張瀟丫,姜國良*,樊喜英

(中國海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院,山東 青島 266003)

響應(yīng)面法優(yōu)化南極大磷蝦抗菌肽提取工藝

張瀟丫,姜國良*,樊喜英

(中國海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院,山東 青島 266003)

以南極大磷蝦為原材料,提取抗菌肽,在單因素試驗基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化抗菌肽提取工藝條件。結(jié)果表明,抗菌肽最佳提取工藝條件確定為硫酸濃度0.28 mol/L、硫酸用量3倍、乙醇用量2倍、提取時間0.5 h,在此工藝條件下,得到南極大磷蝦抗菌肽的得率為1.21%,比優(yōu)化前提高了0.3%。表明響應(yīng)面法南極大磷蝦抗菌肽的提取工藝的優(yōu)化是可行的。

南極大磷蝦;抗菌肽;響應(yīng)面法;工藝優(yōu)化

抗菌肽是一類具有抑菌生物活性的多肽物質(zhì)[1],廣泛存在于多種動植物體內(nèi)(如兩棲動物、昆蟲、鳥類、魚類、哺乳類以及植物等),具有水溶性好、熱穩(wěn)定性好、抗菌譜廣泛、抗菌機理獨特不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點,甚至可以特異性抑制腫瘤細胞[2]。與致病菌對抗生素逐漸產(chǎn)生耐藥性相比,抗菌肽的耙菌株不易產(chǎn)生抗藥性突變,未來有可能替代抗生素成為新的抗菌藥物[3]。1980年,瑞典科學(xué)家BOMAN從北美天蠶蛹(Hyalophora cecropia)的免疫血淋巴中提取出P9A抗菌肽和P9B抗菌肽,這是人類第一次提取的天然抗菌肽[4];1988年科研人員在鱟血細胞里發(fā)現(xiàn)鱟源抗菌肽;2002年NILSEN等從扇貝的內(nèi)臟液中提取出抗菌肽并命名為扇貝素。

南極大磷蝦(Euphausiasuperba)是目前地球上最為豐富的生物資源之一,它是適冷性生物且以群集方式生活,生物密度可達到每立方米10000～30000只,具有巨大的商業(yè)潛力[5]。目前對于南極大磷蝦的研究集中于消化系統(tǒng)(酶)和磷蝦油等方面[6],趙玲等[7]采用濾紙片法篩選南極磷蝦酶解多肽及各分級組分,并研究了其對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、四聯(lián)微球菌、大腸桿菌、啤酒酵母和副溶血弧菌6種菌的抑菌活性,得知酶解多肽對金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌活性。本研究以南極大磷蝦為實驗材料,考察了稀硫酸濃度、稀硫酸用量及乙醇用量對抗菌肽得率的影響,在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法對抗菌肽提取工藝進行優(yōu)化,以期為南極大磷蝦的后續(xù)研究提供參考和依據(jù)[8-10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極大磷蝦(質(zhì)量約1.0 g,身體長度約3 cm):由青島市遠洋捕撈有限公司提供,于-80℃冷凍保存。

乙醇、濃硫酸、考馬斯亮藍G250、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉、濃磷酸、丙酮、乙醚(均為分析純):上海埃彼化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

PRO-EQS維仕美谷蔬調(diào)理攪拌機:上海維仕美電器有限公司;CF16RXⅡ日立多用途離心機:日立工機有限公司;BS110S型精密電子天平:德國Sartorius公司;YP2002N電子天平:上海菁海儀器有限公司;WFJ2000可見分光光度計:尤尼柯(上海)儀器有限公司;HF Super NW系列超純水系統(tǒng):上海力康分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 南極大磷蝦中抗菌肽的提取

