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(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,遼寧錦州 121000;2.93263部隊(duì)醫(yī)院,遼寧錦州 121000;3.錦州醫(yī)科大學(xué),遼寧錦州 121000)

天漿殼多酚的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性評(píng)價(jià)

崔鏨1,呂芳2,王天一3,張富強(qiáng)3,郭斌1,*,韓冠英1,李敏3,白雨鑫1

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,遼寧錦州 121000;2.93263部隊(duì)醫(yī)院,遼寧錦州 121000;3.錦州醫(yī)科大學(xué),遼寧錦州 121000)

目的:確定天漿殼多酚的最佳提取工藝,并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行初步研究。方法:以多酚提取量為指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化天漿殼多酚提取工藝。通過(guò)多酚的還原能力、羥自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)自由基的清除作用來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果:天漿殼多酚最佳提取工藝:乙醇濃度(v/v)為42%,液料比為16∶1 (mL/g),提取溫度為61 ℃,超聲時(shí)間為64 min。在此條件下,天漿殼多酚的提取量為(26.86±0.37) mg/10 g。該多酚具有一定的還原能力,當(dāng)多酚濃度為1 mg/mL時(shí),對(duì)羥自由基和DPPH·自由基清除率分別為70.78%和85.22%。結(jié)論:此優(yōu)化工藝可行,該多酚具有一定的抗氧化能力。

天漿殼,多酚,響應(yīng)面法,抗氧化活性

天漿殼為蘿藦科蘿藦屬植物蘿藦的果殼。蘿藦為多年生纏繞草本,在中國(guó)分布廣泛,且在日本、朝鮮和俄羅斯亦有分布。其果殼在中藥中被稱作“天漿殼”,具有補(bǔ)虛助陽(yáng),止咳化痰之功效。目前對(duì)天漿殼成分的研究主要集中在多糖方面[1-2],楊蕾[3]通過(guò)對(duì)蘿藦藤的定性實(shí)驗(yàn),確定蘿藦中含有酚類物質(zhì),但并未對(duì)蘿藦果殼中酚類物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步研究。研究表明植物多酚具有多種生理活性和藥用價(jià)值,其功能活性表現(xiàn)在抗氧化、抗輻射、抗誘變以及抗腫瘤等多個(gè)方面[4]。

目前,常見(jiàn)的植物多酚提取方法有溶劑萃取法、超臨界流體萃取法、微波浸提法和超聲波輔助提取法。其中溶劑萃取法雖然操作簡(jiǎn)單,但其使用的有機(jī)試劑易燃,且部分有毒,對(duì)安全生產(chǎn)十分不利[5];超臨界流體萃取法采用超臨界CO2為萃取劑,可以避免使用有毒有機(jī)溶劑,且無(wú)環(huán)境污染,產(chǎn)品分離時(shí)簡(jiǎn)單方便,但需一次性投入較多的資金[6];微波浸提只適合短時(shí)間內(nèi)快速提取,長(zhǎng)時(shí)間提取可能會(huì)導(dǎo)致提取液溫度過(guò)高使多酚類物質(zhì)分解,提取量減少[7]。超聲波輔助提取法以其浸提時(shí)間短、提取率高及操作簡(jiǎn)便、對(duì)環(huán)境無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于多種植物多酚的提取研究中[8],如安化黑茶[9]、石榴皮[10]、牡丹籽[11]、棗皮[12]、及蒲公英[13]等的多酚提取。本研究以超聲輔助提取為前提,并在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法來(lái)研究天漿殼中多酚提取的最佳條件,并通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)對(duì)其藥理活性進(jìn)行初步評(píng)價(jià),為進(jìn)一步研究天漿殼多酚抗氧化活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

天漿殼 采摘于遼寧省錦州市周邊,經(jīng)遼寧省錦州市藥品檢驗(yàn)所翟鐵紅主任藥師鑒定為天漿殼;沒(méi)食子酸、福林酚試劑 均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;抗壞血酸(VC) 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·) 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

L5S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;UP3200HE數(shù)控超聲波清洗器 南京壘君達(dá)超聲電子設(shè)備有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 天漿殼多酚的提取 將天漿殼烘干、粉粹,過(guò)40目篩。稱取10.0 g天漿殼粉于500 mL錐形瓶中,將一定濃度的乙醇溶液,按照不同的液料比加入瓶中,攪拌均勻,封口,置于超聲儀中,超聲功率設(shè)定為100 W,在一定溫度下超聲提取一定時(shí)間后,過(guò)濾,得多酚提取液。

