,, , , ,,*

(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023;2.嘉必優(yōu)生物工程(武漢)有限公司,湖北武漢 430073；3.中國科學院武漢病毒研究所,湖北武漢 430071)

化學添加劑對裂壺藻突變株發(fā)酵產DHA的影響

林源鋒1,謝鑫磊1,付杰2,田華1,陳濤3,何東平1,*

(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023;2.嘉必優(yōu)生物工程(武漢)有限公司,湖北武漢 430073；3.中國科學院武漢病毒研究所,湖北武漢 430071)

為了研究外源化學添加劑對裂壺藻(Schizochytriumlimacinum)突變株發(fā)酵合成脂肪酸(SFAs、PUFAs和DHA)的影響,采用基于氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用技術分析裂壺藻突變株產油脂肪酸的組成。通過單因素和正交實驗設計,優(yōu)化了乙醇胺(ETA)、萘氧乙酸(BNOA)和水楊酸(SA)三種化學添加劑的最佳添加條件。結果表明,添加150 mg/L的乙醇胺(ETA)、10 mg/L萘氧乙酸(BNOA)和1 mg/L水楊酸(SA),裂壺藻突變株的DHA產量最高,達到6.18 g/L,比對照組提高了12.77%。綜上所述,添加適量的化學添加劑可以提高裂壺藻突變株DHA的含量。

裂壺藻突變株,化學添加劑,GC-MS,DHA

裂壺藻(Schizochytriumlimacinum,又稱裂殖壺菌)屬于真菌門、網粘菌綱、破囊壺菌目、破囊壺菌科的單細胞海洋微藻,是繼寇氏隱甲藻之后已報道的一種極具實現工業(yè)化生產DHA的海洋微藻[1-3]。目前,大多數企業(yè)都是利用裂壺藻發(fā)酵來制備DHA,由于其體積小,生長繁殖快,不受季節(jié)影響,生產周期短,油脂產量高等優(yōu)點[4]已成為了近年來研究的熱點。

二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid)簡稱DHA,是維持大腦和視力正常功能所必需的脂肪酸,人體內合成極少,需要從食物中補充,在促進腦細胞生長發(fā)育和預防心腦血管疾病等方面具有顯著功效[5-6]。雖然DHA的主要來源為深海魚油,但是深海魚油所產DHA的產量和品質都難以滿足現有的需求[7-8]。藻油中的含量遠遠高于魚油中的DHA含量,并且藻油DHA產品已于2010年被中國衛(wèi)生部批準用于嬰幼兒配方食品及其它多種食品中[9]。DHA對于嬰幼兒大腦的健康發(fā)育極其重要,嬰幼兒可以通過母乳獲得也可以通過含DHA的奶粉等食物獲得,DHA產品一直是兒童營養(yǎng)品的研究熱點[10]。另外,DHA還具有預防老年癡呆[11],提高人體免疫力、延緩衰老[12]、以及消炎、抗癌和預防精神疾病等作用。

研究表明,除了優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組分及數量可以提高不飽和脂肪酸含量,化學添加劑也可以增加裂壺藻的脂質積累。王申強等[13]同時添加生物素、蘋果酸和洛伐他汀能夠顯著提高DHA的產量,最高產量達到11.55 g/L,相比對照組提高了71.87%;周立樹等[14]將五種維生素以最合適的濃度同時添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)現DHA產量與對照組相比提高了53.8%,遠高于添加單一維生素的效果;任路靜等[15]研究發(fā)現添加淺藍菌素有利于DHA及不飽和脂肪酸含量的提高,當添加淺藍菌素0.1 mg/L時,DHA占細胞干質量分數可達12.2%;馮云等[16]考察了40 g/L谷氨酸鈉條件下培養(yǎng)菌種,發(fā)酵后DHA質量分數達到53.25%。本實驗選用實驗室保藏的裂壺藻突變株,在裂壺藻突變株發(fā)酵對數期添加乙醇胺(ETA)、萘氧乙酸(BNOA)和水楊酸(SA),首先進行單因素篩選,得到最佳濃度。在此基礎上通過正交實驗,篩選出最佳配方,本文旨在為DHA的發(fā)酵調控提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