將冷凍的南極大磷蝦解凍后,瀝干水分備用。

稱取100 g解凍瀝干后的南極大磷蝦,加入300 mL pH值為8的75 mmol/L NaCl緩沖液(緩沖液加入0.5 mmol/L苯甲基磺酸氟和25 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉),置于攪拌機中勻漿4次,每次20s。取數(shù)層紗布疊加對其進行過濾,然后5 000 r/min、4℃離心10 min,棄去上清液,所得沉淀加超純水重復(fù)溶解,再進行8000r/min、4℃離心10min取沉淀[11-13]。取少量超純水溶解沉淀,加入一定體積倍數(shù)的稀硫酸溶液提取一定時間,于10 000 r/min、4℃離心20 min,取上清液進行過濾,剩余的沉淀重復(fù)離心幾次,取其上清液過濾并將濾液合并,進行減壓蒸餾濃縮。所得溶液再加入一定體積倍數(shù)的乙醇溶液(體積分數(shù)為95%),置于冰箱4℃過夜。于5 000 r/min、4℃離心10 min,所得沉淀用10 mL丙酮洗滌2次,再用10 mL乙醚洗滌1次,待有機溶劑揮發(fā)干凈后可得到固體抗菌肽粗提物,置于-20℃保存待用[14]。

1.3.2 單因素試驗

選取稀硫酸濃度(0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5 mol/L)、稀硫酸用量(1倍、2倍、3倍、4倍、5倍)、乙醇用量(0.5倍、1.0倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍)、提取時間(0.5min、1.0min、1.5 min、2.0 min、2.5 min)作為考察因素,以抗菌肽得率為評價指標,分別對其進行單因素試驗,研究其對抗菌肽得率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗優(yōu)化

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上,選取硫酸濃度(A)、稀硫酸用量(B)、乙醇用量(C)為因素變量[15],以抗菌肽得率(Y)為評價指標,設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗,利用Design Expert 10.03軟件進行分析。響應(yīng)面試驗優(yōu)化因素與水平見表1。

表1 抗菌肽的提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extraction conditions optimization of antimicrobial peptides

1.3.4 蛋白質(zhì)含量測定及抗菌肽得率計算

蛋白質(zhì)(多肽)含量測定利用考馬斯亮藍G250染色法。抗菌肽粗提物得率計算公式如下:

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 稀硫酸濃度對抗菌肽得率的影響

由圖1可知,隨著稀硫酸濃度的增加,南極大磷蝦抗菌肽的得率呈先升高再降低后又開始升高的趨勢。當稀硫酸濃度為0.3 mol/L時,抗菌肽得率達到最高值,為0.97%;繼續(xù)增加稀硫酸濃度,南極大磷蝦抗菌肽的得率開始下降。當稀硫酸濃度較低時,蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸的結(jié)合鍵斷裂不完全[16];而稀硫酸濃度較高時蛋白質(zhì)被部分水解。因此稀硫酸濃度選擇0.3 mol/L比較合適。

圖1 硫酸濃度對抗菌肽得率的影響Fig.1 Effect of sulfuric acid concentration on the yield of antimicrobial peptides

2.1.2 稀硫酸用量對抗菌肽得率的影響

由圖2可知,隨著稀硫酸用量的增加,南極大磷蝦抗菌肽得率呈先升高后降低的趨勢。當稀硫酸用量為3倍時,抗菌肽時得率為0.99%,達到最高值;繼續(xù)增加稀硫酸的用量到4～5倍時,抗菌肽得率略降低后又升高,表明稀硫酸用量的繼續(xù)增加對抗菌肽得率有輕微負面影響。分析原因可能是稀硫酸用量的增加使得蛋白質(zhì)與稀硫酸接觸面積增加,而稀硫酸用量過高會使得雜質(zhì)溶于提取液[17]。因此,選擇稀硫酸用量3倍為宜。

圖2 硫酸用量對抗菌肽得率的影響Fig.2 Effect of sulfuric acid addition on the yield of antimicrobial peptide

2.1.3 乙醇用量對抗菌肽得率的影響

由圖3可知,隨著乙醇用量的增加,南極大磷蝦抗菌肽得率基本呈升高趨勢。當乙醇用量為2.5倍時,抗菌肽時得率為0.93%,達到最高值。繼續(xù)增加乙醇用量,抗菌肽得率趨于平穩(wěn)。因此,選擇乙醇用量2倍為宜。