1.2.2 天漿殼多酚的提取量測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制根據(jù)福林酚法[14],以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,以其濃度為橫坐標(biāo),765 nm波長(zhǎng)下的吸光度為縱坐標(biāo),所得回歸方程為:A=0.00882C+0.0814(R2=0.9989),線性范圍:20～100 μg/mL。提取量表達(dá)式:M=(10×C×V)/M0。其中M為提取量(mg/10 g);C為濃度(mg/mL);V為溶液體積(mL);M0:為原料質(zhì)量(g)。多酚提取液按照上述方法測(cè)定吸光度并根據(jù)回歸方程計(jì)算多酚提取量,每組測(cè)定3次,取平均值。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用1.2.1中提到的方法,在液料比10∶1 (mL/g),超聲時(shí)間60 min,溫度60 ℃的條件下,考察乙醇濃度(25%、35%、45%、55%、65%、75%,v/v)對(duì)天漿殼多酚提取量的影響;在乙醇濃度(v/v)55%,超聲時(shí)間60 min,溫度60 ℃的條件下,考察液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)對(duì)天漿殼多酚提取量的影響;在液料比10∶1 (mL/g),乙醇濃度(v/v)55%,超聲時(shí)間60 min的條件下,考察溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)對(duì)天漿殼多酚提取量的影響;在液料比10∶1 (mL/g),乙醇濃度(v/v)55%,溫度60 ℃的條件下,考察不同時(shí)間(15、30、45、60、75、90 min)對(duì)天漿殼多酚提取含量的影響。進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),分析各因素對(duì)天漿殼多酚提取量(mg/10 g)的影響。

1.2.4 Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),根據(jù)Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以天漿殼多酚提取量作為響應(yīng)值,選取單因素實(shí)驗(yàn)中的四個(gè)因素:A(乙醇濃度)、B(料液比)、C(溫度)和D(超聲時(shí)間),建立四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),每組平行測(cè)定3次,取平均值。設(shè)計(jì)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平

1.2.5 天漿殼多酚的體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 總還原能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)[15],在1 mL不同濃度的樣品溶液中,分別加入2 mL磷酸緩沖鹽溶液(0.2 mol/L,pH6.6)和2.5 mL的1%鐵氰化鉀溶液,充分混勻后,在50 ℃下水浴反應(yīng)20 min,冷卻后,向各個(gè)反應(yīng)液中加入10%三氯乙酸2 mL終止反應(yīng)并離心。取2.5 mL上清液與等體積蒸餾水混勻后,加入0.5 mL的0.1%三氯化鐵溶液,充分混勻,室溫下反應(yīng)10 min,在700 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度,用VC作為陽(yáng)性對(duì)照,每組實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次。

1.2.5.2 清除羥自由基測(cè)定 參考文獻(xiàn)[16],在1 mL不同濃度的樣品溶液中,分別加入1 mL FeSO4溶液(2 mmol/L),1 mL水楊酸乙醇溶液(2 mmol/L),1 mL H2O2(2 mmol/L)溶液,充分振蕩后,在37 ℃下水浴反應(yīng)30 min后,在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度,用VC作為陽(yáng)性對(duì)照,每組實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次,并計(jì)算羥自由基的清除率。清除率計(jì)算公式:

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100

其中，A0為1 mL蒸餾水與反應(yīng)試劑的吸光度;A1為樣品或VC與反應(yīng)試劑的吸光度;A2為樣品或VC反應(yīng)液不加入H2O2的吸光度(H2O2以等體積蒸餾水代替)。

1.2.5.3 清除DPPH·測(cè)定 參考文獻(xiàn)[17],在2 mL不同濃度的樣品溶液中,加入等體積的DPPH·乙醇溶液(0.1 mmol/L),混合均勻,置于37 ℃水浴條件下反應(yīng)30 min后,在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。用VC作為陽(yáng)性對(duì)照,每組實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次,并計(jì)算DPPH·的清除率。清除率計(jì)算公式:

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100

其中，A0為2 mL蒸餾水加入DPPH·乙醇溶液的吸光度;A1為樣品/VC反應(yīng)液中加入DPPH乙醇溶液的吸光度;A2為樣品/VC反應(yīng)液不加入DPPH·乙醇溶液的吸光度(DPPH·乙醇溶液以等體積乙醇代替)。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Origin 8.0軟件作圖;Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)多酚提取量的影響 所得結(jié)果見(jiàn)圖1。根據(jù)圖1結(jié)果可知,在其它提取條件不變的情況下,在乙醇濃度小于45%時(shí)，多酚提取量隨著乙醇濃度的升高而增加,這可能是因?yàn)楫?dāng)有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)較低時(shí),不能破壞多酚與多糖、蛋白質(zhì)等有機(jī)物質(zhì)之間的氫鍵和疏水作用力,不利于多酚提取。當(dāng)乙醇濃度升高到45%后,其提取量隨著乙醇濃度的升高而減少,這是由于天漿殼中的色素,醇溶性物質(zhì)等成分的溶出量增加,這些成分與多酚類化合物競(jìng)爭(zhēng)同乙醇-水分子結(jié)合,同時(shí)天漿殼組織中的通透性下降,從而導(dǎo)致多酚的提取率下降[18]。因此,選擇乙醇濃度為45%。