裂壺藻ATCC20888 由廣東微生物菌種保藏中心提供,經過等離子誘變獲得的裂壺藻突變株15k-160s-2-3,本實驗室保藏;葡萄糖 天津博迪化工股份有限公司;氯化鈉 國藥集團化學試劑有限公司;磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣 天津市凱通化學試劑有限公司;碳酸氫鈉、氯化鉀 天津市廣成化學試劑有限公司;酵母膏 北京奧博星生物技術有限責任公司;谷氨酸鈉 上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;纖維素酶(10～140萬U/g)、堿性蛋白酶(20萬U/g) 江蘇銳陽生物科技有限公司;所用試劑 均為分析純;乙醇胺(ETA)、萘氧乙酸(BNOA)和水楊酸(SA)，萘氧乙酸和水楊酸溶解于乙醇,乙醇胺溶解于雙蒸水,三種試劑使用前均過濾除菌 山東西亞化學股份有限公司;固體培養(yǎng)基 葡萄糖5%、谷氨酸鈉3%、酵母膏0.6%、氯化鈉0.8%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.6%、氯化鈣0.05%、碳酸氫鈉0.02%、硫酸銨0.2%、金屬離子混合液、維生素混合液、瓊脂2%,pH6.5,115 ℃、30 min;種子培養(yǎng)液 葡萄糖8.5%、谷氨酸鈉6.5%、酵母膏0.6%、氯化鈉2.0%、磷酸二氫鉀0.65%、硫酸鎂2.2%、氯化鈣0.03%、碳酸氫鈉0.03%、硫酸鈉0.03%、金屬離子混合液、維生素混合液,pH6.5,115 ℃、30 min;發(fā)酵培養(yǎng)液 葡萄糖7.5%、谷氨酸鈉1.5%、酵母膏1.1%、氯化鈉0.2%、磷酸二氫鉀0.5%、硫酸鎂0.6%、氯化鈣0.06%、碳酸氫鈉0.06%、氯化鉀0.04%、金屬離子混合液、維生素混合液,pH6.5,115 ℃、30 min。

LDZX-75KB型立式蒸汽滅菌器 武漢利天科技儀器有限公司;SPX-150C型恒溫恒濕箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;TDL-5-A型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;HYQ-150S型恒溫搖床 武漢匯誠生物科技有限公司;GZX-9070MBE型電熱鼓風干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;RE-52C型旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;Agilent 7890A型氣相色譜質譜儀 安捷倫科技(中國)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

1.2.1.1 藻種活化 將本實驗室保藏的裂壺藻突變株轉接于固體培養(yǎng)基,于26 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d,挑取生長較好的單菌落轉接于固體斜面培養(yǎng)基,26 ℃條件下培養(yǎng)3 d進行活化。

1.2.1.2 一級種子 用接種環(huán)從固體斜面培養(yǎng)基挑取活化的藻種接入裝有50 mL種子培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中,置于搖床上,在26 ℃,180 r/min條件下培養(yǎng)48 h。

1.2.1.3 二級種子 取5 mL的一級種子,接入裝有100 mL種子培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中,置于搖床上,在26 ℃,180 r/min條件下培養(yǎng)48 h。

1.2.1.4 發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液按照10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)液中,在26 ℃、180 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)120 h,得到裂壺藻發(fā)酵培養(yǎng)液,待后續(xù)使用。

1.2.2 化學添加劑的添加 取0.1 g萘氧乙酸溶于10 mL 50%乙醇,制得母液,經過濾除菌后備用;取0.1 g水楊酸溶于10 mL 50%乙醇,制得母液,經過濾除菌后備用;取1 mL乙醇胺溶于9 mL雙蒸水經過濾除菌后備用。槍頭滅菌,裂壺藻發(fā)酵培養(yǎng)48 h后用移液槍分別吸取不同質量濃度的三種化學添加劑加入裂壺藻發(fā)酵培養(yǎng)液中搖瓶發(fā)酵72 h。

1.2.3 油脂提取及產量測定

1.2.3.1 油脂的提取 收集裂壺藻發(fā)酵培養(yǎng)液在5000 r/min的條件下離心10 min,離心兩次,去除上清液,將離心得到的藻泥與水按料液比1∶1 (g/mL)混合均勻,置于恒溫磁力攪拌器中,溫度55 ℃下攪拌。按發(fā)酵液的0.5%和0.025%分別加入堿性蛋白酶和纖維素酶,酶解6～8 h,真空冷凍干燥至質量恒定,研磨成藻粉。利用索氏抽提法用乙醚抽提至藻粉無色,旋轉蒸發(fā)殘留溶劑,得到藻油,置于烘箱干燥至兩次質量變化<0.2 mg,計算油脂產量。

1.2.3.2 油脂產量 計算公式如下:

1.2.4 脂肪酸甲酯化處理和DHA測定方法

1.2.4.1 脂肪酸甲酯化處理 精密稱取0.2 g藻油于20 mL試管中,加入0.5 mol/L的NaOH-甲醇溶液3 mL,60 ℃水浴加熱,直至油樣完全溶解(約30 min),冷卻后加入25%的BF3-甲醇溶液2 mL,60 ℃水浴酯化20 min。冷卻后加入3 mL正己烷(色譜純)并振蕩,再加入2 mL飽和NaCl溶液并振蕩。靜置30 min后取上層有機相于一只干燥試管中,并加入少量無水硫酸鈉以去除微量水分,經氣相色譜質譜分析得到DHA相對含量,相對含量以峰面積百分比表示。

1.2.4.2 DHA產量 計算公式如下:

DHA產量(g/L)=油脂產量(g/L)×DHA含量(%)

1.2.5色譜條件 選用Agilent SP-2560色譜柱(100 m×25 μm,0.2 μm);升溫程序:初始溫度100 ℃,保持4 min,然后以3 ℃/min升溫至230 ℃,保持20 min,載氣(N2)流速25 mL/min,壓力2.4 kPa,進樣量1 μL;分流比30∶1。

1.2.6 質譜條件 電子轟擊(EI)離子源;電離能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;接口溫度250 ℃;全掃描模式,質量掃描范圍m/z 50～500。

表2 乙醇胺質量濃度對裂壺藻突變株脂肪酸分布的影響

1.3實驗設計

1.3.1 單因素實驗 分別考察乙醇胺、萘氧乙酸、水楊酸對DHA含量的影響。乙醇胺加入的質量濃度分別為50、100、150、200、300 mg/L;萘氧乙酸加入的質量濃度(mg/L)分別為4、6、8、10、15;水楊酸加入的質量濃度(mg/L)分別為0.2、0.5、1、1.5、2。每組實驗重復3次,取平均值。

1.3.2 正交實驗設計 通過單因素實驗表明,分別在裂壺藻突變株發(fā)酵期添加乙醇胺、萘氧乙酸和水楊酸都能提高裂壺藻突變株合成DHA的能力。在單因素的基礎上,以乙醇胺、萘氧乙酸和水楊酸的質量濃度為因素采用L9(34)正交表,設計3因素3水平正交實驗,正交實驗因素和水平見表1。

表1 正交實驗因素水平

1.4數據處理

利用GC-MS分析,通過化學工作站G1701BA的數據處理系統(tǒng),利用Nist11標準質譜庫檢索鑒定成分,按面積歸一化法進行定量分析,測得其相對百分含量。

2 結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1 乙醇胺質量濃度對藻油DHA的影響 乙醇胺是膜脂的重要組成成分,在磷脂酰合成酶的作用下,合成膜脂中重要的二磷酸甘油酯之一的磷脂酰乙醇胺,有研究表明乙醇胺可以提高斜生柵藻的脂質積累量[17]。由表2可以看出,添加乙醇胺后可以有效地提高DHA(C22∶6)占藻油中總脂肪酸的量,而且會導致裂壺藻突變株自身飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量發(fā)生變化,其中飽和脂肪酸棕櫚酸(C16∶0)的含量由23.40%±0.97%降低至18.69%±0.84%;在添加150 mg/L的乙醇胺后,不飽和脂肪酸DHA在總脂肪酸中的含量從41.59%±0.53%升高到48.58%±0.39%,比對照組提高了16.81%。繼續(xù)添加外源乙醇胺后,DHA的含量開始減少,在添加300 mg/L的乙醇胺時,DHA的含量降至45.61%±0.32%,這說明添加適量的乙醇胺有利于裂壺藻突變株DHA的合成。

在添加乙醇胺后,短鏈不飽和脂肪酸棕櫚酸的含量有所降低,與對照組相比,DHA的含量明顯增加,在150 mg/L的最適濃度下達到最高,可能是脂肪酸合成途徑受乙醇胺的影響,迫使細胞合成更多的不飽和脂肪酸以維持細胞生長。

2.1.2 萘氧乙酸質量濃度對藻油脂肪酸構成的影響 萘氧乙酸是具有生長素生物活性的生長調節(jié)劑,可以促進細胞的生長和代謝[18]。添加外源萘氧乙酸對裂壺藻突變株發(fā)酵產DHA的影響如表3所示,添加外源萘氧乙酸后可以增加藻油脂質積累量,提高DHA(C22∶6)含量,而降低飽和脂肪酸含量。在添加10 mg/L的萘氧乙酸后,DHA占油脂含量由41.10%±0.11%提高到47.48%±0.46%,比對照組提高了15.52%。飽和脂肪酸棕櫚酸含量降低至22.87%±0.19%,比對照組降低了11.59%。在添加10 mg/L萘氧乙酸時,DHA含量達到最高,而棕櫚酸含量最低。說明添加適量的外源萘氧乙酸有利于菌株不飽和脂肪酸的合成(包括DHA),這種促進作用可能在多條途徑上影響DHA生物合成,具體影響機理還需進一步研究。

