,

(錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001)

響應面法優(yōu)化薏米中β-谷甾醇的提取工藝

張冬陽,郭雪松*

(錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001)

目的:采用超聲波輔助提取薏米中的β-谷甾醇,為其在功能性食品等加工利用方面提供參考。方法:以薏米為原料,磨碎成粉,以乙醇為提取溶劑,以液料比、超聲溫度、超聲時間、乙醇濃度為單因素,以β-谷甾醇提取得率為指標,運用響應面法研究各因素及其交互作用對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響。結果:超聲輔助法提取薏米中的β-谷甾醇最佳提取條件:液料比17.5∶1 mL/g、超聲溫度52 ℃、超聲時間38 min。在此條件下,以95%乙醇為提取溶劑,β-谷甾醇平均提取得率為8.93 mg/g,接近模型中的預測值8.97 mg/g。結論:該方法操作簡便,得率較高,具有實際意義。

薏米,β-谷甾醇,超聲輔助提取,響應面法

薏米(CoixchinensisTod)又稱薏苡仁、薏仁米、藥玉米等,是常見的一種谷物[1]。其營養(yǎng)價值和藥用價值很高,不僅含蛋白質、脂肪、碳水化合物以及各種微量元素,還含有β、γ型兩種谷甾醇。β-谷甾醇(β-sitosterol)是植物甾醇類成分之一,屬于四環(huán)三帖類化合物,具有很好的生理活性和安全性,不僅可以降低飲食中膽固醇的吸收,而且還可以降低人體血漿中總膽固醇和低密度脂蛋白(LDL)的含量[2]。谷甾醇以結晶醇狀態(tài)存在于植物的不皂化物質中,也是植物油脂中的一種主要不皂化物。最常見的植物甾醇包括谷甾醇、谷甾烷醇、菜油甾醇和豆甾醇等[3]。β-谷甾醇對人體具有較強的抗炎作用,能夠抑制人體對膽固醇的吸收、合成等;用于預防治療冠狀動脈粥樣硬化類的心臟病;是重要的甾體藥物和維生素D3的生產(chǎn)原料[3]。

烏汗其木格[4]以裸燕麥麩皮為原料,采用溶劑結晶法從其非皂化物中提取β-谷甾醇,測得粗提物中β-谷甾醇含量為2.02%。陳如壽[5]運用超聲波法提取毛竹筍頭中的β-谷甾醇,此方法提取率高于溶劑法以及超臨界流體萃取法,并且耗費低,測得β-谷甾醇提取含量為0.249%。目前對薏米的研究報道多集中于對薏米的蛋白質、淀粉、多糖等的提取[6-7],有關薏米中谷甾醇提取及含量的測定,尚未見相關報道。對于β-谷甾醇的提取,大多是從燕麥、蕎麥、竹筍、油脂等原料中提取[8-11],但是提取率相對較低。據(jù)文獻[6]得知,薏米中每100 g總甾醇含有38.42 mgβ-谷甾醇,其含量位于前列,僅次于蕎麥、燕麥中谷甾醇的含量。所以本實驗通過響應面法優(yōu)化薏米中β-谷甾醇的超聲提取條件,并通過高效液相色譜法測定其含量,為其在食品、飼料等研究領域提供技術支持。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

薏米 自錦州市新瑪特超市,粉碎過60目篩;β-谷甾醇標準品 純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司;甲醇、乙腈 色譜純,鄭州鑫瑞化驗設備科技銷售公司;水 超純水;乙醇等其他試劑 均為分析純,天津貝斯醫(yī)藥科技有限公司。

高速萬能粉碎機 津市泰斯特儀器有限公司;LC-15C型高效液相色譜儀 島津企業(yè)管理(中國)有限公司;旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;電熱恒溫水浴鍋 天津市秦斯特儀器有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司;KQ3200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1β-谷甾醇提取工藝流程 薏米粉碎→70 ℃烘干→稱取2 g粉末→加40 mL 95%乙醇→超聲提取2 h→過濾提取液→旋轉蒸發(fā)揮干溶劑→粗提物[12-14]。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 液料比對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響 稱取5份薏米粉末各2 g,在超聲時間為30 min,超聲溫度為45 ℃,乙醇濃度為95%的條件下,設定液料比分別為10∶1、12.5∶1、15∶1、17.5∶1、20∶1 mL/g,研究液料比對β-谷甾醇提取得率的影響。

1.2.2.2 超聲時間對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響 稱取5份薏米粉末各2 g,在液料比為15∶1 mL/g,超聲溫度為45 ℃,乙醇濃度為95%的條件下,設定超聲時間分別為20、30、40、50、60 min,研究超聲時間對β-谷甾醇提取得率的影響。

