增并將其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)樣本可靠,測(cè)試樣本含BT轉(zhuǎn)基因成分,而原始品系樣本不含抗蟲轉(zhuǎn)基因成分。

1.3樣品集劃分及光譜預(yù)處理

采用Kennard-Stone(KS)方法[21-22]進(jìn)行樣品集的劃分,將轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因樣品的光譜分別按2∶1的比例劃分為校正集和測(cè)試集,因此兩類樣品的校正集光譜分別有40條,測(cè)試集則均各有20條光譜。

在大米樣品光譜的采集過程中,為了消除重復(fù)裝樣引起的漫反射光程不一致導(dǎo)致的光譜漂移和噪聲等因素的影響,需要對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理,從而提高校正模型的預(yù)測(cè)能力。本文采用5點(diǎn)平滑、多元散射校正(multiplicative scatter correction,MSC)[23]和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(standard normal variate transformation,SNV)[24]3種預(yù)處理方法對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理以消除噪聲(隨機(jī)誤差)、固體顆粒大小、表面散射以及光程變化等因素對(duì)近紅外漫反射光譜的影響。

1.4數(shù)據(jù)分析及評(píng)價(jià)指標(biāo)

PCA是一種常用的數(shù)據(jù)降維方法,該方法能夠在最大限度地保留光譜原始數(shù)據(jù)信息的基礎(chǔ)上有效地剔除數(shù)據(jù)中的冗余信息,便于后續(xù)分析。使用PCA對(duì)大米樣品的近紅外光譜進(jìn)行處理,通過光譜主成分的空間分布來(lái)判斷能否區(qū)分轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大米。

LSSVM是基于SVM的一種改進(jìn)算法。它通過構(gòu)造損失函數(shù)將原SVM中算法的二次尋優(yōu)變?yōu)榍蠼饩€性方程,其求解速度較快,在各個(gè)領(lǐng)域中都得到了廣泛的應(yīng)用[25-26]。LSSVM方法共有4種核函數(shù)進(jìn)行選擇(包括線性核、多項(xiàng)式核、徑向基函數(shù)核和高斯核),其中徑向基函數(shù)核(radial basis function,RBF)由于其良好的非線性問題處理能力而被廣泛應(yīng)用,因此本文使用RBF函數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)LSSVM建模。

采用正確識(shí)別率(correct recognition rate,CRR)對(duì)判別模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。正確識(shí)別率可準(zhǔn)確的表征定性判別模型的優(yōu)劣。

CRR計(jì)算公式見式(1):

式(1)

CRR越接近于100%,判別模型的精度越高。

2 結(jié)果與分析

2.1大米樣品的近紅外漫反射光譜

轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大米的原始近紅外漫反射光譜如圖1所示。從漫反射光譜圖中可知轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大米的光譜形狀極其相似,且有部分重疊,肉眼無(wú)法從中分辨出是否為轉(zhuǎn)基因大米。因此需通過光譜預(yù)處理方法結(jié)合定性判別算法對(duì)大米進(jìn)行定性區(qū)分。

圖1 轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大米的原始近紅外漫反射光譜

2.2大米光譜的主成分分析

PCA方法能夠在保留原始光譜數(shù)據(jù)信息的基礎(chǔ)上進(jìn)行冗余信息的剔除。采用PCA方法對(duì)原始大米樣品的近紅外光譜進(jìn)行處理,樣品前3個(gè)主成分空間分布如圖2所示,非轉(zhuǎn)基因大米和轉(zhuǎn)基因大米的PCA分布圖中部分樣品互相重疊交織在一起,無(wú)法完全分離,而且采用該方法無(wú)法準(zhǔn)確的計(jì)算轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大米間的明確界限和CRR值,因此需要進(jìn)一步采用其它有監(jiān)督的模式識(shí)別方法對(duì)樣品進(jìn)行識(shí)別。

圖2 轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大米光譜的主成分分布圖

2.3基于最小二乘支持向量機(jī)(LSSVM)的轉(zhuǎn)基因大米定性模型建立

在利用LSSVM方法建立定性模型時(shí),除了核函數(shù)的選擇外,需要對(duì)算法的懲罰因子(c)和徑向基核函數(shù)的寬度(g)進(jìn)行優(yōu)化以改善模型的識(shí)別效果[27-28]。圖3所示為大米樣品原始光譜采用網(wǎng)格搜索法對(duì)c和g的優(yōu)化示意圖。經(jīng)優(yōu)化后的c和g分別為0.177和0.25。