表3 萘氧乙酸質量濃度對裂壺藻突變株脂肪酸分布的影響

表4 水楊酸質量濃度對裂壺藻突變株脂肪酸分布的影響

2.1.3 水楊酸質量濃度對藻油DHA的影響 外源水楊酸是誘導植物形成系統(tǒng)獲得抗性必不可少的信號分子,誘導相關抗氧化酶基因的表達,提高相關抗氧化酶的活性,對細胞的代謝過程起到調控作用[19]。由表4可知,當添加0.2 mg/L的外源水楊酸時,棕櫚酸(C16∶0)由26.83%±0.17%下降至23.74%±0.14%并且呈下降趨勢,但DPA(C22∶5)和DHA的含量由15.47%±0.25%和40.59%±0.23%分別升高到17.02%±0.27%和43.40%±0.19%,表明外源水楊酸對不飽和脂肪酸的積累有適當的刺激作用。

當添加水楊酸的質量濃度為0.5 mg/L時,DHA占細胞干質量分數為47.87%±0.25%,相比對照組提高了17.94%。而當外源水楊酸的質量濃度進一步升高時,DHA含量逐漸下降,這說明高濃度的外源水楊酸對菌株積累DHA合成不利?？赡苁怯捎诟邼舛鹊乃畻钏嵋种屏思毎纳L代謝,甚至死亡。

2.2正交實驗結果與分析

在單因素的基礎上,設計L9(34)正交實驗,結果見表5。

通過正交實驗分析發(fā)現,對于油脂產量來說,A1,A2相差不大,對于DHA產量來說,A是最主要的影響因素,故選取A2作為該因素的優(yōu)水平;對于油脂產量,取C2最好,但是C2,C3相差不大,而且C因素是較次要因素,而對于DHA產量來說,取C3最好,所以選取C3為該因素的優(yōu)水平;綜合以上分析,優(yōu)方案為A2C3B2,即乙醇胺質量濃度為150 mg/L,水楊酸質量濃度為1 mg/L,萘氧乙酸質量濃度為10 mg/L。在此條件下油脂產量和DHA產量分別達到11.40 g/L和6.18 g/L，相比于對照組DHA產量提高了12.77%。

2.3脂肪酸分析

利用正交實驗設計的最佳添加濃度對裂壺藻進行發(fā)酵驗證實驗,藻油主要脂肪酸組成見表6。

表6 主要脂肪酸組成結果

3 結論

本文運用單因素實驗考察了3種外源化學添加劑對裂壺藻突變株發(fā)酵合成脂肪酸的影響,得出通過添加適量的化學調節(jié)劑可以促進裂壺藻突變株合成DHA。然后設計正交實驗,得到化學添加劑的最佳質量濃度(mg/L)為:乙醇胺150,萘氧乙酸10,水楊酸1。在此條件下,油脂產量為11.40 g/L,DHA產量為6.18 g/L,優(yōu)化后的DHA產量比對照組提高了12.77%。此外,本文為DHA的發(fā)酵調控提供了新的思路,可適當使用外源化學添加劑來提高DHA產量,但考慮到成本,后期可繼續(xù)拓寬調控思路,開發(fā)更為廉價的調控方法。

表5 正交實驗結果與分析

[1]魏萍,馬小琛,任路靜,等. 裂殖壺菌發(fā)酵生產DHA研究進展[J]. 食品工業(yè)科技,2010(10):398-401,404.

[2]Ren Lu-Jing,Sun Guan-nan,Ji Xiao-jun,et al. Compositional shift in lipid fractions during lipid accumulation and turnover inSchizochytrium[J]. Bioresource Technology,2014:107-113.

[3]謝辰. 裂殖弧菌高產DHA的發(fā)酵技術研究[D]. 武漢:華中科技大學,2012.

[4]夏小樂,楊海麟,王武,等. 碳氫比對Schizochytriumsp.JN-3發(fā)酵產DHA的影響及其中試研究[J].安徽農業(yè)科學,2011,39(36):22201-22203.

