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(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121000)

水提酸沉法提取蜂王漿水溶性蛋白的工藝優(yōu)化

張?jiān)?付莉*

(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121000)

以黑龍江密山蜂王漿作為原料,水溶性蛋白提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)和PB實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法對(duì)水提酸沉法提取蜂王漿水溶性蛋白的工藝進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,最佳工藝參數(shù)為離心轉(zhuǎn)速10000 r/min、離心時(shí)間25 min、料水質(zhì)量比1∶20、超聲波提取時(shí)間41 min、沉淀時(shí)間43 min,此條件下蜂王漿水溶性蛋白提取率達(dá)到69.97%,是蜂王漿水溶性蛋白提取的較好方法。

水提酸沉法,蜂王漿,水溶性蛋白,提取工藝,優(yōu)化

蜂王漿(Royal jelly,RJ)是可供人類直接服用并能被人體很好吸收的含高活性成分的超級(jí)營(yíng)養(yǎng)食品,具有多種生物活性且大多跟蜂王漿中所含的豐富的蛋白質(zhì)密切相關(guān)[1-2]。蜂王漿中水溶性蛋白質(zhì)約占蜂王漿總蛋白的46%～89%,是蜂王漿中最主要的活性成分。但是由于國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上銷售的僅有新鮮蜂王漿或其凍干粉產(chǎn)品,因此研發(fā)蜂王漿水溶性蛋白相關(guān)的新產(chǎn)品十分必要[3-5]。

目前對(duì)蜂王漿水溶性蛋白的提取多采用堿溶酸沉、鹽提酸沉法等方法,與這些方法相比,水提酸沉法具有成本低、操作簡(jiǎn)單、可保存被分離物生物活性等優(yōu)點(diǎn)[6-7]。因此,本實(shí)驗(yàn)采用水提酸沉法對(duì)蜂王漿水溶性蛋白的提取工藝進(jìn)行研究,以水溶性蛋白提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過單因素實(shí)驗(yàn)、PB和響應(yīng)面優(yōu)化分析,對(duì)蜂王漿水溶性蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,獲得水提酸沉法提取蜂王漿水溶性蛋白的最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

蜂王漿 黑龍江密山蜂場(chǎng),-20 ℃凍藏;牛血清蛋白 北京索萊寶科技有限公司;鹽酸、硫酸鉀、95%乙醇、考馬斯亮藍(lán)G-250、85%磷酸等 均為分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

UV-6300型紫外可見分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司;KND-04型微量凱氏定氮裝置 上海新嘉電子有限公司;KQ3200B型超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;立式高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜂王漿水溶性蛋白提取工藝 10 g蜂王漿(按一定比例加入蒸餾水)→超聲波提取(150 W)一定時(shí)間→4 ℃離心(一定離心轉(zhuǎn)速、一定時(shí)間)→去沉淀→收集上清液→用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)→沉淀→4 ℃、12000 r/min離心20 min→去上清液→收集沉淀得到含鹽蛋白質(zhì)→透析除鹽→蛋白提取物。

1.2.2 蜂王漿水溶性蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定 預(yù)實(shí)驗(yàn)：將10 g蜂王漿與蒸餾水以1∶5的比例進(jìn)行混合，攪拌使其充分混勻，4 ℃浸提1 h，12000 r/min離心20 min，收集上清液。分別取5 mL上清液加入到5支干凈的具塞刻度比色管中，編號(hào)為1、2、3、4、5，并用0.1 mol/L鹽酸和0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，并用蒸餾水定容至25 mL，4 ℃靜置5 h后，觀察5支比色管中溶液的渾濁程度(即蛋白質(zhì)的沉淀量)[8]。

分別取上述5 mL上清液加入到11支干凈的具塞刻度比色管中，編號(hào)為1～11，并用0.1 mol/L鹽酸和0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH分別為4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0，并用蒸餾水定容至25 mL，4 ℃靜置5 h后，觀察11支比色管中溶液的渾濁程度(即蛋白質(zhì)的沉淀量)[8]。

