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(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)

蝦青素對(duì)秀麗隱桿線蟲衰老的改善作用及機(jī)制研究

羅婧,沈紫龍,任建武*

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)

通過壽命實(shí)驗(yàn)、氧化應(yīng)激、熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)研究蝦青素(Astaxanthin)對(duì)秀麗隱桿線蟲衰老和急性應(yīng)激效應(yīng)的改善作用并探究其作用機(jī)制。秀麗隱桿線蟲分為對(duì)照組和蝦青素處理組(0.8、1.2和1.6 mmol/L),首先研究不同濃度蝦青素對(duì)野生型線蟲壽命的影響,通過平均與最大壽命確定作用的最佳劑量;選用最佳劑量的蝦青素作用于野生型和突變株線蟲,采用熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)研究其可能機(jī)制。結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,采用1.2 mmol/L蝦青素飼喂秀麗隱桿線蟲,野生型線蟲平均壽命延長(zhǎng)了41.79%(p<0.01),最大壽命延長(zhǎng)了32.72%(p<0.01)。熱應(yīng)激及氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中,采用1.2 mmol/L蝦青素飼喂秀麗隱桿線蟲,野生型線蟲平均生存時(shí)間分別延長(zhǎng)了22.54%和24.23%(p<0.01)。1.2 mmol/L蝦青素可顯著提高sir-2.1突變株線蟲的存活時(shí)間,但對(duì)daf-2、daf-16和eat-2突變株線蟲均無顯著影響。綜上所述,濃度為1.2 mmol/L的蝦青素可顯著延長(zhǎng)野生型線蟲的平均壽命和最大壽命,并顯著延長(zhǎng)其在氧化應(yīng)激及熱應(yīng)激條件下的平均生存時(shí)間和最大生存時(shí)間。蝦青素延長(zhǎng)線蟲壽命的功效可能是通過提高線蟲的在熱及氧化惡劣環(huán)境下的耐受能力而實(shí)現(xiàn)的,其作用機(jī)制可能與胰島素信號(hào)通路及能量限制通路有關(guān)。

蝦青素,秀麗隱桿線蟲,衰老

衰老是一種普遍存在的、復(fù)雜多變的生物學(xué)過程。伴隨衰老進(jìn)程,細(xì)胞和組織發(fā)生多種病理變化,極易引發(fā)阿爾茲海默病、帕金森病、心腦血管病等衰老相關(guān)疾病[1-2],給家庭和社會(huì)造成了巨大的負(fù)擔(dān)。我國(guó)人口老齡化趨勢(shì)逐漸加劇,各種老年性疾病問題逐漸凸顯,目前亟需開展衰老相關(guān)的研究工作,尋求抗衰老的策略。

蝦青素(Astaxanthin)是一種類胡蘿卜素,廣泛存在于蝦蟹外殼及雨生紅球藻中[3-4]。研究證實(shí),蝦青素具有抗氧化、增強(qiáng)人體免疫力、抗腫瘤、防治糖尿病、抗炎、保護(hù)心腦血管、維護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種活性功能[5-8]。目前,有關(guān)蝦青素延緩衰老的研究備受關(guān)注,蝦青素抗衰老的作用機(jī)制需進(jìn)一步明確。

因具有繁殖快、易培養(yǎng)、生命周期短、基因調(diào)控簡(jiǎn)單、進(jìn)化高度保守等特點(diǎn)[9],秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)被用作一種模式生物,廣泛用于衰老、神經(jīng)發(fā)育毒性和免疫等方面的研究[10-11]。線蟲具有與哺乳動(dòng)物同源的抗脅迫機(jī)制和相關(guān)基因,被廣泛應(yīng)用于抗衰老物質(zhì)的篩選和抗衰老分子機(jī)制的研究。近年來,通過遺傳篩選和自然突變等方法,人們發(fā)現(xiàn)了多種影響衰老的基因和信號(hào)傳導(dǎo)通路。胰島素信號(hào)通路(insulin/IGF-1signaling pathway)是已知的調(diào)控生物體發(fā)育和衰老最重要的信號(hào)通路,具有高度保守性[12];熱量限制(Caloric Restriction,CR)通路可通過熱量限制,穩(wěn)定地延長(zhǎng)許多生物體壽命;飲食限制(Diet Restriction,DR)通路可導(dǎo)致線蟲長(zhǎng)壽,研究發(fā)現(xiàn)對(duì)線蟲進(jìn)行間歇性禁食,能使線蟲壽命延長(zhǎng)50%以上[13]?，F(xiàn)有研究大多集中于單一信號(hào)通路探索,但藥物作用于線蟲可能通過多種通路聯(lián)合作用,共同調(diào)節(jié)線蟲的生理功能。

