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(石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000)

冷水魚腸道乳酸菌的遺傳差異分析

黃麗麗,羅寶龍,倪永清,張艷,周紅*

(石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000)

為分析新疆額爾齊斯河流域及黑龍江流域冷水魚腸道中乳酸菌遺傳差異,為乳酸菌資源的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。本實驗利用MRS、Elliker、M17培養(yǎng)基對冷水魚腸道中低溫乳酸菌進行分離鑒定,并測定其最適生長溫度。根據(jù)16S rRNA基因序列初步確定低溫乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,并利用rep-PCR指紋圖譜技術(shù)進一步區(qū)分高度同源性菌株。從冷水魚的腸道中分離得到134 株低溫乳酸菌,其最適生長溫度在15～24 ℃之間。16S rRNA測序結(jié)果表明,這些菌株分別隸屬于Lactobacillus、Lactococcus、Enterococcus、Streptococcus、Leuconostoc、Weissella、Carnobacterium7個屬,19 個種,其中Lactobacillus為優(yōu)勢菌。Rep-PCR指紋圖譜分析表明同一屬的乳酸菌在種水平及同一種的不同菌株之間存在不同程度的遺傳差異。

冷水魚腸道,低溫乳酸菌,指紋圖譜

乳酸菌廣泛存在于自然界中,且種類繁多,生存于不同區(qū)域、不同生境的乳酸菌也各有所異。據(jù)報道在乳制品、腌制泡菜、發(fā)酵肉制品及人類和動物腸道內(nèi)都存在著各種各樣的乳酸菌[1-4],包括乳桿菌、明串珠菌、魏斯氏和腸球菌等在內(nèi),目前發(fā)現(xiàn)的乳酸菌約有41 個屬,320 個種[5]。乳酸菌被認(rèn)為是重要的微生物資源,其功能特征一直都是科學(xué)界關(guān)注的熱點[6]?，F(xiàn)有研究顯示,以乳酸菌為代表的益生菌代謝產(chǎn)生細菌素等活性物質(zhì)[7-8],能安全、有效地抑制食品中腐敗菌及病原菌的生長[9-11],以保持食品的營養(yǎng)價值[1,10,12],可作為天然的生物防腐劑直接應(yīng)用于食品工業(yè)中[2,13]。乳酸菌通常耐酸且嗜酸,可在較低的pH環(huán)境下生長,能耐受脊椎動物和魚類胃腸道的酸性環(huán)境[5]。因而,益生乳酸菌也常添加于動物飼料中作為一種活性微生態(tài)制劑,不僅能通過拮抗病原菌以維持水產(chǎn)動物腸道微生態(tài)平衡,促進動物的健康生長,而且能提高動物的免疫力和生產(chǎn)性能[14]。

許多外界的微生物(如魚類所生活的水體環(huán)境中的微生物)通過魚類攝食而定植于魚腸道內(nèi),從而構(gòu)成了復(fù)雜的腸道微生態(tài)系統(tǒng)[15]。冷水魚常年生活在水溫較低(15～20 ℃)的環(huán)境中,其腸道內(nèi)形成了獨特的低溫環(huán)境,為低溫菌提供了良好的生存保障。低溫環(huán)境下的乳酸菌因生長溫度相對較低,被稱為低溫乳酸菌。低溫乳酸菌是一類特殊益生資源,其在0 ℃也可以生長[16]。目前國外有關(guān)低溫乳酸菌的研究主要集中在泡菜、低溫冷藏海鮮產(chǎn)品和肉制品[17-19]中,而國內(nèi)關(guān)于低溫乳酸菌的研究并不多見。近年來不少學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在低溫發(fā)酵的泡菜(sikhae和kimchi)中,乳酸菌是主要的優(yōu)勢微生物,其生長代謝的生物活性物質(zhì),能抑制食源性腐敗菌的生長,進而維持泡菜風(fēng)味以延長食品的保質(zhì)期[17]。Matamoro等利用從海產(chǎn)品中分離所得的低溫乳酸菌進行抑菌實驗,發(fā)現(xiàn)其對李斯特菌、葡萄球菌、假單胞菌、沙雷菌等病原菌有不同程度的抑制作用,這對于海產(chǎn)品在低溫條件下貯藏具有重大意義[19]。近來發(fā)現(xiàn),冷凍肉制品在真空或微氧的低溫下包裝后,體系中的微生物會慢慢地向CO2耐受型群系發(fā)展,占主導(dǎo)地位的群體是乳酸菌(主要包括乳桿菌[20]和明串珠菌[21]),乳酸菌的增長會延長冷藏肉制品貨架期。