圖3 乙醇用量對抗菌肽得率的影響Fig.3 Effect of ethanol addition on the yield of antimicrobial peptides

2.1.4 提取時間對抗菌肽得率的影響

由圖4可知,隨著提取時間的增加,南極大磷蝦抗菌肽得率呈先升高后降低的趨勢。提取時間為1.0 h時得率最高,為0.97%;當提取時間＞1.0 h,南極大磷蝦抗菌肽得率逐漸降低,因此提取時間為1 h比較適合。

圖4 提取時間對抗菌肽得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of antimicrobial peptides

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以稀硫酸濃度(A)、稀硫酸用量(B)、乙醇用量(C)作為自變量,抗菌肽得率(Y)為響應(yīng)值,進行17次響應(yīng)面分析試驗優(yōu)化南極大磷蝦抗菌肽的提取條件,響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果如表2所示,回歸模型方差分析見表3。

由表3可知,該模型的P值＜0.000 1,模型整體達到極顯著水平。失擬項P值0.110 6不顯著,表示該模型與純誤差關(guān)聯(lián)不顯著,F=3.91表明該模型合理。決定系數(shù)R2=0.990 7,擬合度較好,表明不到1%的響應(yīng)面變異無法利用該模型解釋;調(diào)整后的決定系數(shù)R2adj=0.9787,預(yù)測擬合度R2pred=0.8849,兩者具有一致性。因此可得該響應(yīng)面試驗是可行的,對于本實驗結(jié)果能夠較好描述。A、AC、A2、B2、C2項達到極顯著水平(P＜0.000 1),且對于抗菌肽得率的影響順序為A＞B＞C。

表2 抗菌肽提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments for extraction conditions optimization of antimicrobial peptide

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸擬合得到二次多項回歸方程為:

利用Design Expert 10.03軟件分別繪制3個因素交互作用對抗菌肽得率影響的響應(yīng)面圖,結(jié)果見圖5。

由圖5可知,抗菌肽得率隨著稀硫酸濃度和稀硫酸用量倍數(shù)的升高都表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢;但是可以明顯看出稀硫酸濃度的影響更為顯著?？咕牡寐孰S著稀硫酸濃度和乙醇用量的升高都表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢;但是可以明顯看出稀硫酸濃度的影響更為顯著?？咕牡寐孰S著稀硫酸用量和乙醇用量的增加都表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢;但是可以明顯看出稀硫酸用量的影響更為顯著。

圖5 硫酸濃度、硫酸用量和乙醇用量交互作用對抗菌肽得率影響的響應(yīng)面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between sulfuric acid concentration,sulfuric acid addition and ethanol addition on the yield of antimicrobial peptides

對二次多項回歸方程求解,得到南極大磷蝦抗菌肽最佳提取條件為稀硫酸濃度0.283 mol/L,稀硫酸用量3.04倍,乙醇用量2.01倍,抗菌肽的理論得率為1.22%。為便于試驗進行,將提取條件修正為稀硫酸濃度0.28 mol/L,稀硫酸用量3.0倍,乙醇用量2.0倍。進行三次平行試驗得到的抗菌肽得率平均值為1.21%,與理論值極為接近,所以可以確認利用響應(yīng)面法優(yōu)化抗菌肽提取工藝是可行的。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上,對南極大磷蝦抗菌肽的提取條件進行響應(yīng)面優(yōu)化。結(jié)果表明,南極大磷蝦抗菌肽的最優(yōu)提取條件為稀硫酸濃度0.28 mol/L,稀硫酸用量3.0倍,乙醇用量2.0倍,在此條件下,抗菌肽得率為1.21%。本試驗的研究結(jié)果為其后的后續(xù)研究和商業(yè)化提供理論依據(jù)和支撐。

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ZHANG Xiaoya,JIANG Guoliang*,FAN Xiying
(College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Q512

0254-5071(2017)11-0084-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.018

2017-04-14

張瀟丫(1992-),女,碩士研究生,研究方向為生物化學(xué)。

*通訊作者:姜國良(1963-),男,教授,本科,研究方向為海洋生物材料與活性物質(zhì)方面的研究。