圖1 乙醇濃度對(duì)多酚提取量的影響

2.1.2 液料比對(duì)多酚提取量的影響 所得結(jié)果見(jiàn)圖2,在其它提取條件不變的情況下,多酚提取量隨著所加提取溶劑體積的增加而逐漸升高,這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)增加液料比有利于增大浸提物與溶劑的接觸面積,使多酚充分溶出,從而提高萃取效率。當(dāng)液料比達(dá)到15∶1 (mL/g)時(shí),多酚提取量達(dá)到最高,液料比繼續(xù)增加多酚提取量趨于穩(wěn)定,可能是因?yàn)榻佑|面積相對(duì)飽和,此時(shí)再增加溶劑體積對(duì)多酚提取量影響不大[19]。液料比越大,溶劑消耗越多。因此,選擇液料比15∶1 (mL/g)為宜。

圖2 液料比對(duì)多酚提取量的影響

2.1.3 溫度對(duì)多酚提取量的影響 所得結(jié)果見(jiàn)圖3,在其它提取條件不變的情況下,多酚提取量隨著提取溫度的升高而增加,當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃,多酚提取量達(dá)到最高,溫度繼續(xù)上升時(shí),其含量有所下降,原因可能是多酚化合物隨著溫度的升高有部分不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)受到破壞[20]。故選擇提取溫度60 ℃為宜。

圖3 提取溫度對(duì)多酚提取量的影響

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響 所得結(jié)果見(jiàn)圖4,在其它提取條件不變的情況下,多酚提取量隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到60 min時(shí),繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間,其含量有所下降,原因可能是較長(zhǎng)時(shí)間的超聲作用會(huì)增加雜質(zhì)的溶出,破壞多酚結(jié)構(gòu)[21]。故選擇超聲時(shí)間為60 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響

2.2BBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及多酚提取量的響應(yīng)值見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

注:**p<0.01為極顯著;*p<0.05為顯著。2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 由Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,所得回歸方程:M=26.23-2.39A+0.47B+0.14C+0.66D-0.23AB+0.24AC+0.50AD+0.54BC-0.11BD-0.060CD-3.49 A2-1.01B2-1.19C2-0.86D2

2.2.3 響應(yīng)面圖分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得的AD和BC的響應(yīng)面曲線圖(見(jiàn)圖5),顯示響應(yīng)曲面陡峭,說(shuō)明交互作用顯著,這與方差分析結(jié)果一致。當(dāng)液料比和提取溫度固定時(shí),乙醇濃度變化曲面比提取時(shí)間的變化曲面陡峭。表明乙醇濃度變化對(duì)多酚提取量的影響比提取時(shí)間大。當(dāng)乙醇濃度和提取時(shí)間固定時(shí),液料比曲面變化比提取溫度變化大,表明料液比的變化對(duì)多酚提取量的影響比溫度大。

圖5 AD、BC對(duì)多酚提取量影響的響應(yīng)面圖

2.2.4 最佳提取條件的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)軟件分析,得出最佳提取工藝條件為:在超聲功率固定為100 W的前提下,乙醇濃度(v/v)為41.69%,液料比為16.4∶1 (mL/g),提取溫度為60.85 ℃,超聲時(shí)間為63.97 min,最大提取量為26.79 mg/10 g。但考慮到具體操作的方便與可行性,將最佳提取工藝條件確定為:乙醇濃度(v/v)為42%,液料比為16∶1 (mL/g),提取溫度為61 ℃,超聲時(shí)間為64 min,在此最佳提取工藝條件下,進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),平均提取量為(26.86±0.37) mg/10 g。由此可知響應(yīng)面法建立的回歸模型可靠,最佳提取工藝可行。將此條件下所得的多酚提取液進(jìn)行濃縮、冷凍干燥,得多酚固體,備用。

2.3天漿殼多酚的體外抗氧化活性

2.3.1 總還原能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果 鐵氰化鉀可在酸性條件下與Fe3+反應(yīng),生成有色物質(zhì),在700 nm處具有特征吸收,且濃度越大,其吸光值越大,即還原能力越強(qiáng)。圖6表明,天漿殼多酚具有一定的還原能力,且還原能力隨著多酚濃度的升高而增強(qiáng),呈現(xiàn)出濃度依賴性,但清除能力弱于VC。