本研究以秀麗隱桿線蟲為模式生物,評(píng)價(jià)蝦青素延緩線蟲衰老的作用并進(jìn)一步采用突變株線蟲初步探討其功效的可能機(jī)制,以期為功能性食品及保健品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

蝦青素 上海源葉生物科技有限公司;野生型(wild-type)線蟲品系N2、突變株DR1572daf-2(el368)、GR1307daf-16(mgDf50)、VC199sir-2.1(ok434)、DA1116eat-2(ad1116)、線蟲的食物大腸桿菌(EscherichiacoliOP50) 均由北京市疾病預(yù)防控制中心提供;二甲基亞砜、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸鎂、氯化鈣、膽固醇、無水乙醇、次氯酸鈉(4%)、氫氧化鈉、75%醫(yī)用消毒酒精 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;瓊脂粉、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物 BD公司;百草枯(甲基紫精)、2′-Deoxy-5-fluorouridine,Flourridine(5-氟脫氧尿苷,FuDR) 美國(guó)SIGMA公司。

H/T16MM型臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司;5930型高速離心機(jī) 日本三洋公司;HP250S型生化培養(yǎng)箱 武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司,Vartev Gemie2型漩渦振蕩儀 美國(guó)Vortek公司;ZWY-211B型溫培養(yǎng)振蕩儀 上海智城分析儀器制造有限公司;SZ51型體式顯微鏡 日本OLYMPUS公司;HPG-280H型人工氣候箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 線蟲的培養(yǎng) 將雌雄同體線蟲飼養(yǎng)于涂布大腸桿菌OP50(E.coliOP50)的線蟲標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(Nematode growth medium,NGM)上,培養(yǎng)溫度20 ℃,觀察線蟲生長(zhǎng)情況,定期將線蟲轉(zhuǎn)至新的涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基中。

1.2.2 秀麗隱桿線蟲的同步化 Bleach液漂白法:取出處于產(chǎn)卵高峰期的線蟲NGM板,切除一小塊用于傳代(或挑取傳代),將剩余的腹內(nèi)含卵線蟲用1～2 mL的S-basal緩沖液沖洗下來,至15 mL離心管中,靜置2 min,待線蟲沉入底部,吸取上層清液,加入5～7 mL線蟲裂解液Bleach液,漩渦振蕩儀振蕩裂解5～8 min,20 ℃離心3 min(3000 r/min),用S-basal緩沖液清洗3次,最后加入3～5 mL S-basal液,放置于20 ℃恒溫?fù)u床(100 r/min)培養(yǎng)12 h,取出后可放置于15 ℃恒溫箱中保存一周的時(shí)間,便于實(shí)驗(yàn)的處理以及消除個(gè)體不同差異帶來的實(shí)驗(yàn)誤差。

1.2.3 線蟲壽命實(shí)驗(yàn) 將蝦青素用0.2%二甲基亞砜溶液溶解,配制成8 mmol/L的貯存液,細(xì)菌過濾器過濾除菌,備用。實(shí)驗(yàn)設(shè)定無蝦青素對(duì)照組和蝦青素低、中、高劑量組。將蝦青素貯存液加入到含F(xiàn)uDR(終濃度為50 mg/mL)的NGM培養(yǎng)基中(抑制線蟲后代生長(zhǎng),保證同步化),使其終濃度分別為0.8、1.2和1.6 mmol/L,觀察在添加蝦青素的NGM培養(yǎng)基中野生型線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育情況,每組挑取60只young adult時(shí)期線蟲,每組3個(gè)平行,每個(gè)平行20只線蟲。每天在顯微鏡下觀察線蟲,記錄線蟲生存、死亡以及爬出培養(yǎng)皿壁自然丟失的線蟲的數(shù)目。死亡判斷標(biāo)準(zhǔn):對(duì)機(jī)械刺激無任何反應(yīng)即視為死亡。

1.2.4 急性熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 將線蟲進(jìn)行同步化處理后置于20 ℃培養(yǎng),每2 d將線蟲轉(zhuǎn)移到新的含有1.2 mmol/L蝦青素的NGM板中,在成蟲期的第5 d,將線蟲轉(zhuǎn)至35 ℃空白NGM板中進(jìn)行培養(yǎng),每2 h計(jì)數(shù)一次至全部死亡,計(jì)數(shù)線蟲死亡、存活的數(shù)目,計(jì)算線蟲在35 ℃時(shí)的熱應(yīng)激存活率(在高溫條件下,爬培養(yǎng)皿壁上和鉆入培養(yǎng)基中的線蟲不計(jì)入統(tǒng)計(jì)的總數(shù))。每組3個(gè)平行,每個(gè)平行20只線蟲。