1.2.2.3 超聲溫度對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響 稱取5份薏米粉末各2 g,在液料比為15∶1 mL/g,超聲時間為30 min,乙醇濃度為95%的條件下,設定超聲溫度分別為15、30、45、60、75 ℃,研究超聲溫度對β-谷甾醇提取得率的影響。

1.2.2.4 乙醇濃度對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響 稱取5份薏米粉末各2 g,在液料比為15∶1 mL/g,超聲時間為30 min,超聲溫度為45 ℃的條件下,設定乙醇濃度分別為75%、80%、85%、90%、95%,研究乙醇濃度對β-谷甾醇提取得率的影響。

1.2.3 響應面實驗 結合單因素實驗結果,影響薏米中β-谷甾醇提取的顯著因素為液料比、超聲時間、超聲溫度,根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設計原理,采用三因素三水平的響應面分析法,得出薏米中β-谷甾醇的最佳提取工藝條件,實驗因素水平見表1。

表1 Box-Behnken設計實驗因素與水平

1.2.4β-谷甾醇含量的測定

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱:C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-乙腈(35∶65)；波長:246 nm；柱溫:30 ℃；進樣量:10 μL；流速:0.8 mL/min。

1.2.4.2 標準曲線的繪制 精確稱取20 mgβ-谷甾醇標準品,用色譜甲醇定容至10 mL容量瓶中,配成濃度為2 mg/mL的標準品溶液,超聲溶解后備用。取上述標準品溶液,制成濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL的溶液,依次進入高效液相色譜儀,以質量濃度為橫坐標(x),峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線，得到標準曲線的線性回歸方程為Y：=9097.9x+381.54,線性系數(shù)為0.9992,線性關系良好。

1.2.4.3 樣品中β-谷甾醇含量的測定 粗提物用色譜甲醇溶解,定容至10 mL容量瓶,0.45 μm微孔濾膜過濾后進樣。

β-谷甾醇提取得率(mg/g)=[β-谷甾醇濃度(mg/mL)×體積(mL)]/原料質量(g)

式(1)

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 實驗平行數(shù)3次,結果采用平均值±標準差形式表示,單因素實驗采用SPSS 13.0軟件和Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理。響應面實驗采用Design Expert 8.0.6進行實驗數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1 液料比對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響 圖1表明,隨著液料比逐漸增大,β-谷甾醇提取得率呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢。在液料比為15∶1 mL/g時,β-谷甾醇提取得率最大。由于溶劑達到一定量時,即使增大溶劑量對提取得率影響也不大[15-16],因此為了節(jié)約溶劑,本實驗選擇液料比為15∶1 mL/g。

圖1 液料比對薏米中β-谷甾醇提取率的影響

2.1.2 超聲時間對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響 圖2表明,隨著超聲時間的增加,β-谷甾醇提取得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,超聲時間為30 min時,提取得率最高。當時間超過30 min時,提取得率逐漸下降,可能是由于時間過長,樣品中β-谷甾醇部分被氧化分解,從而導致β-谷甾醇的提取得率呈現(xiàn)下降趨勢,不利于植物甾醇的提取[17-19],因此選擇超聲時間為30 min。

圖2 超聲時間對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響

2.1.3 超聲溫度對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響 圖3表明,隨著超聲溫度的升高,β-谷甾醇提取得率先增大后減小,在15～45 ℃時β-谷甾醇提取得率逐漸升高,這是因為隨著溫度的升高,β-谷甾醇溶解度增大[19-21]。在45～75 ℃,由于溫度升高,分子內(nèi)部結構被破壞,β-谷甾醇的性質會有一些變化,發(fā)生氧化,導致提取得率下降[19]。因此,最適溫度為45 ℃。

圖3 超聲溫度對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響

2.1.4 乙醇濃度對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響 圖4表明,隨著乙醇濃度的增大,β-谷甾醇提取得率也隨之增大。當乙醇濃度為95%時,β-谷甾醇提取得率有最大值。這是因為少量水的存在有助于提高植物甾醇的提取得率[22],因此選擇最佳的乙醇濃度為95%。

圖4 乙醇濃度對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響

2.2響應面優(yōu)化實驗

2.2.1 實驗設計及結果 根據(jù)單因素實驗結果,選擇液料比、超聲時間、超聲溫度為考察因素,以β-谷甾醇提取得率為響應值進行優(yōu)化,得到的響應面實驗結果見表2。

表2 響應面實驗設計及結果

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 利用Design Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合,得到β-谷甾醇提取得率分別與三因素之間二次多項回歸模型的方程為Y=7.30+1.63A+1.33B+1.44C+0.19AB+0.45AC-0.34BC-0.89A2-0.81B2-1.27C2

