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(重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,重慶 404100)

楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性機(jī)理研究

韓林,劉益,羅梅,鄧雪婷,楊人乙,宋友佳

(重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,重慶 404100)

為了揭示楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的機(jī)理,本文利用現(xiàn)代光譜分析方法,結(jié)合原子力顯微鏡和分子模擬對(duì)接技術(shù)對(duì)楊梅素與α-葡萄糖苷酶之間的相互作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性具有很強(qiáng)的抑制作用,IC50值為0.99×10-5mol/L。酶抑制動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用屬于典型的競(jìng)爭(zhēng)型抑制,α-葡萄糖苷酶中存在一個(gè)或一類(lèi)楊梅素的抑制位點(diǎn),同時(shí)楊梅素可與α-葡萄糖苷酶中的熒光發(fā)色團(tuán)發(fā)生相互作用,靜態(tài)淬滅其內(nèi)源性熒光。分子模擬對(duì)接實(shí)驗(yàn)表明,楊梅素可以與TYR158、GLN279、GLU277、ASP215和ASP352氨基酸之間形成氫鍵,改變?chǔ)?葡萄糖苷酶周?chē)奈h(huán)境,使其產(chǎn)生聚集的現(xiàn)象。從而起到抑制作用。

楊梅素,α-葡萄糖苷酶,抑制作用

近年來(lái),2型糖尿病已發(fā)展成為世界上嚴(yán)重危害人類(lèi)身體健康的慢性疾病之一,預(yù)計(jì)到2035年全球糖尿病人群將高達(dá)近6億[1]?？刂撇秃笱鞘穷A(yù)防糖尿病,防止其并發(fā)癥的有效手段,而抑制腸道中碳水化合物消化酶,如α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性,是降低餐后血糖非常有效的方法。目前,市場(chǎng)上有3種藥物可作為α-葡萄糖苷酶抑制劑控制餐后血糖,分別是阿卡波糖、伏格列波糖和米格列酮,但由于這些藥物的生產(chǎn)工藝復(fù)雜并且副作用較大,限制了它們的廣泛使用[1]。因此,從天然產(chǎn)物中發(fā)掘新的毒副作用較小的α-葡萄糖苷酶抑制劑顯得迫在眉睫。

楊梅素,又名楊梅樹(shù)皮素、楊梅黃酮,為3,5,7,3′,4′,5′-六羥基黃酮,廣泛存在于楊梅科、葡萄科、豆科等天然植物中[3]。大量研究表明,楊梅素具有廣泛的藥理活性,如抗炎、抗氧化、抗癌、鎮(zhèn)痛、保肝和抑菌等活性[3],同時(shí)楊梅素還可以降低餐后血糖水平,預(yù)防糖尿病[4]。

體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明,楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶活性具有顯著的抑制作用,可有效控制糖尿病大鼠餐后血糖水平,并且其抑制活性較其它活性物質(zhì)如槲皮素和山奈酚還強(qiáng)[5-6],然而楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究利用現(xiàn)代光譜分析方法,結(jié)合原子力顯微鏡和分子模擬對(duì)接技術(shù),深入闡明楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的機(jī)理,為開(kāi)發(fā)天然α-葡萄糖苷抑制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

α-葡萄糖苷酶(來(lái)自釀酒酵母,26 U/mg)、p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)和阿卡波糖 Sigma公司;楊梅素 純度為98%,上海源葉生物科技有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無(wú)水乙醇等其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

VICTOR X3酶標(biāo)儀、LS55熒光分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elmer公司;AL104電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Multimode-8原子力顯微鏡 美國(guó)布魯克公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 楊梅素溶液的配制 用無(wú)水乙醇將楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品配制成1 mg/mL的母液,然后再用0.1 mol/L pH6.8的PBS緩沖液稀釋至所需濃度后進(jìn)行使用。