1.2.3 蜂王漿水溶性蛋白提取工藝優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 采用1.2.1的工藝提取蜂王漿水溶性蛋白,重新溶于蒸餾水并于波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度,提取條件為:超聲波提取30 min,10000 r/min離心20 min,沉淀40 min,考察不同料水質(zhì)量比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)對(duì)水溶性蛋白提取率的影響;料水質(zhì)量比1∶20,10000 r/min離心25 min,沉淀40 min,考察不同超聲波提取時(shí)間(10、20、30、40、50 min)對(duì)水溶性蛋白提取率的影響;料水質(zhì)量比1∶20,超聲波提取30 min,離心20 min,沉淀40 min,考察不同離心轉(zhuǎn)速(4000、6000、8000、10000、12000 r/min)對(duì)水溶性蛋白提取率的影響;料水質(zhì)量比1∶20,超聲波提取30 min,離心轉(zhuǎn)速10000 r/min,沉淀40 min,考察不同離心時(shí)間(15、20、25、30、35 min)對(duì)水溶性蛋白提取率的影響;料水質(zhì)量比1∶20,超聲波提取40 min,10000 r/min離心25 min,考察不同沉淀時(shí)間(20、30、40、50、60 min)對(duì)水溶性蛋白提取率的影響。

1.2.3.2 PB實(shí)驗(yàn)選取顯著性因素 以上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行N=12的PB實(shí)驗(yàn),對(duì)上述5個(gè)因素加以考察,每個(gè)因素選擇-1和1兩個(gè)水平,將蜂王漿水溶性蛋白提取率作為響應(yīng)值[9]。PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平和編碼如表1所示。

表1 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平和編碼

1.2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) PB實(shí)驗(yàn)選定因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),確定最佳提取條件。離心轉(zhuǎn)速10000 r/min,離心時(shí)間25 min。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼

1.2.3.4 蜂王漿水溶性蛋白提取率測(cè)定 參考GB 5009.5-2016中方法測(cè)定蜂王漿總蛋白含量。參考《進(jìn)出口危險(xiǎn)化學(xué)品安全實(shí)驗(yàn)方法》中第20部分Bradford法測(cè)定提取所得蜂王漿水溶性蛋白含量,得到線性回歸方程:y=0.0062x+0.0621,R2=0.9999,表明Bradford法中吸光度(y)與牛血清蛋白含量(x)之間有非常明顯的線性關(guān)系,將樣品吸光度代入該方程,即可得樣品蜂王漿中所含水溶性蛋白含量,再根據(jù)式(1)計(jì)算出蜂王漿水溶性蛋白的提取率。

蜂王漿水溶性蛋白提取率(%)=蜂王漿水溶性蛋白含量/蜂王漿總蛋白含量×100

式(1)

1.3數(shù)據(jù)處理

PB實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面的設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析利用Design-Expert 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1蜂王漿水溶性蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在pH4和pH5時(shí),水溶性蛋白沉淀量最大,為了更精確地測(cè)定水溶性蛋白的等電點(diǎn),在pH4和pH5之間每隔0.1個(gè)單位調(diào)節(jié)一個(gè)pH,結(jié)果如表1所示,pH4.4時(shí)沉淀量最大,因此蜂王漿水溶性蛋白等電點(diǎn)為pH4.4。

表3 水溶性蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定

注:“+”表示沉淀量的多少,“+”越多表示沉淀量越多。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料水質(zhì)量比對(duì)水溶性蛋白提取率的影響 如圖1所示,水溶性蛋白提取率隨著料水質(zhì)量比的增大出現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì),并且料水質(zhì)量比在1∶20時(shí)最高。這可能是因?yàn)榱纤|(zhì)量比太低，水溶性蛋白不能完全溶于水中,隨著料水質(zhì)量比的增大,水溶性蛋白逐漸溶于水中,而過高的料水質(zhì)量比會(huì)使得體系中的蛋白質(zhì)太過分散,有效組分含量減少,難以全部回收,導(dǎo)致水溶性蛋白提取率降低[10],因此,料水質(zhì)量比選取1∶20。

圖1 料水質(zhì)量比對(duì)水溶性蛋白提取率的影響

2.2.2 超聲波提取時(shí)間對(duì)水溶性蛋白提取率的影響 如圖2所示,蜂王漿水溶性蛋白提取率隨著超聲波提取時(shí)間的增加,出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),并且在超聲波提取40 min時(shí)最高。超聲波通過波源的振蕩作用,使提取物的外表受到機(jī)械損傷和破碎,使溶脹的時(shí)間大大地減少。超聲空化作用使得蛋白質(zhì)在較短時(shí)間內(nèi)最大限度的溶出,而超聲空化作用時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使得蛋白質(zhì)變性,從而導(dǎo)致水溶性蛋白提取率降低[11-12]。因此,超聲波提取時(shí)間選擇40 min。