對模型進行方差分析(見表3),方程中各項系數(shù)絕對值的大小直接反映各因素對響應值的影響程度[22-23]。由表3可知,模型的p<0.0001,說明回歸方程極顯著,失擬項p=0.2119>0.05(不顯著),說明回歸方程與實際情況有較好的吻合,實驗誤差小。該回歸方程的擬合度是99.18%(R2=0.9918),說明實際值與預測值擬合較好,實驗方法可行。一次項A、B、C對y值的影響極顯著(p<0.0001),交互項AC、BC對y值影響顯著(p<0.05),二次項A2、B2、C2對y值影響極顯著(p<0.01)。根據(jù)F值的大小,得出這三個因素對β-谷甾醇提取得率的影響為:A>C>B。

表3 方差分析結果

注:**為極顯著,p≤0.01;*為顯著,p≤0.05;不標記為不顯著,p>0.05。

2.2.3 交互作用 圖5表示液料比和提取時間交互作用對β-谷甾醇提取得率的影響,響應曲面坡度比較平滑,說明其交互作用較小[23-24]。隨著兩因素的變化,提取率平緩上升,交互作用較弱,這與方差分析結果一致。從響應曲面圖中可以看出液料比在15.5∶1～17.5∶1 mL/g之間,提取時間在30～40 min之間,β-谷甾醇提取得率存在最高值。

圖5 提取時間與料液比交互作用圖

圖6表示提取溫度和液料比交互作用對β-谷甾醇提取得率的影響,由響應面曲線圖可知,曲面較為陡峭,說明兩因素交互作用較顯著[25-26]。隨著提取溫度及液料比的增大,提取率先增大后趨于穩(wěn)定,上升的幅度較小。當超聲溫度在48～54 ℃,液料比在16.5∶1～17.5∶1 mL/g時,β-谷甾醇提取得率存在最高值。

圖6 提取溫度與液料比交互作用圖

圖7表示提取溫度和提取時間交互作用對β-谷甾醇提取得率的影響,根據(jù)響應面圖彎曲程度可知,曲面較為陡峭,說明兩因素交互作用顯著。隨著兩因素的增加,提取得率先增大后下降。當提取溫度在48～54 ℃,提取時間在30～40 min之間,β-谷甾醇提取得率達到最大值。

圖7 提取溫度與提取時間交互作用圖

2.2.4 驗證實驗 應用Box-Behnken軟件得到的最佳工藝:即液料比17.52∶1 mL/g,超聲溫度51.63 ℃,超聲時間38.24 min,由于工藝的需要，將液料比的結果保留一位小數(shù)，其他條件取整，修正為：液料比17.5∶1 mL/g,超聲溫度52 ℃,超聲時間38 min,此條件下得到β-谷甾醇提取得率的模型預測值為8.97 mg/g。為驗證模型預測值的可靠性,在此條件下進行3次平行實驗,得到β-谷甾醇提取得率平均值為(8.93±0.03) mg/g,與預測值8.97 mg/g比較接近,說明該模型回歸方程具有可靠性,可以應用于β-谷甾醇提取得率的工藝研究。

3 結論

通過單因素實驗分析,選擇對薏米中β-谷甾醇提取得率影響較大的三個因素,并應用Design-Expert.V 8.0.6軟件中的Box-Behnken設計方法,得出β-谷甾醇提取的最佳工藝條件:液料比17.5∶1 mL/g,超聲溫度52 ℃,超聲時間38 min,此條件下,以95%乙醇為提取溶劑,得到β-谷甾醇的提取得率為8.93 mg/g,與預測值8.97 mg/g基本吻合,說明該方法得到的薏米中β-谷甾醇的提取條件真實可靠,并且提取得率較高。因此本條件可以成為β-谷甾醇提取的可靠的方法。

[1]曹向宇,劉劍利,蘆秀麗,等.薏米蛋白提取方法比較研究[J].食品科學,2011(8):88-92.

[2]董紅艷,張守文.薏米蛋白的酶水解工藝優(yōu)化[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學刊,2013(5):46-50.

[3]錢偉. 甾醇和必需脂肪酸微囊化研究[D].大連:大連工業(yè)大學,2009.

[4]烏漢其木格,張美莉. 裸燕麥麩皮中β-谷甾醇的提取[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2007(1):131-133.

[5]董紅艷,張守文. 薏米蛋白的酶水解工藝優(yōu)化[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工·學刊,2013(5):46-50.

[6]熊柳,韓忠杰,孫慶杰. 薏米粉及其淀粉的理化性質和淀粉消化性對比[J]. 中國糧油學報,2012(7):32-37.

[7]莊瑋婧. 薏米多糖結構與理化性質的研究[D].福州:福建農(nóng)林大學,2008.