低溫乳酸菌在提高食品風(fēng)味及食品生物防腐保鮮方面極具潛力,有著更為廣泛的應(yīng)用前景,但其并未得到充分的開發(fā)和研究。本研究主要是以生長在新疆額爾齊斯河流域和黑龍江流域的野生冷水魚為實驗對象,從冷水魚腸道中分離篩選低溫乳酸菌,對低溫乳酸菌的遺傳差異進行研究,為低溫乳酸菌的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料與儀器

樣品 2014 年7月采集新疆阿勒泰地區(qū)額爾齊斯河流域(水溫16～20 ℃,47°00′～49°10′ N,85°31′～90°31′ E)冷水魚:東方歐鳊Abramisbramaorientalis(OB),高白鮭Coregonuspeled(GB),河鱸Percafluviatilis(HL),喬爾泰Esoxlucius(QE),丁鮭Tincaeus(DG),及同緯度黑龍江流域(水溫13～18 ℃43°06′～48°17′ N,129°10′～137°53′ E)冷水魚:鱖魚Sinipercachuatsi(GY),黑斑狗魚Esoxreicherti(HB),大馬哈魚Oncorhynchusketa(MH),細鱗魚Brachymystaxlenok(XL),紅尾魚Rasboraborapetensis(HW),每種魚2～3 條,體重1.5～2.8 kg,年齡約3 年,標(biāo)記后置于4 ℃冰箱內(nèi)冷藏,12 h內(nèi)運回實驗室；瓊脂糖 美國BBI公司;MRS、Elliker、M17培養(yǎng)基 海博生物技術(shù)有限公司。

PCR儀 德國Biometra公司;凝膠成像儀 BioRad公司。

1.2實驗方法

1.2.1 樣品前處理 首先用75% 的酒精對冷水魚樣品進行漂洗,然后在超凈工作臺上解剖(解剖器具經(jīng)過滅菌處理)冷水魚樣品,完整地取出其腸道,并用75%酒精漂洗腸道外表面,待酒精晾干后,獲取腸道內(nèi)容物及粘膜,并置于離心管中,4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株的分離 取1 g魚腸道內(nèi)容物和粘膜樣品加入100 mL無菌生理鹽水中,16 ℃恒溫搖床上振蕩24 h,使腸道樣品充分散。取100 μL 菌懸液置于900 μL無菌水中,混勻后進行梯度的稀釋,然后選取10-3～10-7等梯度的懸液100 μL均勻涂布于MRS、Elliker、M17培養(yǎng)基上,16 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d。

1.2.3 菌株DNA提取 根據(jù)Juste等人改良后的CTAB[22]法提取單菌落DNA,經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后置于-20 ℃保存。

1.3菌株最適生長溫度的測定

初篩菌株按2%的量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,分別置于4、10、15、18、21、24、30、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h,隨后在600 nm 測定其OD 值。

1.416SrRNA基因PCR擴增及其系統(tǒng)發(fā)育分析

采用細菌16S rRNA基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增,反應(yīng)體系:2×Taq MasterMix 12.5 μL,引物各0.5 μL(0.4 μM/mL),菌株DNA 2 μL,補充ddH2O至25 μL。擴增條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性1 min,56 ℃退火1 min;72 ℃延伸1 min 30 s,30個循環(huán),最終72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后,送上海生工公司測序,將測序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中進行序列同源性對比(BLAST),得到同源性高的菌株序列。用CLUSTAL X 1.83軟件將序列排列對齊,鄰接法neighbor-joining method計算進化距離,進化樹分支穩(wěn)定性分析采用p-distences和Kimura-2parameter雙參數(shù)法,并用Bootstrap檢驗1000 次。