1.2.5 急性氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 將線蟲進(jìn)行同步化處理后置于20 ℃培養(yǎng),每2 d將線蟲轉(zhuǎn)移到新的含有蝦青素(終濃度1.2 mmol/L)的NGM板中。在成蟲期的第5 d,將線蟲轉(zhuǎn)至20 ℃ 24孔板中進(jìn)行培養(yǎng),每2 h計(jì)數(shù)一次至全部死亡。24孔板中每孔加入200 μL百草枯溶液(300 mmol/L,溶解于S-media溶液),每四個(gè)孔為一組,每孔15只線蟲。統(tǒng)計(jì)線蟲在氧化應(yīng)激條件下的存活率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用ANOVA分析,“*”表示p<0.05,“**”表示p<0.01，兩者均為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。平均值為具有統(tǒng)計(jì)意義的線蟲整體存活時(shí)間的平均值,最大值為抵抗脅迫能力最強(qiáng)的整體的10%存活時(shí)間的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1不同濃度蝦青素對(duì)野生型線蟲壽命的影響

如圖1所示,與對(duì)照組相比,采用終濃度分別為0.8、1.2和1.6 mmol/L的蝦青素飼喂后,線蟲生存曲線右移,其中當(dāng)濃度為1.2 mmol/L時(shí),蝦青素延長(zhǎng)線蟲壽命效果最顯著。

表1 不同濃度蝦青素對(duì)線蟲壽命的影響

圖1 不同濃度蝦青素對(duì)線蟲存活率的影響

注:與對(duì)照組相比,*：p<0.05,**：p<0.01;表2、表3同。

如表1所示,對(duì)照組線蟲的平均壽命為15.7 d,最大壽命為22.0 d。采用終濃度分別為0.8、1.2和1.6 mmol/L的蝦青素飼喂后,線蟲的平均壽命和最大壽命均顯著延長(zhǎng)(p<0.01),且當(dāng)處理濃度為1.2 mmol/L時(shí)效果最為顯著,平均壽命和最大壽命比對(duì)照組分別提高41.79%和32.72%(p<0.01)。

2.2蝦青素對(duì)野生型及突變株線蟲熱應(yīng)激耐受能力的影響

在成蟲的第5 d,將線蟲轉(zhuǎn)至35 ℃空白NGM板中培養(yǎng),飼喂蝦青素組野生型線蟲N2,sir-2.1的生存曲線明顯右移,突變株daf-2、daf-16和eat-2的生存曲線無明顯變化(圖2)。

表2 蝦青素對(duì)線蟲熱應(yīng)激生存時(shí)間的影響

圖2 蝦青素對(duì)線蟲熱應(yīng)激存活率的影響

如表2所示,對(duì)照組野生型線蟲N2的平均生存時(shí)間和最大生存時(shí)間分別為20.0 h和25.3 h。與對(duì)照組相比,飼喂1.2 mmol/L蝦青素均能顯著延長(zhǎng)線蟲的平均生存時(shí)間和最大生存時(shí)間,平均生存時(shí)間和最大生存時(shí)間分別提高了22.54%和23.68%(p<0.01)。蝦青素能夠提高sir-2.1的平均生存時(shí)間(p<0.05),但并不能提高突變株daf-2、daf-16和eat-2的生存時(shí)間,表明蝦青素提高線蟲的耐熱能力與daf-2、daf-16和eat-2基因有關(guān)。

2.3蝦青素對(duì)野生型及突變株線蟲氧化應(yīng)激耐受能力的影響

在成蟲的第5 d,將線蟲置于百草枯誘導(dǎo)的氧化脅迫條件下,飼喂蝦青素組野生型線蟲N2、sir-2.1的生存曲線明顯右移,突變株daf-2、daf-16和eat-2生存曲線無明顯變化(圖3)。

圖3 蝦青素對(duì)線蟲氧化應(yīng)激存活率的影響

如表3所示,在百草枯誘導(dǎo)的氧化脅迫條件下,飼喂1.2 mmol/L蝦青素能顯著延長(zhǎng)野生型線蟲N2的平均生存時(shí)間和最大生存時(shí)間,平均生存時(shí)間比對(duì)照組提高24.23%(p<0.01),最大生存時(shí)間比對(duì)照組提高31.25%(p<0.01),且提高sir-2.1的生存時(shí)間(p<0.01),但并不能提高突變株daf-2、daf-16、eat-2的生存時(shí)間,這說明蝦青素的抗氧化能力與daf-2、daf-16、eat-2基因有關(guān)。由此可見,在氧化應(yīng)激脅迫條件下蝦青素能夠很好地保護(hù)秀麗隱桿線蟲,緩解極端氧化應(yīng)激對(duì)線蟲的損傷。