[5]Lauritzen L,Hansen H S,Jorgensen M H,et al. The essentiality of long chain n-3 fatty acids in relation to development and function of the brain and retina[J].Progress in Lipid Research,2001,40(1-2):1-94.

[6]Nordoy A,Marchioli R,Arnesen H,et al. n-3 Polyunsaturated fatty acids and cardiovascular diseases[J].Lipids,2001,36:127-129.

[7]朱路英,張學成,王淑芳,等. 一種海洋真菌——裂壺藻突變株的營養(yǎng)成分分析[J].食品科學,2009,30(24):272-275.

[8]Gro van der Meeren,Michael F,Tlusty,et al. Effects of dietary DHA and EPA on neurogenesis,growth,and survival of juvenile American lobster,Homarus americanus[J].New Zealand Journal of Marine and Freshwater Research,2009,43(1):225-232.

[9]中華人民共和國衛(wèi)生部.關于批準DHA藻油、棉籽低糖等7種物品為新資源食品及相關規(guī)定的公告(2010年第3號)[Z].2010

[10]SIJTSMA L,SWAAF M E. Biotechnological production and applications of the ω-3 polyunsaturated fatty acid docosahexaenoic acid[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2004,64(2):146-153.

[11]Morley R. Nutrition and cognitive development[J]. Nutrition,1997,53(1):752-754.

[12]Kim YJ,Chung HY. Antioxidative and anti-inflammatory actions of docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid in renal epithelial cells and macrophages[J]. J Med Food,2007,10(2):225-231.

[13]王申強,羅瑋,姜易彤,等. 外源添加劑促進裂殖壺菌合成DHA[J]. 生物加工過程,2013(5):21-25.

[14]周立樹,沈健增,蔡宇杰,等. 維生素對裂殖壺菌發(fā)酵產DHA的影響[J]. 食品與生物技術學報,2013(9):927-932.

[15]任路靜,魏萍,馮云,等. 添加生物素和淺藍菌素對裂殖壺菌發(fā)酵產DHA的影響[J]. 生物加工過程,2012,1:42-45.

[16]馮云,任路靜,瞿亮,等. 種子培養(yǎng)基成分對裂殖壺菌發(fā)酵產DHA的影響[J]. 生物加工過程,2013,5:26-31.

[17]Cheng J S,Niu Y H,Lu S H,et al. Metabolome analysis reveals ethanolamine as potential marker for improving lipid accumulation of model photosynthetic organisms[J]. Chem Technol Biotechnol,87(10):1409-1418.

[18]夏贊成,蘇嬌蓮,鄧繼勇,等. 植物生長調節(jié)劑萘氧乙酸的合成工藝研究[J]. 遼寧化工,2002,11:463-464,478.

[19]韓艷,韓晨光,崔榮華,等. 外源水楊酸對UV-B增強下花生葉片光合特性的影響[J]. 中國農業(yè)氣象,2016(4):437-444.

EffectofchemicalmodulatorsonDHAproductionbyfermentationofSchizochytriumlimacinummutantstrain

LINYuan-feng1,XIEXin-lei1,FUJie2,TIANHua1,CHENTao3,HEDong-ping1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China;2.CABIO Bioengineering(Wuhan)Co.,Ltd.,Wuhan 430073,China;3.Wuhan Institute of Virus,Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430071,China)

In order to investigate the effects of chemical modulators on the synthesis of fatty acids(SFAs,PUFAs and DHA)inSchizochytriumlimacinummutant strain,the composition of fatty acids inSchizochytriumlimacinummutant strain was analyzed by chromatography-mass spectrometry(GC-MS). The optimum addition conditions of three chemical modulators,ethanolamine(ETA),naphthalene acetic acid(BNOA)and salicylic acid(SA)were optimized by single factor and orthogonal design. The results showed that the adding ethanol amine 150 mg/L(ETA),10 mg/L naphthoxyacetic acid(BNOA)and 1 mg/L salicylic acid(SA),the DHA production ofSchizochytriumlimacinummutant strain was the highest,reaching 6.18 g/L,which was 12.77% higher than control group. It was suggested that the adding appropriate amount of chemical modulators could improve DHA content ofSchizochytriumlimacinummutant strain.

Schizochytriumlimacinummutant strain;chemical modulators;GC-MS;DHA

2017-04-28

林源鋒(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：微生物油脂，E-mail：yfLin33@qq.com。

*

何東平(1957-)，男，博士，教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白，E-mail：hedp123456@163.com。

國家糧食局糧食公益性行業(yè)科研專項(201313012-03)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)22-0125-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.025