1.2.2 楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用 用0.1 mol/L pH6.8的PBS緩沖液配制不同濃度的α-葡萄糖苷酶(3.0×10-7mol·L-1)和pNPG溶液(3.0×10-4mol·L-1)。準(zhǔn)確移取25 μLα-葡萄糖苷酶溶液,分別加入25 μL不同濃度的楊梅素稀釋液(5、4、3、2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0 μg/mL),37 ℃恒溫孵育15 min,再加入50 μL pNPG溶液(0.3 mmol/L),立即置于37 ℃酶標(biāo)儀中在波長(zhǎng)405 nm處每隔30s測(cè)定吸光度,以阿卡波糖作陽(yáng)性對(duì)照,同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)[7]。按如下公式計(jì)算楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性:

抑制率(%)=(ΔA空白-ΔA樣品)/ΔA空白×100

1.2.3 楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的可逆性 準(zhǔn)確移取50 μL不同濃度的α-葡萄糖苷酶溶液(0、0.75、1.5、3.0、6.0×10-7mol/L),分別加入50 μL不同濃度的楊梅素溶液(0、0.39、0.79、1.57、3.14×10-6mol/L),混合均勻后于37 ℃恒溫條件下孵育15 min,加入50 μL 0.3 mmol/L的pNPG溶液,立即置于37 ℃酶標(biāo)儀中于405 nm處每隔1 min測(cè)定吸光度,共測(cè)5次[8]。

1.2.4 楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制動(dòng)力學(xué) 準(zhǔn)確移取50 μLα-葡萄糖苷酶(3.0×10-7mol·L-1)于96孔板中,分別加入50 μL不同濃度的楊梅素稀釋液(0、6.28、9.43、12.57×10-6mol/L),37 ℃恒溫孵育15 min,再分別加入50 μL 不同濃度的pNPG溶液(1.0、2.0、4.0和8.0×10-3mol/L),立即置于37 ℃酶標(biāo)儀中于405 nm處每隔60 s測(cè)定吸光度。通過(guò)Lineweaver-Burk方程計(jì)算楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué),再由如下方程求出二級(jí)曲線,如果該曲線表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,則表明楊梅素在α-葡萄糖苷酶上只存在一個(gè)或一類(lèi)抑制位點(diǎn)[9]。

其中,Ki和Km分別是抑制常數(shù)和米氏常數(shù),[I]為楊梅素濃度,Vmax為最大反應(yīng)速率。

1.2.5 熒光光譜分析 準(zhǔn)確移取2.0 mLα-葡萄糖苷酶(3.0×10-7mol/L)于1 cm熒光池中,對(duì)其熒光光譜進(jìn)行掃描后,逐次加入楊梅素溶液,每次5 μL,調(diào)整其最終濃度分別為0、3.65、7.29、10.94、14.58、18.23、21.88、25.52、29.17、32.81、36.46、40.11和43.75×10-6mol/L,混合均勻后靜置5 min,分別在298、304和310 K溫度下,掃描混合樣品在300～500 nm范圍內(nèi)的熒光光譜(激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm)。激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5.0 nm[10]。并利用Stern-Volmer方程(如下所示)計(jì)算熒光淬滅常數(shù)(Ksv)[11]:

其中,F0和F分別為加入和未加入楊梅素時(shí)α-葡萄糖苷酶的熒光強(qiáng)度;Ksv為淬滅常數(shù);Kq為淬滅速率常數(shù),[Q]為楊梅素的濃度;τ0是熒光的平均時(shí)長(zhǎng),為10-8s。

同時(shí),分別以激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)間距(Δλ)為15和60 nm,狹縫為5.0 nm對(duì)混合樣品進(jìn)行同步熒光光譜掃描。所有熒光吸光度均扣除紫外吸收矯正處理后進(jìn)行分析[12]。