1.5rep-PCR指紋圖譜分析

使用引物(GTG)5(5′-GTGGTGGTGGTGGTG-3′)進行PCR擴增。擴增條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,40 ℃退火30 s,65 ℃延伸8 min,循環(huán)30 次,最后65 ℃延伸16 min。擴增產(chǎn)物在1.4%瓊脂糖凝膠、80 V下電泳2 h 50 min后置于凝膠成像系統(tǒng)下拍照,用GelCompar Ⅱ軟件依據(jù)UPGMA進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1低溫乳酸菌的篩選

從冷水魚腸道中共分離得到純培養(yǎng)物206株,根據(jù)其菌落大小、形態(tài)、顏色等特征以及革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗進行初篩,初步確定134株疑似乳酸菌。如表1部分低溫乳酸菌的最適生長溫度測定結(jié)果顯示,其生長溫度范圍在4～37 ℃之間,最適生長溫度為15～24 ℃,屬于低溫菌范疇。

2.2菌種鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育

表1 從冷水魚腸道中篩選的部分低溫乳酸菌的特征

注:*表示最適生長溫度。將測得的菌株序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的16S rRNA基因序列進行同源性比對,被歸屬到種水平菌株的序列相似度均在98%以上(表1)。

134 株低溫乳酸菌,隸屬于Lactobacillus、Lactococcus、Enterococcus、Streptococcus、Leuconostoc、Weissella、Carnobacterium7個屬?；?6S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。Enterococcus包括菌株E-DG-5,E-DG-1,E-GB-4,M-HL-1,M17-GB-8,M17-GB-2,M-GB-3,分別與已知種Enterococcusthailandicus,Enterococcusduurans,Enterococcusfaecium,Enterococcushermanniensis,Enterococcusrivorum與Enterococcusfaecalis構(gòu)成小分支。M-XL-4,E-GY-4,E-GY-6與Carnobacteriummaltaromaticum的序列同源性為99%,M17-HW-3,E-QE-3,E-HB-5,M17-OB-2劃為一個分支,隸屬于Carnobacteriumdivergens。M-GB-4,M-XL-3,M-XL-2,M-MH-8，E-MH-9均屬于Lactococcus屬,分別與已知種Lactococcuslactis,Lactococcusgarvieas,Lactococcusraffinolactis,Lactococcuspiscium的16SrRNA基因序列相似性達到99%。E-DG-6,M-DG-4,M17-QE-1,M-GB-1,M-QE-7,M-HL-4,M-OB-9與Lactobacillussakei的相似度達到99%。M-GY-5,M-GY-3均屬于Weissella屬,E-HL-4,M17-HL-3兩株菌分別隸屬于Leuconostoc,Streptococcus2個不同的屬,形成了單獨的分支。

2.3基于rep-PCR低溫乳酸菌的指紋圖譜分析

圖2可知,乳桿菌被劃分為9 個群:群Ⅰ～Ⅸ以及一些小分支。Lactobacillussakei主要在Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ群中,共33 株,占Lactobacillus的61%,Lactobacillusplantarum在Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ、Ⅸ群中,占29%。如圖3所示,Carnobacterium被分成6 個群:群Ⅰ～Ⅵ。其中C.maltaromaticum最多,主要集中在Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ群,占Carnobacterium的54%。由圖4可知,腸球菌中共25 株,分為5 個群。Enterococcusfaecium12株,分布在Ⅰ～Ⅴ群中,占Enterococcus的48%,而Enterococcusfaecalis有6株,其余Enterococcus種比例較少。圖5中,Lactococcus、Leuconostoc、Weissella、Streptococcus的聚類圖分為Ⅰ、Ⅱ群以及2個小分支和4個單獨的分支。Lactococcus主要分布在Ⅰ群的2 個小分支中,Lactococcusgarvieas有5 株,占Lactococcus的50%,Leuconostocgelidum主要在Ⅱ群,而Weissella、Streptococcus各有兩株。