表3 蝦青素對(duì)突變株線蟲氧化應(yīng)激生存時(shí)間的影響

3 討論與結(jié)論

生命周期與機(jī)體對(duì)外界的抵抗脅迫能力有關(guān)[14]。已有研究表明,線蟲壽命與其抗脅迫能力水平有關(guān)[15],有文獻(xiàn)報(bào)道,淫羊藿總黃酮、原花青素B2、蜜環(huán)菌菌索多糖等能夠延長(zhǎng)秀麗線蟲壽命,其作用機(jī)制可能與其增強(qiáng)線蟲應(yīng)激能力有關(guān)[16-18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蝦青素能顯著提高野生型線蟲的熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激能力,其壽命的延長(zhǎng)可能通過提高抗脅迫能力來實(shí)現(xiàn)。

胰島素信號(hào)通路是機(jī)體重要的調(diào)控通路之一,對(duì)發(fā)育、代謝、衰老的調(diào)節(jié)均起到關(guān)鍵作用。研究表明:Daf-2與胞外類似胰島素配體結(jié)合后導(dǎo)致PI3K催化亞基同源物AGE-1活化,后者產(chǎn)生第二信使進(jìn)一步激活下游AKT/PKB同源物絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT-1/AKT-2,磷酸化轉(zhuǎn)錄因子Daf-16,從而抑制其進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能[19]。Daf-16可以影響代謝調(diào)節(jié)、抗脅迫基因的表達(dá),進(jìn)而延長(zhǎng)壽命[20]。蝦青素對(duì)daf-2、daf-16突變體應(yīng)激能力的改變無顯著差異,表明其可能通過調(diào)節(jié)由daf-2、daf-16等基因參與的胰島素信號(hào)通路來發(fā)揮作用。保持營(yíng)養(yǎng)充足的情況下,減少能量攝入能延長(zhǎng)生物體壽命,這是目前能夠確定的延長(zhǎng)生物體壽命的理論,這一理論在線蟲模型中得到充分體現(xiàn)。因神經(jīng)活肌肉受損而進(jìn)食缺陷的突變體(eat-2)可以充分驗(yàn)證蝦青素通過eat-2基因,能量限制通路起作用,而與熱量限制無關(guān)(sir-2.1)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,一定濃度范圍內(nèi)蝦青素可以延緩線蟲衰老,添加濃度為1.2 mmol/L時(shí)效果最為顯著,平均壽命提高41.79%,并能提高線蟲的熱應(yīng)激能力22.54%及氧化應(yīng)激能力24.23%。蝦青素可能通過提高線蟲在熱及氧化應(yīng)激條件下的耐受性來延長(zhǎng)線蟲壽命,其作用機(jī)制可能與胰島素信號(hào)通路和能量限制通路有關(guān)。

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TheagingimprovementeffectsandmechanismofastaxanthinonCaenorhabditiselegans

LUOJing,SHENZi-long,RENJian-wu*

(College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

In this study,the mechanism of the aging improvement of astaxanthin onCaenorhabditiseleganswas studied by lifespan extension analysis,oxidative stress,and heat stress analyses. Astaxanthin-treated groups(0.8,1.2,and 1.6 mmol/L)were compared to the control group to explore the anti-aging effect of different concentrations in wild-type nematode and identify the optimal dose according to mean and maximum lifespan extension. The optimal dose of astaxanthin was 1.2 mmol/L,at which dose astaxanthin prolonged mean lifespan of wild type nematode by 41.79%(p<0.01)and increased maximum lifespan by 32.72%(p<0.01).The possible mechanisms of astaxanthin’s aging effects were further studied using the 1.2 mmol/L treatment to test its impact on resistance to heat and oxidative stress. The mean survival times of astaxanthin-treated wild type nematode after oxidative and heat stress were increased by 22.54% and 24.23%(p<0.01),respectively. In oxidative stress and heat stress experiments,1.2 mmol/L astaxanthin could significantly increase the survival time of thesir-2.1 mutant nematodes,but had no significant effect ondaf-2,daf-16,oreat-2 mutants. The above results suggested that astaxanthin can prolong the lifespan of nematodes by increasing stress tolerance and its mechanism may be related to the insulin signaling and diet-restriction pathways.

astaxanthin;Caenorhabditiselegans;aging

2017-04-25

羅婧(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，E-mail：18813072633@163.com。

*

任建武(1967-)，男，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，E-mail：jianwur@sina.com。

TS201.1

A

1002-0306(2017)22-0022-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.005