1.2.6 原子力顯微鏡觀察 準(zhǔn)確移取20 μLα-葡萄糖苷酶(6.0×10-7mol/L),加入20 μL 楊梅素稀釋液(6.28×10-6mol/L),置于37 ℃恒溫條件下孵育15 min,然后均勻平鋪于干凈的云母片上,室溫干燥12 h后置于原子力顯微鏡中使用輕敲模式進(jìn)行檢測(cè)[13]。

1.2.7 分子模擬對(duì)接 使用Sybyl 2.0軟件畫(huà)出并優(yōu)化楊梅素的3D結(jié)構(gòu),從PDB中獲取一種高度同源性的α-葡萄糖苷酶晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:3A4A;gi編號(hào):411229)[14]。去掉α-葡萄糖苷酶晶體結(jié)構(gòu)中的所有水分子和配體,添加Gasteiger-Huckel電荷和氫原子,以楊梅素3D結(jié)構(gòu)作為配體,利用Sybyl 2.0軟件中的Surflex-Dock操作進(jìn)行分子模擬對(duì)接。

2 結(jié)果與分析

2.1楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

圖1 楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率

由圖1可知,楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性具有很強(qiáng)的抑制作用,隨著其質(zhì)量濃度的增加,抑制率也快速上升,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)(0.31～1.57×10-5mol/L),楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率高達(dá)90.74%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用,兩者的IC50值分別為0.99×10-5和11.63×10-5mol/L,說(shuō)明楊梅素較阿卡波糖顯示了更好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

2.2楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的可逆性

楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的可逆性如圖2所示,由圖可知不同濃度的楊梅素對(duì)不同濃度α-葡萄糖苷酶的抑制速率都呈線性關(guān)系,隨著楊梅素濃度的增加,線性關(guān)系的斜率逐步下降,同時(shí)所有線性方程都經(jīng)過(guò)原點(diǎn),表明楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用是一個(gè)可逆過(guò)程[15]。

圖2 楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的可逆性

2.3楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制動(dòng)力學(xué)

楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制動(dòng)力學(xué)如圖3所示。由圖3(A)可知,在相同楊梅素濃度條件下,1/v和1/[pNPG]呈線性關(guān)系,隨著楊梅素濃度的增加,這些線性方程的斜率也逐步增加,并且相交于第一象限,說(shuō)明楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用屬于典型的競(jìng)爭(zhēng)型抑制[16]。深入分析發(fā)現(xiàn)各線性方程的斜率對(duì)不同濃度的楊梅素呈線性關(guān)系,表明α-葡萄糖苷酶中只有一個(gè)或一類(lèi)楊梅素的抑制位點(diǎn)[8]。

圖3 楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制動(dòng)力學(xué)

2.4熒光光譜分析

2.4.1 楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶的熒光淬滅作用α-葡萄糖苷酶中含有一些芳香族氨基酸，如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸屬于熒光發(fā)色團(tuán),在280 nm激發(fā)波長(zhǎng)下,可以在340 nm處產(chǎn)生熒光發(fā)射波峰。當(dāng)小分子物質(zhì)與α-葡萄糖苷酶發(fā)生相互作用時(shí),α-葡萄糖苷酶的內(nèi)源性熒光可以被淬滅,這種淬滅作用有兩種類(lèi)型:靜態(tài)淬滅和動(dòng)態(tài)淬滅。通過(guò)研究α-葡萄糖苷酶的內(nèi)源性熒光光譜,可以進(jìn)一步分析其與小分子物質(zhì)之間的相互作用[17-18]。不同溫度條件下,不同濃度楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶內(nèi)源性熒光的淬滅作用所圖4所示。由圖可知,楊梅素本身幾乎沒(méi)有熒光效應(yīng)(圖4中的曲線0),但隨著楊梅素濃度的增加(圖4中1→13),α-葡萄糖苷酶的熒光強(qiáng)度逐漸降低,說(shuō)明楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶的內(nèi)源性熒光產(chǎn)生了淬滅作用。同時(shí),加入楊梅素后,最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)還發(fā)生了紅移。進(jìn)一步分析表明,隨著溫度的升高,淬滅常數(shù)Ksv逐步下降,表現(xiàn)為Stern-Volmer線性關(guān)系的斜率減小(如圖4(D)所示),說(shuō)明楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶內(nèi)源性熒光的淬滅類(lèi)型為靜態(tài)淬滅[19]。