圖2 Lactobacillus指紋圖譜聚類分析圖

圖3 Carnobacterium指紋圖譜聚類分析圖

圖4 Enterococcus指紋圖譜聚類分析圖

圖5 Lactococcus、Leuconostoc、Weissella、Streptococcus指紋圖譜聚類分析圖

通過凝膠電泳檢測,Rep-PCR指紋圖譜的條帶在500～5000 bp之間。盡管指紋圖譜產(chǎn)生的條帶帶型較多,但是不同的乳酸菌帶型有所不同,進而能夠比較分析不同菌株在種水平上的差異。其中,Lactobacillusplantarum的條帶以6～12為主,從同一類冷水魚腸道中分離出Lactobacillussakei的帶型相似,圖2 Ⅶ群中黑斑狗魚和細鱗魚聚類在一起,兩者都是鮭形目,但細鱗魚腸道中Lactobacillusplantarum帶型與Lactobacillussakei的帶型相差較大,被聚類到不同的群中。圖3 Ⅲ群中大馬哈魚和鱖魚是不同種類的魚,這兩種魚腸道中Carnobacteriummaltaromaticum帶型不同。圖4 Ⅲ群,大馬哈魚和高白鮭是來自不同流域的冷水魚,從其腸道中篩選的Enterococcusfaecium也存在差異。

乳酸菌廣泛存在于不同的生境中,遺傳多樣性極其豐富。本實驗中依據(jù)低溫乳酸菌的rep-PCR指紋圖譜發(fā)現(xiàn),同一種乳酸菌的指紋圖譜存在一些特征性的條帶,如此可以將不同種類的乳酸菌鑒別出來。從冷水魚腸道中乳酸菌多樣性方面揭示了魚腸道中存在著不同類群的細菌,不同種類、不同流域的冷水魚腸道中乳酸菌多樣性存在差異,這可能是由于魚的生活環(huán)境及習(xí)性等因素影響,乳酸菌形成不同的生態(tài)位,造就了這種差異。

2.4魚腸道內(nèi)低溫乳酸菌的多樣性分析

樣品的Chao1指數(shù)和Simpson、Shannon指數(shù)用來評估物種豐度和多樣性。由表2可知,大馬哈魚和細鱗魚腸道中乳酸菌的多樣性較復(fù)雜,大馬哈魚腸道中乳酸菌種類最為豐富,鑒定出9種乳酸菌,細鱗魚和黑斑狗魚腸道中次之,鑒定出8種乳酸菌,喬爾泰和丁鮭腸道中只鑒定出3種乳酸菌。圖6所示,同種類的冷水魚腸道乳酸菌多樣性比較相似,紅尾魚和東方歐鳊,河鱸和鱖魚,細鱗魚和黑斑狗魚各自聚在一個分支,但白斑狗魚,丁鮭,高白鮭和大馬哈魚例外,這可能表明它們腸道中乳酸菌的多樣性受眾多因素的影響。10種樣品中共鑒定出乳酸菌19個種:Lactobacillussakei、Lb.plantarum、Lactococcuslactis、L.garvieas、L.raffinolactis、L.piscium、Leuconostocgelidum、Strepotococcusparauberis、Weissellakoreensis、W.cibaria、Enterococcusthailandicus、E.duurans、E.faecium、E.hermanniensis、E.rivorum、E.faecalis、Carnobacteriummaltaromaticum、C.divergens。在樣品中L.Sakei豐富度最高,其次是Lb.plantarum和C.maltaromaticum,它們普遍存在于在大多數(shù)冷水魚腸道中。