圖2 超聲波提取時(shí)間對(duì)水溶性蛋白提取率的影響

2.2.3 離心轉(zhuǎn)速對(duì)水溶性蛋白提取率的影響 如圖3所示,蜂王漿水溶性蛋白提取率隨著離心轉(zhuǎn)速的增大,呈現(xiàn)先降低后增高再降低的趨勢(shì),并且離心轉(zhuǎn)速4000 r/min時(shí)最高。但是離心轉(zhuǎn)速4000 r/min和6000 r/min時(shí),溶液呈渾濁狀,不溶性蛋白質(zhì)的混入導(dǎo)致了結(jié)果偏高;而離心轉(zhuǎn)速在8000～12000 r/min時(shí),10000r/min的水溶性蛋白提取率最高。因此離心轉(zhuǎn)速選取10000 r/min。

圖3 離心轉(zhuǎn)速對(duì)水溶性蛋白提取率的影響

2.2.4 離心時(shí)間對(duì)水溶性蛋白提取率的影響 如圖4所示,蜂王漿水溶性蛋白提取率隨著離心時(shí)間的增加,呈現(xiàn)降低并趨于恒定的趨勢(shì),并且在離心時(shí)間15 min時(shí)最高。但是離心時(shí)間15 min和20 min時(shí),溶液呈渾濁狀,不溶性蛋白質(zhì)的混入導(dǎo)致了結(jié)果偏高[13],而25～35 min范圍內(nèi),水溶性蛋白提取率趨于恒定,所以綜合考慮,離心時(shí)間選擇25 min。

圖4 離心時(shí)間對(duì)水溶性蛋白提取率的影響

2.2.5 沉淀時(shí)間對(duì)水溶性蛋白提取率的影響 如圖5所示,蜂王漿水溶性蛋白提取率隨著沉淀時(shí)間的增加,呈現(xiàn)先增高后趨于穩(wěn)定的變化趨勢(shì),并且在沉淀時(shí)間60 min時(shí)最高。但40～60 min逐漸趨于最大沉降限度,水溶性蛋白提取率趨于恒定。所以考慮節(jié)約資源問題,沉淀時(shí)間選擇40 min。

圖5 沉淀時(shí)間對(duì)水溶性蛋白提取率的影響

2.3PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行N=12的PB實(shí)驗(yàn),對(duì)上述5個(gè)因素加以考察,結(jié)果如表4所示。

表5 PB實(shí)驗(yàn)方差分析

表4 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3.2 PB實(shí)驗(yàn)方差分析 利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行回歸擬合,得到回歸方程為:蜂王漿水溶性蛋白提取率(%)=63.92-0.062A-0.53B+3.21C+2.14D+2.46E。方差分析如表5所示,R2=0.9618,且回歸模型(p<0.05)顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。五個(gè)因素中只有料水質(zhì)量比、超聲波提取時(shí)間、沉淀時(shí)間對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取率影響顯著,因此選定該三個(gè)因素進(jìn)行接下來的響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2.4響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析 以單因素及PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),選擇料水質(zhì)量比(A)、沉淀時(shí)間(B)、超聲波提取時(shí)間(C)三個(gè)因素,水溶性蛋白提取率(Y)為響應(yīng)值,利用響應(yīng)面軟件設(shè)計(jì)水提酸沉法提取蜂王漿水溶性蛋白實(shí)驗(yàn)方案。結(jié)果如表6所示。

表6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4.2 回歸模型的方差分析 運(yùn)用響應(yīng)面軟件將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)回歸擬合,得到蜂王漿水溶性蛋白提取率與料水質(zhì)量比、沉淀時(shí)間、超聲波提取時(shí)間三因素間的回歸方程:Y：水溶性蛋白提取率(%)=69.76+1.11A+0.47B+1.80C-0.72AB-1.87AC-0.21BC-3.41A2-3.10B2-3.03C2。該方程的二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值,初步推斷響應(yīng)面開口向下,在各因素所選水平范圍內(nèi)具有極大值點(diǎn),能夠進(jìn)行蜂王漿水溶性蛋白提取率工藝的優(yōu)化分析[14-15]。

表7 回歸模型的方差分析結(jié)果

圖6 AB、AC、BC交互作用對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取率影響的響應(yīng)面圖