2.4.2 同步熒光光譜 同步熒光光譜是在固定激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)間距(Δλ)的同時(shí)掃描激發(fā)和發(fā)射單色器所得到的光譜。當(dāng)Δλ分別設(shè)為15 nm和60 nm時(shí),所得到的同步熒光光譜可以反映α-葡萄糖苷酶中酪氨酸和色氨酸周?chē)h(huán)境的變化,從而判斷活性物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)的影響[20]。從圖5可以看出,隨著α-葡萄糖苷酶溶液中楊梅素濃度的增加,其熒光強(qiáng)度逐步減少,與上述結(jié)果相似。當(dāng)Δλ=15 nm時(shí),最大熒光強(qiáng)度發(fā)生了微弱的藍(lán)移,而Δλ=60 nm時(shí)則沒(méi)有影響,說(shuō)明楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶中的酪氨酸殘基產(chǎn)生一定影響,而與色氨酸殘基幾乎沒(méi)有發(fā)生相互作用。

圖4 楊梅素與α-葡萄糖苷酶相互作用的熒光光譜圖

圖5 楊梅素與α-葡萄糖苷酶相互作用的同步熒光光譜圖

2.5原子力顯微鏡觀察

原子力顯微鏡是一種研究物質(zhì)表面微觀結(jié)構(gòu)的分析儀器,在許多方面都有應(yīng)用,特別是在研究生物大分子的結(jié)構(gòu)方面。楊梅素與α-葡萄糖苷酶之間相互作用的原子力顯微鏡圖如圖6所示。由圖6(A)可知,在沒(méi)有楊梅素存在的條件下,α-葡萄糖苷酶可均勻的分布于云母基質(zhì)上,表現(xiàn)為圖中白點(diǎn)比較分散,沒(méi)有聚集。當(dāng)與6.28×10-6mol/L的楊梅素作用后,可明顯觀察到α-葡萄糖苷酶之間發(fā)生了聚集的現(xiàn)象,如圖6(B)所示。許多因素可以導(dǎo)致蛋白之間發(fā)生聚集作用,如pH、金屬離子等,同時(shí)蛋白之間疏水作用力的減弱也會(huì)導(dǎo)致其聚集。當(dāng)α-葡萄糖苷酶溶液中加入一定濃度的楊梅素后,由于楊梅素與酶之間的相互作用改變了蛋白酶周?chē)奈h(huán)境,導(dǎo)致酶與酶之間的相互作用平衡被打破,從而發(fā)生聚集現(xiàn)象[21]。