圖3 LSSVM模型參數(shù)c和g優(yōu)化示意圖

采用校正集樣品進(jìn)行LSSVM模型的建立,測(cè)試集樣品用于模型的驗(yàn)證。在模型構(gòu)建時(shí),非轉(zhuǎn)基因大米光譜的目標(biāo)值定義為1,轉(zhuǎn)基因大米光譜的目標(biāo)值則定義為2。分別采用原始光譜、5點(diǎn)平滑、SNV和MSC預(yù)處理光譜建立轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大米的LSSVM判別模型,并分別對(duì)c和g進(jìn)行優(yōu)化,計(jì)算模型的正確識(shí)別率,結(jié)果如表1所示。

由表1可知,原始光譜模型的總體正確識(shí)別率為95%,其CRR1和CRR2分別為100%和90%。光譜經(jīng)SNV和MSC方法處理后都得到相同的識(shí)別結(jié)果,將光譜模型的總體識(shí)別率改善為97.5%。然而,采用MSC進(jìn)行光譜預(yù)處理時(shí),需要采用校正集樣品的平均光譜作為理想光譜對(duì)未知樣品光譜進(jìn)行擬合,因此,該方法對(duì)未知樣品預(yù)處理時(shí)充分參考了建模樣品集的光譜信息,模型的預(yù)測(cè)可靠性和穩(wěn)定性更好。

表1 最小二乘支持向量機(jī)與三種預(yù)處理方法結(jié)合的識(shí)別效果

注:CRR1為非轉(zhuǎn)基因樣品的識(shí)別率;CRR2為轉(zhuǎn)基因樣品的識(shí)別率;CRR為測(cè)試集樣品的識(shí)別率。

圖4 轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大米樣品LSSVM模型識(shí)別結(jié)果和樣品實(shí)際類別比較圖

圖4為測(cè)試集樣品光譜經(jīng)MSC預(yù)處理后LS-SVM模型的識(shí)別結(jié)果和樣品實(shí)際類別比較圖,其中22號(hào)樣品識(shí)別錯(cuò)誤,將轉(zhuǎn)基因樣品識(shí)別為非轉(zhuǎn)基因樣本,其余測(cè)試樣品均為正確識(shí)別。模型對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大米具有較好的識(shí)別效果。

3 結(jié)論

論文采用便攜式近紅外光譜儀結(jié)合PCA和LS-SVM方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大米的快速測(cè)定可行性進(jìn)行了研究,探討了不同光譜預(yù)處理方法對(duì)模型預(yù)測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果表明,PCA方法無(wú)法很好地區(qū)分轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大米,而LSSVM模型的區(qū)分效果較好;使用MSC進(jìn)行光譜預(yù)處理,均可以優(yōu)化LSSVM模型,預(yù)測(cè)集樣品的總體識(shí)別率達(dá)到97.5%,其中轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因樣品的正確識(shí)別率分別為100%和95%。近紅外光譜結(jié)合LSSVM方法可用于轉(zhuǎn)基因大米的快速檢測(cè),該方法具有快速、無(wú)損、準(zhǔn)確以及儀器便攜化的優(yōu)點(diǎn),有望為轉(zhuǎn)基因食品的現(xiàn)場(chǎng)快速鑒別提供參考。

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Studyonidentificationofgeneticallymodifiedricebyusingnear-infraredspectroscopycombinedwithLSSVM

HAOYong1,2,WENQin-hua1,LUOQiu-hong3,RAOMin3,CHENBin2

(1.School of Mechanotronics & Vehicle Engineering,East China Jiaotong University,Nanchang 330013,China;2.School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;3.Ganzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Ganzhou 341000,China)

Near-infrared diffuse reflectance spectroscopy(NIDRS)combined with principal component analysis(PCA)and least squares support vector machine(LSSVM)were used for the identification of transgenic rice. PCA was used to analyze the spectral spatial distribution of rice. Different spectral preprocessing methods including 5-point smoothing,multivariate scatter correction(MSC)and standard normal variate transformation(SNV)combined with LSSVM were used to build and optimize qualitative models. The grid search algorithm was employed to obtain the optimal solution of the penalty factor(c)and the parameters gamma(g)of RBF kernel. The correct recognition rate(CRR)were used to evaluate models. The results showed that MSC combined with LSSVM could be used to establish the qualitative identification model of transgenic rice. The CRR of the optimal model was 97.50%. The method was expected to be an auxiliary method for rapid detection of genetically modified foods.

near-infrared spectroscopy(NIRS);genetically modified rice;principal component analysis(PCA);least squares support vector machine(LSSVM)

2017-04-28

郝勇(1978-)，男，博士，副教授，主要從事智能光電無(wú)損檢測(cè)方面的研究，E-mail:haonm@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21265006)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)22-0242-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.047