圖6 樣品菌種聚類分析圖

表2 樣品乳酸菌的多樣性

3 結(jié)論

剛孵化魚仔的胃腸道一般是無菌的,隨著魚類的生長發(fā)育,通過攝食或接觸環(huán)境逐漸形成了一個由好氧菌和厭氧菌組成的菌群,是一個十分復(fù)雜而又處于動態(tài)平衡的微生態(tài)系統(tǒng)[15,23-24]。我國新疆額爾齊斯河流域、黑龍江流域處于45 °N以上的中高緯度地區(qū),屬于寒溫帶氣候,其高海拔、高緯度、低氣溫的特點使其湖泊、河流中棲居著豐富的冷水魚,為乳酸菌提供了理想的棲息環(huán)境。本文采用3 種不同培養(yǎng)基從10 種冷水魚腸道中分離出了134 株低溫乳酸菌。通過16S rRNA基因序列分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示所有乳酸菌被劃為7 個屬,如Lactobacillus、Lactococcus、Enterococcus、Streptococcus、Leuconostoc、Weissella、Carnobacterium,其中Lactobacillus為優(yōu)勢屬。本實驗中依據(jù)低溫乳酸菌的rep-PCR指紋圖譜發(fā)現(xiàn),同一種乳酸菌的指紋圖譜存在一些特征性的條帶,如此可以將不同種類的乳酸菌鑒別出來。從冷水魚腸道中乳酸菌多樣性方面揭示了魚腸道中存在著不同類群的細菌,不同種類、不同流域的冷水魚腸道中乳酸菌多樣性存在差異,這可能是由于魚的生活環(huán)境及習(xí)性等因素影響,乳酸菌形成不同的生態(tài)位,造就了這種差異。在指紋圖譜聚類中,盡管某些種群中存在一定的交叉情況,但主要種群的菌株都能聚在一起,不同種的乳酸菌株條帶有所不同,表現(xiàn)出了差異性。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種類、不同流域的冷水魚,其腸道乳酸菌的指紋圖譜存在差異。由于rep-PCR指紋圖譜技術(shù)在實驗過程中對DNA、PCR體系及PCR儀等要求嚴(yán)格,可重復(fù)性差,近年來許多研究應(yīng)用分子生態(tài)學(xué)方法鑒定低溫乳酸菌,如高通量測序技術(shù)(NGS)能夠更加快速、準(zhǔn)確的分析和鑒定菌群[25-26],提高了對樣品中微生物菌群分析的深度和廣度,特別是一些不可培養(yǎng)的微生物。在后續(xù)的實驗中,我們將結(jié)合多種技術(shù)進一步探究低溫乳酸菌的開發(fā)和利用。

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Geneticheterogeneityoflacticacidbacteriaisolatedfromcold-waterfishintestine

HUANGLi-li,LUOBao-long,NIYong-qing,ZHANGYan,ZHOUHong*

(Food College of Shihezi University,Shihezi 832000,China)

The purpose of this study was to analyze the genetic and species heterogeneity of lactic acid bacteria(LAB)from the intestinal tract of cold-water fishes in the Eerqisi river of Xinjiang and Heilong River,which lay the foundation for exploitation resources of lactic acid bacteria. Psychrophilic LAB isolated from cold-water fishes intestinal tract by using MRS,Elliker,M17 culture medium,and measured its optimal growth temperature. According to 16S rRNA gene sequences preliminarily to determine the phylogenetic relationship of psychrophilic LAB,those highly homologous strains was based on rep-PCR fingerprint to further distinguish. It was obtained that 134 psychrophilic LAB from the gastrointestinal tract of cold-water fishes,and the optimum growth temperature was 15～24 ℃. The sequencing results indicated that the selected psychrophilic LAB were divided into seven genus:Lactobacillus,Lactococcus,Enterococcus,Streptococcus,Leuconostoc,Weissella,Carnobacterium7 genus,19 species,respectively,and the dominant bacteria was Lactobacillus. Rep-PCR fingerprint showed that there was a different degree of genetic difference,not only in the same genus of lactic acid bacteria of different species level,but also among various strains of a specie.

cold-water fish intestine flora;psychrophilic lactic acid bacteria;fingerprints

2017-04-05

黃麗麗(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail:huangli00821@sina.com。

*

周紅(1969-),女，本科，高級實驗師，主要從事微生物等方面的研究，E-mail:zhh_food@shzu.cn.com。

國家自然基金項目(31360001)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)22-0082-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.017