圖6 楊梅素與α-葡萄糖苷酶相互作用的原子力顯微鏡圖

2.6分子模擬對(duì)接

楊梅素與α-葡萄糖苷酶相互作用的分子模擬對(duì)接結(jié)果如圖7所示。由圖可知,楊梅素可以結(jié)合到α-葡萄糖苷酶的活性中心(綠色區(qū)域),從而“占據(jù)”了α-葡萄糖苷酶與其底物結(jié)合進(jìn)行催化作用的位置,影響酶的活性。深入分析表明,楊梅素Ⅰ環(huán)7-OH,Ⅱ環(huán)3-OH和4=O,Ⅲ環(huán)3′,4′和5′-OH分別可以與α-葡萄糖苷酶中的TYR158、GLN279、GLU277、ASP215和ASP352氨基酸之間形成氫鍵,鍵長(zhǎng)分別為2.02、2.07、2.18、2.60、1.97,1.83和2.01 ?,平均鍵長(zhǎng)為2.10 ?,說(shuō)明氫鍵是楊梅素與α-葡萄糖苷酶之間相互影響的主要作用力,同時(shí)這些形成氫鍵結(jié)合的位點(diǎn)也是α-葡萄糖苷酶發(fā)揮催化活性的關(guān)鍵氨基酸[22]。黃酮類(lèi)化合物中,B環(huán)上羥基的數(shù)量直接影響該化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用[23]。楊梅素B環(huán)上存在三個(gè)羥基,與α-葡萄糖苷酶中的氨基酸殘基形成了三個(gè)氫鍵,同時(shí)其C環(huán)和A環(huán)上的羥基也與氨基酸殘基形成了三個(gè)氫鍵,說(shuō)明羥基在楊梅素與α-葡萄糖苷酶之間的相互作用中扮演著重要的角色。

圖7 楊梅素與α-葡萄糖苷酶相互作用的分子模擬對(duì)接圖

3 結(jié)論

本文利用現(xiàn)代光譜分析方法,研究發(fā)現(xiàn)楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性具有很強(qiáng)的抑制作用,在一定實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)抑制率可達(dá)90.74%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陽(yáng)性對(duì)照藥物阿卡波糖,其IC50值為0.99×10-5mol/L,并且這種抑制作用屬于可逆性抑制。抑制動(dòng)力學(xué)表明楊梅素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制屬于典型的競(jìng)爭(zhēng)型抑制,同時(shí)α-葡萄糖苷酶中只有一個(gè)或一類(lèi)楊梅素的抑制位點(diǎn)。熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,楊梅素可作用于α-葡萄糖苷酶中的熒光發(fā)色團(tuán),如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等,靜態(tài)淬滅α-葡萄糖苷酶的內(nèi)源性熒光,改變這些基團(tuán)周?chē)奈h(huán)境,從而影響α-葡萄糖苷酶的活性。通過(guò)原子力顯微鏡的檢測(cè),我們更直接的觀察到了α-葡萄糖苷酶在未加和加入楊梅素后形態(tài)的顯著變化,進(jìn)一步證實(shí)了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并利用分子模擬對(duì)接技術(shù)更深入闡明了楊梅素主要與α-葡萄糖苷酶中的TYR158、GLN279、GLU277、ASP215和ASP352氨基酸之間通過(guò)氫鍵相互作用直接抑制其活性。

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Theinhibitionactivityandmechanismsofmyricetinonα-glucosidase

HANLin,LIUYi,LUOMei,DENGXue-ting,YANGRen-yi,SONGYou-jia

(College of Life Science and Engineering,Chongqing Three Gorges University,Chongqing 404100,China)

In order to further research the inhibiting mechanisms of myricetin on the activity ofα-glucosidase,different modern spectral analysis methods were used in this paper,combined with atomic force microscope(AFM)and molecular docking,to investigate the interactions between myricetin andα-glucosidase. The results indicated that myricetin showed strong inhibition function on the activity ofα-glucosidase and the value of IC50was 0.99×10-5mol/L. The kinetic study revealed that the inhibiting effect between myricetin andα-glucosidase belong to competitive inhibition,and there was a single inhibition site onα-glucosidase,moreover the fluorescence ofα-glucosidase was quenched by myricetin through a static quenching mechanism. The molecular docking showed that myricetin could form hydrogen bonds with the amino acids of TYR158,GLN279,GLU277,ASP215 and ASP352 to change the micro-environments ofα-glucosidase,which leaded a clustering phenomenon and then had the inhibition activity.

myricetin;α-glucosidase;inhibition activity

2017-03-16

韓林(1985-)，男，碩士，講師，研究方向：果蔬深加工與綜合利用,E-mail：hanlin730@163.com。

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(KJ1601010)；重慶三峽學(xué)院青年項(xiàng)目(15QN10)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)22-0051-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.011