圖6 多酚總還原能力

2.3.2 清除羥自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果 圖7表明,多酚清除羥自由的能力隨著多酚濃度的升高而增強(qiáng),呈現(xiàn)出濃度依賴性,當(dāng)多酚濃度到達(dá)1 mg/mL時(shí),其清除率可達(dá)70.78%,IC50(半抑制濃度)為0.61 mg/mL,說(shuō)明天漿殼多酚對(duì)羥自由基具有一定的清除能力,但清除能力弱于VC。

圖7 多酚對(duì)羥自由基的清除能力

2.3.3 清除DPPH·實(shí)驗(yàn)結(jié)果 可以通過(guò)記錄DPPH·在517 nm處的吸光度值變化來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力強(qiáng)弱。圖8表明,清除能力隨著濃度的升高而增強(qiáng),呈現(xiàn)出濃度依賴性,濃度到達(dá)1 mg/mL時(shí),其清除率可達(dá)到85.22%,IC50(半抑制濃度)為0.37 mg/mL,但清除能力較VC稍弱。說(shuō)明天漿殼多酚對(duì)DPPH·具有一定的清除能力。

圖8 多酚對(duì)DPPH·的清除能力

3 結(jié)論與討論

本研究在單因素的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析法對(duì)天漿殼多酚的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,確定天漿殼多酚最佳提取工藝為:乙醇濃度(v/v)為42%,液料比為16∶1 (mL/g),提取溫度為61 ℃,超聲時(shí)間為64 min,在此條件下多酚提取量可達(dá)到(26.86±0.37) mg/10 g。乙醇濃度、液料比及超聲時(shí)間對(duì)多酚提取含量有顯著影響,溫度影響不顯著,影響大小順序?yàn)?乙醇濃度>超聲時(shí)間>液料比>提取溫度。

機(jī)體內(nèi)的羥自由基是直接或間接導(dǎo)致組織損傷的一種重要活性氧自由基。研究表明,人體內(nèi)的羥自由基的存在可以引發(fā)人體內(nèi)的多種疾病,促進(jìn)人體衰老[22]。DPPH·清除率測(cè)定法廣泛用于定量測(cè)定生物試樣和食品的抗氧化能力[23]。通過(guò)對(duì)天漿殼多酚清除羥自由基和DPPH·的能力評(píng)價(jià),表明天漿殼多酚具有一定的抗氧化能力,且其抗氧化能力呈現(xiàn)濃度依賴性,此外該多酚還具有一定的還原能力。植物來(lái)源的抗氧化活性成分研究遍及醫(yī)藥及功能食品等方面[24],本研究中的天漿殼多酚為開(kāi)發(fā)利用功能保健食品提供了一定的理論依據(jù)。

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OptimizationofextractionprocessofpolyphenolsfromfruitshellofMetaplexisjaponica(Thunb.)Makinoandevaluationofitsantioxidantactivity

CUIZan1,LVFang2,WANGTian-yi3,ZHANGFu-qiang3,GUOBin1,*,HANGuan-ying1,LIMin3,BAIYu-xin1

(1.Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China;2.93263 Military Hospital,Jinzhou 121000,China;3.Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China)

Objective:To determine the optimum extraction process of polyphenols from fruit shell ofMetaplexisjaponica(Thunb.)Makino and preliminarily evaluate its antioxidant activity. Method:On the basis of single factor experiments,the extraction conditions of polyphenols were optimized by response surface methodology with the content of polyphenols as index. The antioxidant capacity was measured by reducing power,scavenging of hydroxyl radicals and DPPH. Result:The optimum extraction conditions were as follows:ethanol concentration(v/v)was 42%,ratio of liquid to solid was 16∶1 (mL/g),extraction temperature was 61 ℃ and extraction time was 64 min. Under the conditions,the extraction amount of polyphenols was(26.86±0.37)mg/10 g. The polyphenols had certain reducing power. When the concentration of polyphenols was 1 mg/mL,the clearance rate on hydroxyl radicals and DPPH· was 70.78% and 85.22%,respectively. Conclusion:The optimized technology was feasible and the polyphenols had certain antioxidant capacity.

shell ofMetaplexisjaponica(Thunb.)Makino;polyphenols;response surface methodology;antioxidant activity

2017-04-21

崔鏨(1986-)，男，碩士，藥師，主要從事植物有效成分方面的研究，E-mail:jycuizan@hotmail.com。

*

郭斌(1969-)，男，博士，教授，主要從事天然產(chǎn)物有效成分方面的研究，E-mail:lyguobin@hotmail.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81302681)；國(guó)家科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目(14C26242100741)；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201510160000004；201510160000016)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)22-0167-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.033