[8]陳如壽,殷鐘意,鄭旭煦，等.響應面法優(yōu)化竹筍剩余物甾醇的超聲輔助提取工藝[J].食品科學,2012(14):85-90.

[9]洪慶慈,王梅,姜偉,等.燕麥中主要甾醇的鑒定和效能實驗[J].食品科學,2002(1):103-106.

[10]李和,李玉幗.植物油中常見的幾種植物甾醇的薄層色譜分離與鑒別[J].中國油脂,1997(2):20-22.

[11]邱豐艷,丁力,曹紅云.高效液相色譜法測定油脂中β-谷甾醇的含量[J].中國油脂,2014(7):91-95.

[12]蔡森森.桑白皮甾醇的提取及功能研究[D].吉林:吉林大學,2013.

[13]楊豐滇.傳統(tǒng)山藥和無硫山藥β-谷甾醇、腺苷、亞油酸含量研究[D].鄭州:河南中醫(yī)學院,2014.

[14]Yongqian,Zhang Zhihui,Xu Chao,et al. Development and Validation of a HPLC Method for Determination of Flavone Glycoside-Camellianin B in Cephalotaxus Sinensis[J]. Journal of Beijing Institute of Technology,2017(1):129-134.

[15]支文星,程玉釧,李先榮.HPLC法測定白土茯苓中β-谷甾醇的含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2010(4):49-50.

[16]Araceli Olivares,Irene Martínez,Andrés Illanes.Enzyme assisted fractionation of wood sterols mixture by short path distillation[J]. Chemical Engineering Journal,2012(191):557-562.

[17]Guihua Xu,Lei Guan,Junliang Sun,et al.Oxidation of Cholesterol andβ-Sitosterol and Prevention by Natural Antioxidants[J]. Journal of Agriculture,2009,57(19):9284-9292.

[18]項昭保,劉星宇.響應面法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同輔助提取橄欖多酚工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2016(1):195-200.

[19]昌超. 茶葉籽中植物甾醇的提取及其降血脂功能評價[D].長沙:湖南農(nóng)業(yè)大學,2015.

[20]徐艷陽,蔡森森,宋艷翎,等.響應面法優(yōu)化桑白皮甾醇微波輔助提取工藝[J].食品科學,2013(18):65-69.

[21]林麗靜,呂國提,李積華,等.響應面法優(yōu)化毛竹筍筍頭中β-谷甾醇提取工藝的研究[J].食品工業(yè)科技,2012(22):269-271,275.

[22]高政.菜籽植物甾醇的提取、純化及抗氧化活性研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學,2009.

[23]李陽,池建偉,張虹,等.HPLC法測定油脂混合體系中β-谷甾醇添加量的研究[J].福州大學學報：自然科學版,2014(1):143-148.

[24]Sarangthem K,Singh T N,Thongam W.Transformation of fermented bamboo(Dendrocalamushamiltonii)shoots into phytosterols by microorganisms[J]. Journal of Food Science and Technology Mysore,2003(40):622-625.

[25]陳博,耿麗晶,黃鶴,等. 響應面法優(yōu)化速食海鮮羹的加工工藝[J]. 食品工業(yè)科技,2017(4):1-13.

[26]LC Gutkoski,AA El-Dash. Effect of extrusion process variables on physical and chemical properties of extruded oat products[J]. Plant Foods for Human Nutrition,1999(4):315-325.

Optimizationofextractiontechnologyofβ-sitosterolfromcoixseedbyresponsesurfacemethodology

ZHANGDong-yang,GUOXue-song*

(School of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,China)

Objective:Extraction ofβ-sitosterol from coix seed by ultrasound,and use to provide a reference for processing and utilization of functional food. Methods:In this experiment,coix seed was used as raw material and ground into powder,and the ratio of material to liquid,ultrasonic temperature,ultrasonic time and ethanol concentration were taken as single factor. The response surface method was used to study on the effects of different factors and their interactions onβ-sitosterol extraction rate in coix seed. Results:The optimal extraction conditions ofβ-sitosterol in coix seed were as follows:liquid ratio(methanol:coix seed)was 17.5∶1 mL/g,ultrasonic temperature was 52 ℃,ultrasonic time was 38 min. Under these conditions,theβ-sitosterol average extraction rate was 8.93 mg/g close to the predicted value 8.97 mg/g in the model. Conclusion:The method had the advantages of simple operation,high yield and practical significance.

coix seed;β-sitosterol;ultrasonic assisted extraction;response surface method

2017-04-25

張冬陽(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程，E-mail：zdy201520027@163.com。

*

郭雪松(1970-)，男，碩士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品精深加工及綜合利用，E-mail：356365279@qq.com。

TS201.2

B

1002-0306(2017)22-0206-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.040