注:***:p<0.001為極顯著；**:p<0.01為非常顯著；*:p<0.05顯著。

回歸模型的方差分析結(jié)果如表7所示，該模型p<0.001(極顯著)，失擬項(xiàng)=0.9549>0.05(不顯著)，表明該回歸模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)很吻合，實(shí)驗(yàn)誤差較小。回歸模型R2=0.9987，即擬合優(yōu)度為99.87%，表示該回歸模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度較高，自變量和響應(yīng)值間有明顯的線性關(guān)系，所以該模型可對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行理論推測(cè)。料水質(zhì)量比、超聲波提取時(shí)間和沉淀時(shí)間的p值均小于0.001,說明三因素對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取率影響均極顯著。F值大小能夠反映出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度,并呈正相關(guān)[16],因此,可得出三者對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取率的影響程度依次是超聲波提取時(shí)間>料水質(zhì)量比>沉淀時(shí)間。交互項(xiàng)AB、AC影響極顯著(p<0.001),交互項(xiàng)BC影響不顯著(p>0.05)。

2.4.3 響應(yīng)面分析圖 從圖6中可以得出,各因素及其交互作用對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取率的影響。從圖6(A)中可以看出,隨著料水質(zhì)量比和超聲波提取時(shí)間的增加,蜂王漿水溶性蛋白提取率均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),響應(yīng)面圖形曲面弧度較大,表明二者交互作用對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取率影響顯著。從圖6(B)中可以看出,隨著料水質(zhì)量比和沉淀時(shí)間的增加,蜂王漿水溶性蛋白提取率均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),響應(yīng)面圖形曲面陡峭[16],表明二者間交互作用對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取率的影響顯著。從圖6(C)中可以看出,隨著超聲波提取時(shí)間和沉淀時(shí)間的增加,蜂王漿水溶性蛋白提取率均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),響應(yīng)面圖形曲面弧度小,表明二者間交互作用對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取率的影響不顯著。

2.5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述回歸模型,通過響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)所得水提酸沉法提取蜂王漿水溶性蛋白的最佳條件是:料水質(zhì)量比1∶20、超聲波提取時(shí)間40.57 min、沉淀時(shí)間42.69 min,并得到蜂王漿水溶性蛋白提取率的預(yù)測(cè)值是70.05%。為檢驗(yàn)該結(jié)果的可靠性,擬采用上述響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)所得水提酸沉法提取的條件,并結(jié)合實(shí)際情況,在料水質(zhì)量比1∶20、超聲波提取時(shí)間41 min、沉淀時(shí)間43 min的條件下,經(jīng)過3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),得到蜂王漿水溶性蛋白提取率的平均值為69.97%,與響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)所得預(yù)測(cè)值接近,表明回歸模型預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果很好擬合,響應(yīng)面優(yōu)化分析回歸模型可信度較高,所得最佳條件具有可行性。

3 結(jié)論

采用水提酸沉法提取蜂王漿水溶性蛋白,并在單因素實(shí)驗(yàn)和PB實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面優(yōu)化分析并結(jié)合實(shí)際情況,確定水提酸沉法提取蜂王漿水溶性蛋白的最佳條件:料水質(zhì)量比1∶20、超聲波提取時(shí)間41 min、沉淀時(shí)間43 min。通過該最佳提取條件得到蜂王漿水溶性蛋白提取率的平均值為69.97%,與理論預(yù)測(cè)值的誤差小于0.1%,表明所建蜂王漿水溶性蛋白提取回歸模型成功。

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Optimizationofwater-solubleproteinextractionprocessofroyaljellybywaterextractionandacidprecipitation

ZHANGYue,FULi*

(College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China)

This experiment chose the royal jelly from Heilongjiang Mishan as raw material and took water-soluble protein extraction rate as evaluation indicator.Based on single factor experiment and Plackett-Burman design,the response surface optimization method was used to optimize the extraction of water-soluble protein from royal jelly by water extraction acid precipitation.The experiment showed that the optimum technological parameters were centrifugal speed 10000 r/min,centrifugation time 25 minutes,material water mass ratio 1∶20,ultrasonic extraction time 41 minutes,precipitation time 43 minutes.Under the condition,the water-soluble protein extraction rate of royal jelly was up to 69.97%,this method was the better way to extract royal jellywater-soluble protein .

water extraction and acid precipitation method;royal jelly;water-soluble protein;extraction process;optimization

2017-06-09

張?jiān)?1992-)，女，碩士，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：zy505188099@163.com。

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付莉(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：fuli1979119@126.com。

遼寧醫(yī)學(xué)院校內(nèi)課題(LYHX20120810)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)22-0184-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.036